Relatórios de Microbiologia Prática.docx

FAHESA – FAHESA – Faculdade de Ciências Humanas, Econômicas e da Saúde de Araguaína ITPAC – ITPAC – Instituto Tocantinense Presidente Antônio Carlos Odontologia

Relatórios de Aulas Práticas de Microbiologia

Laís Cardoso Mainara Defavari Luciana Nogueira Layza Tosta Jucimária Lima Geraldo Pereira

 Araguaína/TO Junho/2012

Laís Cardoso Mainara Defavari Luciana Nogueira Layza Tosta Jucimária Lima Geraldo Pereira

Relatórios de Aulas Práticas de Microbiologia

 Araguaína/TO Junho/2012

Laís Cardoso Mainara Defavari Luciana Nogueira Layza Tosta Jucimária Lima Geraldo Pereira

Relatórios de Aulas Práticas de Microbiologia

 Araguaína/TO Junho/2012

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO__________________ INTRODUÇÃO_____________________________ ______________________ _______________________4 ____________4 2. NORMAS DE BIOSSEGURANÇA PARA AULAS PRÁTICAS EM MICROBIOLOGIA _________________________ ______________________________________ _________________________ _____________5 _5 3. ABUNDÂNCIA E DIVERSIDADE MICROBIANA EM AMOSTRAS  AMBIENTAIS_____________________  AMBIENTAIS_________________________________ ______________________ ______________________10 ____________10 4. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DA MICROBIOTA MICROBIOTA HUMANA ______________13 ______________13 5. COLORAÇÃO DE GRAM___________ GRAM__________________________ __________________________ _________________19 ______19 6. TÉCNICA DE DILUIÇÃO DILUIÇÃO SERIADA E CONTAGEM CONTAGEM DE COLÔNIAS _________24 _________24 7. ANTIBIOGRAMA __________________ ______________________________ _________________________ ___________________26 ______26 8. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE FUNGOS____________________29 FUNGOS____________________29 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS________ BIBLIOGRÁFICAS______________________ ________________________ _____________34 ___34

Introdução

Este material apresenta a relação de trabalhos e pesquisas em prática laboratorial de Microbiologia. Correlacionando com a literatura aquilo que foi praticado em aula. Desde biossegurança e métodos laboratoriais, a tipos de coloração para observação microscópica, características morfológicas de fungos e bactérias, culturas de microrganismos do ser humano, etc.  A pesquisa foi baseada na observação de resultados dos procedimentos executados pelos alunos, logo, esses resultados podem ser falhos ou incoerentes, devido à não padronização de métodos práticos

ou

erros

na

execução

de

procedimentos. No entanto, à apresentação e prática de tais métodos acrescenta conhecimento ao aluno.

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1. Normas de Biossegurança para aulas práticas em Microbiologia

O laboratório de Microbiologia é um ambiente de estudo e pesquisa onde há o manuseio de diferentes tipos de microrganismos, sendo estes patogênicos ou não,o que pode oferecer um grau de risco variável para àqueles que estão trabalhando nesse ambiente,seja diretamente na pesquisa, ou auxiliando na organização e higienização.Há relatos de casos de diferentes graus de contaminação a partir do manuseio de microrganismos patogênicos em laboratório microbiológico, seja por  descuido em lavagem das mãos ou hábitos de levar objetos à boca, ou mesmo pela falta de EPI (Equipamentos de Proteção Individual) adequado e ocorrência então de aspiração do patógeno, ou contato com a mucosa da conjuntiva se este tiver  disperso no ambiente.Deve-se ter cuidado com a assepsia, quando se trabalha com microrganismos para evitar a própria contaminação com algum patógeno, a contaminação do meio de cultura com microbiota normal,alterando seu resultado na pesquisa,e o transporte de fômites (carregam microrganismos patógenos) de dentro do laboratório para outros ambientes. “A degermação das mãos ou manilúvio (L:mani + luviu) é um procedimento simples,efetivo e barato que deve ser feito criteriosamente pelo profissional e seus colaboradores. [...] A degermação das mãos pode incluir a lavagem e, já que é impossível eliminar todos os microrganismos das mãos, a anti-sepsia imediata para suprimir a microbiota residual enquanto se usa as luvas. [...] A pele normal é colonizada por bactérias,tanto na superfície como nos poros profundos e nos ductos sudoríparos e glândulas sebáceas.” ( JAIRO GUIMARAES JR.,2001 ) Os EPI‟s são de extrema importância em ambiente de pesquisa e manipulação de patógenos, não só como proteção para quem está ali presente,mas também para não influenciar nos resultados que se deseja obter.O uso de gorro,luvas,máscara,óculos,é considerado praxe.Assim como a presença de EPC (Equipamento de Proteção Coletiva) no ambiente laboratorial, como pias,chuveiro, lava-olhos e extintor de incêndio específico para materiais oxidantes, ou corrosivos. 5

Características dos germicidas (anti-sépticos) tópicos usados no manilúvio

Produtos

Iodóforos

Triclosan

Clorexidina

Modo de ação

Oxidação

Ruptura

da Desnaturação de

parede celular 

Proteínas

Bactérias Gram +

Excelente

Boa

Excelente

Bactérias Gram –

Boa

Média

Boa

M. tuberculosis

Boa

Média

Má

Fungos

Boa

Má

Razoável

Vírus

Boa

Desconhecida

Boa

Rapidez de ação

Média

Média

Média

 Atividade residual Média

Excelente

Excelente

 Afetado

Mínima

Mínima

por  Mínima

matéria orgânica Segurança toxicidade

e  Absorção

pela Falta de dados

pele: toxicidade

Ototoxicidade

e

ceratite

GUIMARAES JR.,Jayro.Biossegurança e controle de Infecção cruzada em Consultórios Odontológicos.São Paulo:Livraria Santos, 2001. 216p.

Chuveiro e Lava Olhos, para lavagem com água corrente da região contaminada. 6

No ambiente de um laboratório acadêmico, onde há o primeiro contato do estudante com o laboratório da disciplina, é importante haver a apresentação dos materiais que serão manuseados com freqüência nos meses seguintes,e atenção para os protocolos que devem ser seguidos para obtenção de melhores resultados,para não haver ocorrência de infecções,ou transporte de fômites do ambiente laboratorial para outros lugares.Medidas estas como a lavagem de mãos antes e após cada aula, o uso de EPI‟s descartáveis, o manuseio de tubos e placas sempre perto da chama do Bico de Baunsen, e evitar o uso de materiais pessoais durante às práticas laboratoriais, restringindo-se apenas à caneta ou lápis,que devem ser desinfetados com álcool após o término da aula.

Lavagem das mãos, e desinfecção com álcool O Laboratório de Microbiologia ainda conta com todo o aparato de armazenamento e esterilização de meios de cultura, vidrarias, e outros materiais usados na prática e pesquisa.Como a Autoclave, que faz esterilização por meio de calor úmido,causando desnaturação das proteínas que formam a parede do microrganismo,e gerando perda de líquido intra-celular deste;a Estufa,que faz esterilização por meio do calor seco,oxidando os microrganismos,e o forno de Pasteur segue esse mesmo princípio,ambos sendo indicados apenas para materiais 7

secos.Logo,os meios de cultura,por serem líquidos,não são indicados à esse tipo de esterilização.Sendo indicados para a esterilização na autoclave a 121ºC,durante 15 a 20 min.Eles não podem ser esterilizados dentro das placas de Petri,pois haveria ressecamento do meio ou desnaturação dos nutrientes,e o tornaria inviável.

 À esquerda, desinfecção da alça de inoculação na chama do bico de Baunsen, e à esquerda, medidas de segurança com a presença do extintor de incêndio. Esses meios de cultura servem para promover crescimento controlado, bacteriano ou fúngico, em ambiente laboratorial. Dependendo daquilo que objetiva ser cultivado,varia-se o meio de cultura.Podendo ser sintético,ou natural.Consistindo numa associação qualitativa e quantitativa de nutrientes específicos para promover  esse crescimento. O Agar serve de nutriente às bactérias ali cultivadas.Há diversos tipos específicos,a variação depende do que se deseja obter.Os diferentes tipos de Agar servem como forma de favorecimento ao microrganismo que deseja-se cultivar,e inibição para os outros que estiverem dispersos no mesmo meio de cultura. O Agar está incluso nas categorias de Meios de Cultura para transporte de conservação e Meios de Cultura para Crescimento e Isolamento. Alguns tipo de  Agar são: 8

Ágar nutriente:usado frequentemente para conversação e manutenção de culturas a temperatura ambiente;é usado para observação de esporos de bacilos Gram positivos;é feito a base de proteínas.

Ágar chocolate: produzido a base de sangue de cavalo, podendo ser substituído por sangue de coelho ou carneiro, que submetido à altas temperaturas para causar  lise nas hemácias,afim de estas liberarem hemina e hematina,compostos fundamentais para que microrganismos exigentes cresçam.

Ágar Thayer-Martin Chocolate :contém antibióticos em sua forma,para inibir o crescimento de bactérias específicas,quando as amostras forem coletadas de sítios contaminados.

Ágar Salmonela-Shigella (SS) : possui componentes que inibem o crescimento de microrganismos gram positivos,como sais de bile e citrato de sódio

Ágar Mac Conkey: inibe o crescimento de bacilos Gram positivos,em especial estafilococos e enterococos.

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2. Abundância e diversidade de microbiota em amostras ambientais

 A superfície inerte oferece sítio de colonização para diferentes tipos de microrganismos, seja fungos ou bactérias, em locais como paredes de banheiro, maçanetas de portas, esponjas de louça, celulares, etc. Ambientes que oferecem condições para a reprodução desses microrganismos. Microrganismos estes, em sua maioria, nocivos ao seres humanos. O ambiente hospitalar, por outro lado, oferece uma maior facilidade na transmissão de microrganismos patógenos, devido o fato de reunir pessoas doente e imunossuprimidas no mesmo ambiente, e ter diversas superfície que podem servir  como meio de contaminação, como materiais pérfuro-cortantes e fontes de ventilação de ar. “Quase todos os micróbios podem causar infecção hospitalar, embora infecções por protozoários sejam raras. O perfil das infecções hospitalares modificou-se com o passar do tempo, refletindo os avanços na medicina e o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. Na era pré-antibiótica, a maioria das infecções era causada por germes Gram-positivos, particularmente Streptococcus  pyogenes e Sthaplylococcus aureus. Com o advento da penicilina e outros

antibióticos de atividade inibitória para os estafilococos, organismos gram-negativos como Escherichia coli  e Pseudomona aeruginosa emergindo como patógenos importantes. Mais recentemente, o desenvolvimento de antimicrobianos de amplo espectro, mais potentes, e o aumento das técnicas médicas invasivas foi acompanhado de um aumento na incidência: germes Gram-positivos resistentes a antibióticos [...], germes Gram-negativos multirresistentes, [...], Candida.” (CEDRIC MIMS,2005)  A infecção hospitalar, também chamada de nosocomial, pode ser dividida em dois grupos: exógena e endógena. A exógena é causada por microrganismos de origem externa, como pessoas, ambiente ou fômites. Devido o fluxo de pessoas doentes, pessoas portadoras não-sintomáticas e o manuseio de equipamentos em diversos pacientes. Na endógena, a causa são os próprios microrganismos da flora normal do indivíduo. Microrganismos estes oportunistas, que causam infecção ao 10

indivíduo aproveitando o seu quadro de imunossupressão.

Para controlar esse tipo de situação, medidas comuns devem ser tomadas, como o uso de EPI‟s pelos funcionários, esterilização adequada dos instrumentais, desinfecção de superfícies comuns à todos, como maçanetas, cadeiras,etc. Trocas de roupas de cama a cada paciente, desinfecção do chão com detergentes bactericidas, assim como pás paredes e teto de ambientes cirúrgicos. E medidas de bom senso, como não deixar circular pelo hospital visitantes que podem carregar  doenças sem apresentar sintomas; separar os pacientes por grau de contaminação da doença que eles apresentam, etc. Prática laboratorial Foram coletadas amostras do ambiente, sendo estas de superfícies inertes e do solo. Com o auxílio do swab e solução salina estéril amotras de maçanetas, celulares, etc, foram coletadas e cultivadas em placa de Petri com Ágar nutriente, que permite o crescimento apenas de bactéria. E, após diluída em solução, a amostra de solo foi cultivada em placa de Petri contendo Ágar sabourad, meio de cultura que permite o crescimento tanto de bactérias quanto de fungos. O resultado foi observado após 3 dias. Na placa de Solo observou-se o crescimento de colônias de fungos, que são filamentosas e lembram algodão, e de bactérias, pequenos pontos brilhantes e circulares. Nas placas de superfícies observou-se o crescimento de bactérias, algumas superfícies apresentaram número mais significativo, outras, nem tanto. O resultado de ambos os cultivos podem ser observados nos gráficos.

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Placas de solo tiveram variação na quantidade de ufc‟s

 A quantidade de ufc‟s foi expressivamente maior nas placas de maçaneta.

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3. Isolamento de bactérias da microbiota humana

 A microbiota normal é aquela que habita a pele e as mucosas do homem.É encontrada em pessoas sadias e exerce papéis importantes,como competição com microrganismos patogênicos por sítios e nutrientes,e síntese de vitaminas.Alguns órgãos são necessariamente estéreis,como cérebro,meninges,coração e fígado.A placenta também é isenta de microrganismos,porém,algumas horas após o nascimento,já podem ser encontrados microrganismos na cavidade bucal do bebê, microrganismos estes oriundos do canal vaginal da mãe, se o parto tiver sido normal, da amamentação, e do ar ambiente. “A flora microbiana no interior e na superfície do corpo humano está num estado contínuo de fluxo determinado por uma variedade de fatores,como idade, dieta, estado hormonal, saúde e higiene pessoal.[...]A população microbiana continua a mudar ao longo da vida do ser humano.Alterações na saúde podem romper drasticamente o delicado equilíbrio que é mantido entre os organismos heterogênicos que coexistem em nosso interior.‟‟ (PATRICK R. MURRAY,2010)  A microbiota humana normal é classificada em: 

Residente:Microrganismos consideravelmente regulares em algum sítio.De acordo com sua freqüência é subdividida em Indígenas (quando em relação ao total de microrganismos,representa mais que 1%) e Suplementares (em proporção menor que 1%).



Transitória:Microrganismos oriundos do ambiente,como do ar,mãos,alimentos. Instalam-se

apenas

quando

ocorre

imunodepressão

do

organismo

hospedeiro.Podem ser patogênicos,ou não. “É provável que os microrganismos que podem ser cultivados em laboratório representa apenas uma fração na flora microbiana normal ou transitória.[...] O número de espécies que compõem a flora microbiana provavelmente é muito maior  do que se conhece. Desta forma, a compreensão da flora normal está em transição.” (JAWETZ, MELNICK E ALDEBERG,2009) 13

OLHO  A conjuntiva é normalmente habitada por difteróides ( Corynebacterium  xerosis)e estreptococos não-hemolíticos.O fluxo de lágrimas contêm lizosima

bacteriana,que controla a proliferação de bactérias. TRATO RESPIRATÓRIO O nariz é habitado por estreptococos,estafilococos,como S. aureus e S. epidermidis,

e

corinebactérias.Na

faringe

encontra-se

estreptococus

não

hemolíticos, estafilocos, difteróides e pneumococos Mycoplasma e Prevotella.Estes também podem ser encontrados nos brônquios.Geralmente os bronquíolos e os alvéolos são estéreis. BOCA  A cavidade bucal oferece sítios diversos aos microrganismos, como a superfície dental, o sulco gengival, o dorso da língua e as amígdalas. Geralmente encontra-se espécies de  Actinomyces nas amígdalas e gengivas, e Streptococcus mutans associados a cárie dental.

TRATO GASTROINTESTINAL O esôfago é habitado por algumas microrganismos comuns a orofaringe, mas acredita-se que a maioria presente nele sejam transitórias que não se estabeleçam.O estômago tem pH ácido,logo as bactérias lá encontradas são ácido tolerantes (Lactobacillus e Streptococcus).A população microbiana deste órgão pode estar alterada em pacientes que estejam utilizando medicamento que reduzam o pH gástrico. “O número de bactérias da flora intestinal é 10 vezes maior que o número de células que formam os nossos órgãos e tecidos, isto é, 10 14 bactérias para 10 13 células humanas.‟‟(LUIZ RACHID TRABULSI,2005) O intestino humano é dividido em dois grandes sítios, o intestino delgado e o intestino grosso,estes subdivididos em sítios menores.O intestino delgado é formado por 3 porções:o duodeno, que é uma extensão do estômago,é habitado por  14

diferentes bactérias, fungos e parasitas, em sua maioria anaeróbios, alguns responsáveis por doenças gástricas, como Peptostreptococcus, Porphynomas e Prevotella; jejuno,a maior porção, é colonizado em suas maioria por espécies

aeróbias de estreptococcos, estafilococos e lactobacilos;

o íleo,que liga-se ao

intestino grosso, apresenta uma diversidade maior de microrganismos, pois passa a incluir coliformes e bacteróides, fusobactérias e clostrídeos, que são bactérias anaeróbias. “O baixo potencial de oxirredução no íleo explica a presença da flora anaeróbia nessa região”. (LUIZ RACHID TRABULSI,2005). O intestino grosso é o sítio do corpo humano mais habitado por  microrganismos. É dividido em colo ascendente, transver so e descendente. “No intestino grosso, as bactérias anaeróbias superam as demais (facultativas e aeróbias) por um fator de 10 2-104. Predominam os bacteróides,bifidobactérias e fusobactérias. Os lactobacilos, estreptococos, clostrídeos e enterobactérias são também bastante freqüentes. Calcula-se que a flora intestinal compreenda em torno de 500 espécies pertencentes a 200 gêneros, mas desses somente em torno de 20 são representados de maneira significativa.” (LUIZ RACHID TRABULSI,2005). As bactérias mais freqüentes incluem Bifidobacterium, Eucabacterium, Bacteroides, Enterococcus,

Clotridium,

Pseudomonas,

Streptococcus,

Lactobacillus,

Fusobacterium, e Staphylococcus. A flora intestinal é importante na para a absorção

de nutrientes, síntese de vitamina K (que é um fator de coagulação sanguínea) e conversão de ácidos biliares. A ingestão de antimicrobianos, no tratamento de doenças, altera a oferta de bactérias, podendo causar diarréia antibiótico-induzida e dificuldade na absorção e redistribuição de medicamentos, como no caso dos contraceptivos orais, que podem perder o efeito se associado ao uso de antibióticos. TRATO GENITAL No sistema genital feminino,a uretra anterior e a vagina são normalmente colonizadas por microrganismos.A flora de ambos é formada por uma variedade de lactobacilos, estreptococos e estafilococos. As variações de pH controlam a diversidade desses sítios. “Em pH ácido (+/ - 5) há predominância de Lactobacillus e em pH neutro predominam as outras bactérias. A variação de pH, por sua vez, está relacionada com a quantidade de glicogênio na vagina. A fermentação deste 15

polímero pelos lactobacilos abaixa o pH, criando um ambiente desfavorável ao crescimento das bactérias que proliferam em pH neutro.” (LUIZ RACHID TRABULSI,2005). A bexiga urinária pode ser colonizada transitoriamente por  bactérias da uretra,mas a ação bactericida de células uroepiteliais e o jato de urina eliminam os microrganismos de lá.O útero, e demais órgãos relacionado ao sistema genitourinário devem ser estéreis.O controle microbiano também ocorre pela ação do muco cervical que contém lisozima,uma enzima com atividade antibacteriana.  A uretra masculina é normalmente colonizada pelos mesmos microrganismos da uretra feminina. PELE “Em virtude de sua constante exposição e contato com o meio ambiente, a pele mostra-se particularmente propensa a abrigar microrganismos transitórios. Entretanto, existe uma flora residente constante e bem-definida, modificada em diferentes áreas anatômicas por secreções, uso habitual de roupas ou proximidade de mucosas (boca, nariz e área perineal).” (JAWETZ, MELNICK E ALDEBERG, 2009) Os microrganismos mais comuns à pele são bacilos difteróides aeróbios e anaeróbios (Corynebacterium, Propionibacterium)

e estafilococos aeróbios e

anaeróbios não-hemolíticos,como o Staphylococcus epidermidis. Há presença,em menor quantidade, de Enterococcus. O pH baixo, os ácidos graxos e a presença de lisozima são condições que resultam na eliminação de microrganismos não-residentes da pele. No entanto, nem a lavagem e banho, nem a sudorese são capazes de alterar significativamente a flora residente. Prática Laboratorial Com o objetivo de cultivar microrganismos na flora humana normal, que é importante na competição com os patogênicos por sítios e nutrientes,foi realizada a coleta de amostras de diferentes locais.O procedimento de coleta foi feito com o 16

swab,em áreas como a boca e unha, umedecido em solução salina estéril,e feito então um esfregaço em zigue-zague na Placa de Petri contendo Ágar nutriente. Os microrganismos nas áreas coletadas são abundantes, e a presença deles é normal, não estando relacionada com o estado de doença. As placas foram incubadas a 37º por 24 horas e após 3 dias os resultados foram observados. Macroscopicamente, as colônias tinham aparência diferentes, pois não eram dos mesmos locais anatômicos e, portanto, apresentavam flora normal distinta. A placa da boca apresentava colônias médias, de cor amarelada, circulares com bordas lisas e elevação côncava. A da unha,no entanto, tinha colônias pequenas, de cor branca, forma circular, elevação ondulada e estavam bem agrupadas.

Placa de Petri da aula: O sítio de cima é o da boca, pode ser observada a coloração amarela das colônias, o sítio de baixo representa a unha, e a cor branca é evidente. Conclui-se então que são microrganismos de espécies diferentes.

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Para a visualização microscópica das UFC‟s da placa montada,foi realizada a montagem de lâminas de esfregaço com coloração com o azul de metileno. E levando a lâmina ao aquecimento rápido no Bico de Baunsen. O azul de metileno é um sal, Cloreto de azul de metileno, consiste num cátion de azul de metileno e num ânion de cloreto. Colore as células a partir da associação do cátion com estas. Ele reage com as células à uma taxa lenta de 30-60 segundos. Na visualização microscópica observou-se na lâmina de boca a presença predominante de estafilococos,e também estreptococos e diplococos,na lâmina se unha observou-se a presença de cocos livres e muitas tétrades. Boca

Unha

4.Coloração de Gram 18

4. Coloração de Gram

O método de Coloração de Gram tem como objetivo facilitar a diferenciação das bactérias baseado na constituição de suas camadas,podendo ser Gram Positivas ou Gram negativas.A coloração facilita ainda a observação da morfologia das células,se estas são cocos ou bacilos,e seus arranjos em grupos. O método tradicional da coloração foi desenvolvido por Hans Christian Gram,mas existem inúmeras variações baseadas neste,como de Hucker, e de Kopeloff.Os princípios são os mesmo,varia-se apenas os corantes,ou a sequência destes. O princípio geral deste método é o de fixação,coloração e desidratação das células,que dependendo da constituição de suas paredes,perde ou mantém a coloração.Este será descrito adiante. Quanto a estrutura e composição das células: “O principal componente estrutural da parede celular é um peptidoglicano (mucopeptídeo ou mureína), um polímero misto de açúcares hexoses (N-acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico) e aminoácidos.Nas bactérias gram-positivas,o peptidoglicano forma uma camada espessa (20-80 nm) externa à membrana celular e pode conter outras macromoléculas.Nas espécies gram-negativas, a camada de peptidoglicano é fina (5-10 nm) e recoberta por uma membrana externa ancorada às moléculas de lipoproteínas na camada de peptideoglicano. As moléculas principais da membrana externa são lipopolissacarídeos e lipoproteínas.Os polissacarídeos e os aminoácidos carregados na camada de peptidoglicano a tornam altamente polar, promovendo a bactéria com uma superfície hidrofílica espessa.Essa propriedade permite que os organismos gram-positivos resistam à atividade da bile. Por outro lado, a camada é digerida pela lisozima, uma enzima presente nas secreções do corpo, a qual consequentemente apresenta propriedade bactericidas.A síntese do peptidoglicano é interrompida pelos antibióticos penicilina e cefalosporinas.Nas bactérias gramnegativas, a membrana externa e também hidrofílica, porém os componentes lipídicos das moléculas constituintes lhe conferem também propriedades hidrofóbicas. A entrada de moléculas hidrofílicas como açúcares e aminoácidos é necessária para a nutrição e é conseguida pelos canais ou poros formados por  19

proteínas chamadas „porinas‟.O lipopolissacarídeo (LPS) na membrana confere ambas as propriedades: antigênica (os antígenos „O‟ das cadeias de carboidrato) e tóxica (a „endotoxina‟ do lipídeo A).Nas micobactérias gram-positivas, a camada peptidoglicano apresenta uma base química diferente para a ligação cruzada à camada de lipoproteínas, e o envelope esterno contém uma variedade de lipídios complexos (ácidos micólicos). Isto cria uma camada serosa,à qual altera as propriedades de coloração desses organismos (as chamadas bactérias ácidoresistentes) e lhes dá considerável resistência ao ressecamento e utros fatores ambientais. Os componentes da parede celular das micobactérias também apresentam uma atividade adjuvante pronunciada (i.e promovem resposta imunológica). No lado externo da parede celular,pode haver uma cápsula adicional de polissacarídeos de alto peso molecular (ou aminoácidos no bacilo do antraz) que confere uma superfície viscosa. A cápsula fornece proteção contra fagocitose pelas células do hospedeiro e é um importante determinante de virulência.” (CEDRIC MIMS,2005).

Gram-positiva

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Gram-negativa O material para coloração foi obtido a partir de uma amostra de mucosa oral colocado em um meio de A.N. cerca de 7 dias antes. Com o auxílio da alça de rubro,esta já submetida à chama do bico de Bausen,coletamos uma pequena quantidade de uma UFC da placa de Petri ,e ,sobre uma lâmina com uma gota de álcool,espalhamos suavemente a amostra coletada.Em seguida,para fixar o material, e evitar a remoção das bactérias no momento da coloração,por 3 vezes flambamos a lâmina rapidamente.Deixar esfriar. O esfregaço agora deve ser coberto por uma camada do principal corante,o Cristal Violeta, e reservar por 1 minuto.Este corante entra no citoplasma das células,sejam estas Gram+ ou Gram -, corando ambas.Despejar o excesso. Fazer  uma nova camada sobre a lâmina com Lugol,um fixador que irá reagir com o Cristal Violeta,formando cristais grandes o bastante para não saírem da celular,formando um complexo chamado de violeta-iodo,violeta-lugol ou iodo-pararosanilina.Lavar a lâmina com água corrente.Em seguida,lavar a lâmina com álcool por 15 segundos. “A aplicação de álcool desidrata a peptideoglicana das células gram -positivas para torná-lo mais impermeável ao cristal violeta-iodo. O efeito nas células gramnegativas é bem diferente: o álcool dissolve a membrana externa das células gramnegativas,deixando

também

pequenos

buracos

na

fina

camada

de

peptiodeoglicanos pelos quais o cristal violeta-iodo se espalha.Como as bactérias 21

gram-negativas ficam incolores após a lavagem com álcool, a adição de safranina (contracorante) torna as células cor-de-rosa.” (GERARD J. TORTORA,2005)

Ilustração do procedimento: lâmina e lamínula

 A composição básica das soluções utilizadas na técnica estão descritas a seguir: CRISTAL VIOLETA Cristal violeta  Ácido fênico  Álcool absoluto  Água destilada LUGOL Iodo Iodeto de potássio  Água destilada

22

FUCSINA Fucsina  Álcool etílico  Água destilada Desenho das bactérias visualizadas por microscopia óptica na aula prática. A visualização foi aumentada 400x,colocando sobre a lâmina o óleo de emersão. Gram-positiva:

Gram-negativa:

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5. Técnica de diluição seriadas e contagem de colônias

Cada mililitro de uma suspensão de células bacterianas deve conter milhões de células, porém, nem todas são viáveis. O nome dado ás células viáveis é Unidade formadora de colônia (UFC). A técnica de diluição seriada tem como objetivo facilitar o isolamento de microrganismo e principalmente permitir a contagem dessas UFC‟s a partir de uma proporção de diluição. O método baseia -se no princípio de que cada uma dessas unidades formadas é oriunda de uma única célula bacteriana viável.  A quantificação das unidades envolve alguns cuidados, como assepsia, para não contaminar o preparo, e o meio de cultivo que deve ser pobre em carboidratos, pois este pode estimular a produção de cápsula, gerando uma aderência das células umas às outras, e assim dificultando a contagem. A diluição sofre outras diluições em alíquotas, para assim encontrar um número menor e contável, baseado em uma proporção. Prática laboratorial  A partir de uma amostra em solução com concentração de 10 -1 em 1ml fazer  sucessivas diluições em amostras salinas estéreis também na quantidade de 1ml, até a proporção de 10 -7. Escolher 3 proporções para o cultivo em placa.  As proporções escolhidas foram 10 -3,10-5 e 10-7. As soluções foram cultivadas em diferentes placas de Petri e o resultado foi observado após 3 dias.  A contagem de ufc‟s foi possível nas três placas. A concentração de bactérias seguiu decrescentemente as proporções: 10 -3,10-7 e 10 -5. Diferentes unidades foram observadas: amarelas e brancas, com bordas circulares e uniformes, circulares e irregulares, com superfícies convexas e onduladas.

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Representação de diluição.

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6. Antibiograma

O antibiograma é um teste laboratorial que consiste em verificar qual a resistência de um determinado microrganismo a um agente bactericida, que interrompe sua atividade, ou bacteriostático, que o mata. Assim é possível ter uma especificidade sobre qual agente antimicrobiano utilizar em um tratamento. Logo, é recomendado para grupos de bactérias que adquiram resistência facilmente. Além disso, é um teste útil para teste com novos antibióticos e pesquisas epidemiológicas. “O antibiograma é indicado para qualquer microrganismos estreitamente relacionado ao processo infeccioso, cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na terapia não seja previsível. É o caso das enterobactérias, S. aureus, bacilos Gram-negativos não fermentadores etc. Estas bactérias sofrem forte pressão seletiva, já que pela ação das drogas há o extermínio das bactérias sensíveis e crescimento das bactérias resistentes, que estavam misturadas na população bacteriana.” (MARIANGELA CAGNONI RIBEIRO,2000) Há inúmeros procedimentos para testar a eficácia de antimicrobianos, como testes quantitativos, com um ponto final específico conhecido como Concentração Inibitória Mínima (CIM) e testes qualitativos, como o método de difusão em disco, onde as bactérias isoladas podem ser classificadas em resistente,intermediária ou sensível. Mas pode ser resumida em duas principais: resistente e sensível. A resistência encontrada em alguns tipos de bactérias pode ser explicada pela composição das suas paredes. “[Concentração Mínima Bactericida] É a mais baixa concentração do antibiótico capaz de eliminar completamente o microrganismo. O procedimento é semelhante ao realizado para a medida da CMI. A diluição do antibiótico que for  capaz de eliminar totalmente os microrganismo e impedir que o microrganismo cresça no meio sem o antimicrobiano é considerada a concentração mínima bactericida (CMB). A CMB é mais utilizada para pacientes imunossuprimidos ou em pacientes acometidos por endocardites.” (ALANE BEATRIZ VERMELHO,2006)

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Prática laboratorial O método escolhido foi o de difusão em disco, e, ao invés de antimicrobianos, três enxaguantes bucais foram escolhidos para ter sua eficácia testada. O método é o de Kirby-Bauer, aceito como método-padrão para a realização de antibiogramas. Em uma placa com Agar nutriente, espalhar uma solução com bactérias sobre ela de maneira uniforme, e, com o auxílio de uma pinça, umedecer um par de discos, um sobre o outro, nos líquidos a serem testados. Repetir isso em todos os líquidos os enxaguantes a serem testados. Os escolhidos foram Oral B, Listerine,e Perio Plark. Com a placa marcada com pincel, colocar os discos sobre a marca e incubá-los. O resultado observados após três dias foi a eficiência do Perio Plark, pois na sua composição há clorexidina, um anti-séptico de amplo espectro no controle de bactérias gram-positivas, gram-negativas e fungos, que não agride as mucosas. O Listerine teve menor eficácia, mas ainda assim presente, devido o álcool na sua composição, que também tem ação anti-séptica. E o Oral B não teve eficiência expressa. Halos de inibição (média)

Perio Plak

Listerine

Oral B

1,5 mm

0,5 mm

0,1mm

Perio Plak: Microrganismo sensível Listerine: Microrganismo com sensibilidade intermediária baixa. Oral B: Microrganismo resistente

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Houve variação em alguns resultados quanto o Oral B e Listerine, talvez devido à erros no procedimento, porém, o Pério Plak foi eficiente em todos os casos. Os resultados podem ser observados no gráfico

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7. Características morfológicas de fungos

Os fungos são seres eucariotos, anaeróbios ou aeróbios, quimioheterotróficos, necessitando de componentes orgânicos para energia e carbono, multicelulares ou unicelulares, no caso das leveduras, e se reproduzem de forma sexuada e assexuada. “Os fungos normalmente crescem melhor em ambiente em que o pH é próximo a 5, que é muito ácido para o crescimento da maioria das bactérias comuns. Quase todos os fungos são aeróbicos. A maioria das levedura é anaeróbica facultativa. A maioria do fungos é mais resistente à presão osmótica que as bactérias;

muitos

consequentemente,

podem

crescer

em

concentrações

relativamente altas de açúcar ou sal. Os fungos podem crescer sobre substâncias com baixo grau de umidade, geralmente tão baixo que impede o crescimento de bactérias. Os fungos necessitam de menos nitrogênio para o crescimento equivalente ao das bactérias. Os fungos são frequentemente capaz de metabolizar  carboidratos complexos, tais como lignina (um dos componentes da madeira), que as bactérias não podem utilizar como nutriente.Essas características permitem que os fungos se desenvolvam em substratos diversos como parede de banheiro, couro de sapatos, e jornais velhos”. (GERARD J. TORTORA, 2005) Na observação de características macroscópicas, aspectos importantes a serem observados são: tamanho, que varia bastante, de acordo com a qualidade e quantidade de substrato ofertado;bordas, podendo estar ter várias formas, sendo bem delimitadas ou irregulares, lembrando franjas; textura, esta é talvez a mais importante característica de uma colônia fúngica, essas colônias podem ser colônias algodonosas (com aspecto de algodão), furfuráceas (lembram substância farinácea espalhada numa superfície), penugentas (lembram fragmentos de penas de aves), arenosas (com aspecto de areia), veludosas (assemelha-se a tecido aveludado), glabrosas (aspecto de cera ou manteiga,sendo observada em leveduras,que se assemelham à colônias bacterianas); quanto o relevo a colônia fúngica pode ser  cerebriforme (com ondulações que lembram um cérebro), rugosas (com ondulações menos evidentes), apiculadas (saliência no ponto central lembra um cume), e 29

crateriformes (lembram cratera devido à uma depressão central); e a pigmentação, que pode estar presente só na superfície da colônia, no seu reverso, em ambos, e ser ou não difusível ao meio. “A caracterização de uma colônia, visando auxiliar a identificação de determinada espécie fúngica, nada mais é do que um conjunto de características subjetivas, de expressão fenotípica, encontradas em determinada espécie. As alterações fenotípicas, por sua vez, nada mais são do que uma tentativa de adaptação do fungo ao meio biótico e abiótico ao qual a colônia está submetida. Não raro, as características clássicas deixam de se manifestar e apontam em direção a uma outra espécie fúngica, não correlacionada aos achados”. (JOSÉ JÚLIO COSTA SIDRIM,2004) Os elementos gerais de um fungo, além da colônia, são micélios e o talo. O micélio é um filamento semelhante a um tecido, formado por um conjunto de hifas,é fácil de confundi-lo com a cultura no cultivo, tem função de elemento de sustentação e absorção de nutrientes. As subdivisões dos micélios são feitas de acordo com sua situação (se é aéreo ou profundo) ,sua septação (contínua ou septada), sua função (vegetativo ou reprodutivo) e pela disposição das suas hifas (podem ser em anéis, rizomorfas, haustórios,etc).E o talo é o corpo do fungo, pode ser unicelular ou miceliano (filamentoso);ele é formado por células agrupadas ou separadas, sem uma ligação muito rígida, sendo comum às leveduras. Microscopicamente, as estruturas responsáveis pela diferenciação da espécies de fungos filamentosos são conhecidas por nomes de estruturas de frutificação e de ornamentação. Essas estruturas de frutificação são células pertencentes às hifas que sofrem modificações, dependendo da condição biológica, para originar dois tipos primários de células: as esporogênicas e as conidiogênicas. O que as diferencia é o fato de que a primeira vai originar esporos, que ficam dentro de uma bolsa conhecida como esporângio, enquanto na segunda não se observa estrutura de envolvimento externo. Ambas as células tem função final de reprodução assexuada, mas no caso dos conídios de fungos filamentosos, estes estão livres para se destacar da hifa e dar origem a um novo fungo. Outras estrutura, denominadas de ornamentação, que não se conhece sua função específica, também auxiliam na diferenciação de espécie dos fungos. 30

Procedimento Laboratorial Com o auxílio de um palito, foram coletadas amostras dos gêneros Penicillium,  Aspergillus e Candida para serem observadas em microscopia ótica.

Durante a preparação das lâminas as amostras receberam a coloração do azul de metileno para auxílio na observação. Procurar coletas amostras do centro da cultura, pois estas já esporularam.

Penicillium macroscopicamente, com coloração esverdeada em verso, bordas

brancas, superfície rugosa e veludosa. Microscopicamente, pode ser visualizada as hifas septadas com fiálides e conídios nas extremidades, sem a presença de vesículas.

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 Aspergillus: superfície cebriforme e algodonosa, com coloração no verso.

Microscopicamente, pode ser observada uma vesícula na extremidade de um conidióforo, e essa vesícula cercada por conídios.

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Candida, com aparência de colônias de bactérias, sendo globosas, brilhantes

e com superfície côncava Microscopicamente, são observados brotos, ou pseudohifas, brotos que não se separaram.

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Referências Bibliográficas

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Consultórios Odontológicos.São Paulo:Livraria Santos,2001.536p. HIRATA, Mario Hiroyuk.Manual de Biossegurança.Barueri:Manole,2002.496p. MURRAY,

Patrick

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Microbiologia

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Rio

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Elseviver,2009.948p. TRABULSI, Luiz Richard. Microbiologia. Ed 4. São Paulo: Editora Atheneu, 2005.718p SIDRIM, José Júlio Costa. Micologia médica à luz de autores contemporâneos . Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.388p MINAMI, Paulo S. Micologia: Métodos Laboratoriais de Diagnóstico das

Micoses. Barueri: Manole,2003.199p BROOKS, Geo F. Microbiologia Médica. Ed 24. Rio de Janeiro: McGraw-. Hill,2009.820p MAZA, Luis M. de La. Atlas de diagnósticos em Microbiologia. Porto Alegre:  Artmed, 1999.216p. VERMELHO, Alane Beatriz. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. 239p. ROMEIRO, Reginaldo da Silva. Método de diluição em placas para contagem de

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