Relatório - Hidrólise do amido

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

GESSICA DE QUADROS FERREIRA JENNIFER LORENA FERREIRA JOSIANE APARECIDA SCHEMBERGER KAROLINE IANUXAUSKAS STRUMINSKI MARYANA ALBINO CLAVERO

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO HIDRÓLISE ÁCIDA DO AMIDO

PONTA GROSSA 2011

GESSICA DE QUADROS FERREIRA JENNIFER LORENA FERREIRA JOSIANE APARECIDA SCHEMBERGER KAROLINE IANUXAUSKAS STRUMINSKI MARYANA ALBINO CLAVERO

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO HIDRÓLISE ÁCIDA DO AMIDO Trabalho acadêmico apresentado à disciplina de Bioquímica para obtenção de nota parcial referente ao segundo semestre. Professora: Juliana Inaba.

PONTA GROSSA 2011

OBJETIVO Avaliar o perfil de hidrólise enzimática do amido. Objetivo específico: Comparar a hidrólise ácida com a enzimática. INTRODUÇÃO O amido O amido é um poliolosídio homogêneo constituído essencialmente de por resíduos de glicose unidos por ligações alfa-1,4 (amilose e amilopectina)e alfa-1,6 (amilopectina). A amilose reagindo com o iodo forma uma coloração azul e a amilopectina forma uma coloração vermelho-castanho. A Amilase A amilase é uma enzima produzida pelo pâncreas e pelas glândulas salivares, que atua na digestão do amido e do glicogênio. Clinicamente sua analise é um indicador útil no diagnóstico de pancreatites e paratiroides. Os valores de amilase no sangue estarão aumentados na presença de pancratite aguda e crônica; caxumba; úlcera péptica perfurada; intoxicação por álcool; insuficiência renal; colecistite agua; Aids; obstrução do ducto biliar ou pancreático;hepatite; cirrose; insuficiência hepática; toxemia gestacional; queimaduras severas. Amilase Salivar A digestão dos alimentos é iniciada na boca, onde se verifica, essencialmente, a mastigação, havendo a quebra das grandes partículas alimentares em outras de menores dimensões que vão em seguida ser deglutidas. Ao mesmo tempo em que o alimento é mastigado dá-se a mistura deste com a secreção proveniente na sua maior parte, dos três pares de glândulas salivares - parótidas, submaxilares ou mandibulares e sublinguais - embora haja ainda a contribuição de pequenas glândulas orais. As glândulas salivares exibem dois tipos de secreção proteica: serosa e mucosa. A primeira corresponde à secreção de várias enzimas, como a α-amilase salivar, também frequentemente designada por amílase ou ptialina, lípase, fosfatases ácidas e

alcalinas e anídrase carbónica. O segundo tipo de secreção não é exclusiva deste tipo de glândulas, sendo produzida em toda a extensão do tubo digestivo,  já que o muco funciona como lubrificante e protetor da superfície epitelial contra a abrasão, escoriação, enzimas e outros produtos existentes no interior do tubo digestivo, permitindo também o fácil deslizamento do alimento. A amilase familiar é sintetizada ao nível das glândulas parótidas A produção de saliva é contínua, sendo incrementada por estímulos provenientes das áreas do sistema nervoso central associadas ao apetite, nomeadamente, em resposta a estímulos do sistema nervoso parassimpático. Na presença de alimento ou de um sinal indicador da possibilidade de haver ingestão de alimento (por exemplo, o cheiro ou a imagem), a secreção pode aumentar mais de 40 vezes. Por dia, a produção total de saliva ronda os 1,5 L. A amilase salivar é uma enzima que atua provocando a hidrólise do amido, um polissacarídeo muito abundante na alimentação, estando presente, sobretudo, em alimentos de origem vegetal, nos quais constitui a principal substância de armazenamento. Em termos funcionais, esta enzima é uma α (1-4) glicosidase, provocando a quebra da molécula de amido em dissacarídeos, nomeadamente, maltose, a qual, posteriormente, será simplificada a unidades de glicose, um monossacarídeo, por enzimas específicas no duodeno. A glicose é o principal substrato energético das células. A amilase salivar apenas atua em situações de pH próximo da neutralidade, motivo pelo qual o pH da boca varia entre os 6 e os 7,4. A sua ação prolonga-se mesmo no decurso do processo de deglutição, até a chegada ao estômago, onde é inativada pelo pH ácido do suco gástrico. Mau grado a ação da α- amilase, a ação enzimática na cavidade bucal tem pouca expressão no processo digestivo, devido ao pouco tempo de contacto entre as enzimas presentes na saliva e o alimento neste local. Uma mastigação lenta e persistente permite uma degradação mais efetiva do amido na boca, permitindo um aproveitamento mais eficaz deste nutriente. O amido não digerido pela amilase salivar apenas será transformado, posteriormente, ao nível do duodeno, por ação da amilase pancreática.

A hidrólise O amido, por tratamento, com ácidos fortes e em temperatura elevada, pode ser convertido completamente em moléculas de glicose. O ácido a quente hidrolisa tanto as ligações α-1,4, como as α-1,6. À medida que a hidrólise progride, a reação com o iodo vai desaparecendo e o poder redutor do hidrolisado vai aumentando, pois estamos convertendo um composto nãoredutor e que reage fortemente com o iodo (amido) no seu constituinte essencial, que não reage com o iodo e é francamente redutor (glicose). A hidrólise enzimática A hidrólise enzimática do amido pelo α -amilase, por mais exaustiva que seja não converte todo o amido a moléculas de glicose. Sendo uma enzima que ataca somente as lig ações α-1,4 no interior da molécula, a sua ação sobre a amilose produz moléculas de maltose, de maltotriose e poucas moléculas de glicose. Na amilopectina, e la ataca as mesmas ligações α-1,4, sendo inativa em relação às ligações α-1,6. As amilodextrinas liberadas logo após o início da hidrólise enzimática do amido reagem com o iodo dando uma cor azul. As dextrinas tendo menor peso molecular (e bastantes ramificações) reagem com o iodo dando uma cor avermelhada e sendo, por isto chamadas de eritodextrinas. À medida em que a hidrólise progride, as eritodextrinas vão sendo desdobradas em unidades menores, ainda contendo ramificações (ligações α-1,6), que são chamadas de acrodextrinas por não produzirem um composto corado com o iodo. Prosseguindo a hidrólise pela α-amilase, poderíamos reduzir as dextrinas até o tamanho de oligolosídios contendo ligações α-1,6 e algumas moléculas de isomaltose, um diolosídio com ligação α-1,6.  A hidrólise pela α-amilase, portanto, transforma o amido ( não redutor e com a reação azul com o iodo), progressivamente com acrodextrinas ( com baixo poder redutor e não coráveis pelo iodo ) e em glicose, maltose, isomaltose e oligolosídios redutores que também não desenvolvem coloração com iodo. No nosso organismo, a α-amilase pode ser encontrada principalmente na saliva e no suco pancreático, ocorrendo também, em menores proporções, na urina e no soro sanguineo. Praticamente toda a α-amilase encontrada no soro e

na urina tem origem pancreática. A α-amilase pancreática é uma metaloenzima com peso molecular de aproximadamente 45.000 e que contém cálcio. A presença de Ca ++ é essencial não somente para a atividade da enzima, mas também protege a sua estrutura peptídica contra a digestão proteolítica.  A α-amilase é ativada por íons cloreto e tem um pH ótimo de ação em torno de 6,7, sendo inativada em pH ácido ( abaixo de 4 ). Com o Aquecimento a enzima sofre desnaturação e perde sua atividade. MATERIAIS - tubos de ensaio - pipetas - água destilada - solução de amido 1% - solução de HCℓ concentrado - solução tampão - solução de Lugol - reagente DNS - banho Maria - espectofotômetro PROCEDIMENTOS Para a hidrólise ácida, primeiramente numeraram-se os tubos de ensaio para posterior identificação dos reagentes utilizados e da quantidade de tempo para fervura. Em outro tubo adicionou-se 5 mL de solução de amido a 1% e o incubou durante 5 minutos à 37º C. Concomitantemente coletou-se saliva e foi preparada uma solução diluída (1:10)  – contendo 1 mL de saliva, para 9 mL de solução tampão. Ao tubo submetido ao aquecimento, adicionou-se 0,2 mL da solução de saliva, mantendo a agitação. Desta mistura, nos tempos de 0, 2, 5, 10, 15 e 20 minutos, foram coletados 0,4 mL sendo 0,2 para o teste do iodo e 0,2 para o teste do DNS. Aos tubos de teste para o iodo adicionou-se ainda 3 gotas de Lugol e 10 mL de água. Enquanto para o teste de DNS pipetou-se 1,3 mL de água e 1 mL de DNS. Logo em seguida, submeteram-se os tubos a aquecimento de 100º C

durante 5 minutos. Depois de resfriado, adicionou-se 7,5 ml de água e fez-se a leitura a 540 nm. Na hidrólise enzimática, fez-se os mesmos procedimentos. Porém, ao tubo de ensaio foi adicionado 0,2 mL de HCℓ concentrado, ao invés da solução

de saliva diluída. RESULTADOS E DISCUSSÃO Experimento 1: Para dar-se início ao experimento foi incubada a solução de amido a uma temperatura em torno de 37° C, para que esta ficasse com uma temperatura relativamente aproximada ao do corpo humano, e assim fazendo com que a enzima (amilase salivar) estivesse com seu melhor desempenho. Preparamos também uma solução salivar diluída (1:10). Enquanto a solução de amido se estabilizava, preparou-se os tubos de 1 a 5 para o teste de Lugol, e de 6 a 10 para o teste do DNS. Após 5 minutos passados começou-se a adicionar a solução de amido nos tubos nos tempos de 0, 2, 5, 10,15 e 20 minutos, e obteve-se o seguinte resultado visual em degradê, como mostra as figuras a seguir:

Figura 1: Teste do Iodo (Lugol) Fonte: Elaboração própria

Figura 2: Teste do DNS. Fonte: Elaboração própria .

Baseado nesses resultados (figura 1) pode observar que com a adição de Lugol resulta na formação de um complexo de coloração azul escuro, fato pelo qual há interação do iodo com a estrutur a α – hélice do amido. Sendo que está coloração vai do azul escuro até o amarelo claro pelo tempo de incubação do amido, mesmo esta reação sendo irreversível o amido pode não se recompor, nos dando então a coloração amarelo claro. Já com a adição do DNS (figura 2) as amostras reagiram conforme o tempo em que o amido ficou incubado e posteriormente ao aquecimento com a enzima, mostrando que quanto mais tempo o amido fique junto a enzima, esta exposta ao calor mais o amido divide-se em açúcares menores. Mas, lembrando de que esta exposição do amido junto à enzima não pode ser por muito tempo, pois a enzima pode desnaturar e perder a sua função, não dando o resultado esperado. Abaixo está demonstrado o resultado desta reação pela espectrofotometria:

Gráfico 1: Curva de calibração absorbância versus  tempo de incubação do amido e sua divisão em açúcares menores. .

y = 0.0151x + 0.1236 R² = 0.9579

0.45 0.4 0.35   a 0.3    i   c   n    â0.25    b   r   o   s    b 0.2    A

Series1 Linear (Series1)

0.15 0.1 0.05 0 0

5

10

15

20

25

Tempo

Experimento 2: Para dar-se início ao experimento incubou-se a solução de amido a uma temperatura em torno de 100° C e adicionou-se a esta solução de ácido clorídrico, e por este ser um ácido forte em uma temperatura elevada tende a fazer a conversão completa das moléculas de amido em glucose. Sendo que o ácido a quente hidrolisa tanto as ligações α-1,4 quanto as α-1,6. À medida que esta solução (amido + ácido) foi ficando incubada obtevese o seguinte resultado visual, como mostram as figuras a seguir:

Figura 3: Teste do Iodo (Lugol) Fonte: Elaboração própria

Figura 4: Teste do DNS Fonte: 1Elaboração própria

Pode-se observar na figura 3 que à medida que a hidrólise progride, a reação entre o amido e o iodo (teste do Lugol) vai desaparecendo, já a partir do tubo 2, e no tubo 4 não se tem mais essa interação, mostrando que o amido foi convertido em glucose sendo que este não reage com o iodo. E na figura 4 observou-se que no teste DNS às amostras reagiram conforme o tempo em que o amido ficou incubado, mostrando que quanto mais tempo o amido fica incubado na presença do ácido mais ele é convertido em glucose. Abaixo está demonstrado o resultado desta reação pela espectrofotometria:

Gráfico 2: Curva de calibração absorbância versus  tempo de incubação do amido em presença do ácido clorídrico. .

1.4 1.2 1

  a    i   c   n    â0.8    b   r   o0.6   s    b    A0.4

Hidrólise ácida Linear (Hidrólise ácida)

0.2 0 0

5

10

15

20

25

Tempo

Com os dois experimentos e a observação dos seus resultados obtevese o seguinte gráfico: Gráfico 3: Comparação entre a hidrólise enzimática e ácida. .

1.2 Hidrólise enzimática

1

Hidrólise ácida

0.8    a

   i    c    n     â     b0.6    r    o    s     b    A

0.4 0.2 0 0

5

10

15

20

25

Tempo (minutos)

Comparando também as concentrações obtidas através da equação y = 0,0151x + 0,1236 podemos constatar com estes resultados que a hidrólise mais rápida e mais eficiente é a ácida, mas tem que se levar em consideração

que esta hidrólise ocorre em temperaturas mais elevadas. Abaixo estão demonstradas as concentrações de glucose em cada tubo: Tabela 1: Concentração de glucose na hidrólise enzimática.

Tempo (min.) 0 2 5 10 15 20

Absorbância 0,09 0,153 0,234 0,296 0,34 0,414

Concentração (mg %) 0 1,94 7,31 11,42 14,33 19,23

Tabela 2: Concentração de glucose na hidrólise ácida.

Tempo (min.) 0 2 5 10 15 20

Absorbância 0,287 0,399 0,659 0,873 0,965 1,07

Concentração (mg %) 10,82 18,24 35,46 49,63 55,72 62,67

CONCLUSÃO Pode-se concluir que o tempo em que o amido sofre aquecimento é interferido no processo de hidrólise. Tal fato foi provado com os reagentes Lugol e DNS, qual quanto mais a coloração fique escura no primeiro há mais amido livre e quanto mais escuro no segundo, mais glucose tem; portanto houve mais amido livre quanto menor a temperatura para o Lugol e mais monossacarídeo, glucose, quando a temperatura aumentava para o DNS. Esses resultados foram comprovados na hidrólise enzimática, com amilase salivar, e com a ácida, com ácido clorídrico concentrado; porém observou-se maior eficiência na ácida por ser mais agressivo e também fazê-lo em temperatura elevada.

Referências A amilase. Disponivel em: . Acesso em 24 agosto. 2011. Amilase salivar. In Infopédia [Em linha]. Porto: Porto Editora, 2003-2011. [Consult. 2011-08-25]. Disponível em: . Remião J. O. dos R. et al. Bioquímica Guia de Aulas Práticas. 1ª Ed. Porto Alegre: Edipucrs.

Alunas: GESSICA DE QUADROS FERREIRA  _______________________________________________________________  JENNIFER LORENA FERREIRA  _______________________________________________________________  JOSIANE APARECIDA SCHEMBERGER  _______________________________________________________________  KAROLINE IANUXAUSKAS STRUMINSKI  _______________________________________________________________  MARYANA ALBINO CLAVERO  _______________________________________________________________ 

Organizadora: Karoline Ianuxauskas Struminski Data da prática: 23/08/2011 30/08/2011