Relatório aula prática Eletroforese

BIOQUÍMICA AULA PRÁTICA: Eletroforese OBJETIVO: Realizar eletroforese com soro sanguíneo humano (proteína Albumina) Albumina) INTRODUÇÃO TEÓRICA

Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas de  partículas em um determinado gel durante a aplicação aplicação de uma diferença de  potencial.  potencial . As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor  massa irão migrar mais rapidamente que as de maior  massa. massa. Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.A eletroforese normalmente é utilizada para separar   proteínas e moléculas de DNA e RNA. RNA. Foi introduzida introduzida cientific cientificamen amente te em 1939 por A.Tiseli A.Tiselius us e A.E. Kabat Kabat com o objetivo de separar partículas orgânicas. A utilização de eletroforese no uso da rotina laboratorial tem sido importante para determ determin inar ar hemogl hemoglobi obinop nopati atias as e talas talassem semia ias, s, auxíli auxílioo diagnó diagnósti stico co para para doença doençass específicas, por ex.: mieloma múltiplo, além de aplicação em lipidogramas, biologia molecular e enzimopatias. Técnicas mais sensíveis, sensíveis, como é o caso da focalização focalização isoelétrica permitem a separação de frações com excelente resolução.

Eletroforese em gel de agarose Nesse caso, a agarose é utilizada como gel para a eletroforese. A agarose é um   polis polissac sacarí arídeo deo,, e forma forma uma rede rede que que segur seguraa as mol molécu écula lass durant durantee a mig migraç ração ão.. Depend Dependend endoo da conce concentr ntraçã açãoo de agaros agarose, e, têm-se têm-se uma difer diferenç ençaa no gradie gradient ntee de separação. Para preparar um gel de agarose, simplesmente faz-se a mistura entre o pó de agarose e solução tampão (TBE). Após fundir, coloca-se brometo de etidio, que fará o DNA ou RNA "brilhar" quando exposto ao UV. Quando a mistura esfriar o gel estará duro. Esse endurecimento é feito em um local apropriado, o mesmo local onde será feita a corrida da amostra. Um detalhe importante é a colocação do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria poços que serão utilizados para a colocação das amostras. A eletroforese em gel é um dos métodos mais utilizados para analisar misturas de  proteínas ou outras macromoléculas. Os géis utilizados como suportes são de agarose e  poliacrilamida, podem ser preparados com porosidade variável, propiciando separação das moléculas segundo o seu tamanho, alem da sua carga. Proteínas menores migram mais rápido que as maiores, formando uma serie de bandas definidas, que podem ser  visualizadas com por coloração especifica. Uma variante desta técnica, conhecida pela sigla SDS-PAGE, emprega um gel de  poliacrilamida, em presença do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS). O SDS liga3

se a radicais hidrofóbicos das proteínas, causando sua desnaturação. Esta associação, com a maioria das proteínas, segue o mesmo padrão: uma molécula de SDS a cada dois resíduos de aminoácidos. Alem disso, cada molécula de detergente ligada atribui uma carga negativa a proteína desnaturada, mascarando a carga intrínseca da molécula nativa. O resultado, qualquer que seja a proteína, é a formação de um complexo com forma alongada, com a densidade de cargas negativas proporcional ao comprimento da cadeia cadeia pol polipe ipeptí ptídic dica. a. Este Este método método,, porta portanto nto separa separa proteí proteínas nas segund segundoo o seu seu peso peso molecula molecularr. Se a proteína proteína apresentar apresentar estrutur estruturaa quaterná quaternária, ria, suas subunidades subunidades serão desnaturadas e dissociadas por SDS e a eletroforese determinara o peso molecular de cada uma delas o emprego da eletroforese em gel, ao longo das diferentes etapas de um   proce processo sso de purif purifica icaçã çãoo de proteí proteínas nas,, alem alem de permi permitir tir a sua separ separaçã ação, o, forne fornece ce informações adicionais, tais como: o numero de proteínas presentes na preparação, o seu peso molecular e de quantas subunidades são formadas. Imagem do equipamento utilizado para eletroforese em gel

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MATERIAS

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Cuba de eletroforese Placa de petri

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Becker 

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Capilares (com soro sanguíneo humano)

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Papel filtro

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Pinça

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Secador de cabelo

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Gel de agarose

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REAGENTES • •

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Solução tampão tris (9,5) mantém o pH do gel de agarose Ácido acético 5%  Negro de amido Soro sanguíneo humano

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METODOLOGIA 1- Coloca-se 110 mL de solução tampão na cuba. 2- Separa-se o gel de agarose da placa de acrílico. 3- Aplica-se o soro no gel de agarose com microcapilar. 4- Coloca-se o gel de agarose agarose na cuba, voltado voltado para baixo, coincidindo coincidindo o lado lado (+) do gel com (+) da cuba e (-) do gel com (-) da cuba. 5- Tampa-se a cuba, liga-se, verifica-se se há formação de bolhas nos cantos (indicam  passagem da corrente elétrica) e deixar por 30 minutos. 6- Desliga-se a cuba. 7- Retira-se o gel de agarose da cuba, eliminando o excesso de tampão das bordas com  papel de filtro. 8- Mergulha-se o gel, voltado para cima, em 100 mL de corante (negro de amido) por  15 minutos (sem agitação). 9- Retira-se o gel de agarose do corante e coloca-se, sempre voltado para cima, em 100 mL de ácido acético a 5% (descorante) COM AGITAÇÃO por 1 minuto. 10- Retira-se o excesso de descorante do gel de agarose e coloca-se a 60°C (usar estufa ou jato de ar), até que a mesmo fique completamente SECO. 11- Colocar o gel de agarose em banhos sucessivos de descolorante (ácido acético 5%), COM AGITAÇÃO e após secar com o uso de secador de cabelo até o fundo ficar  transparente novamente. 12- Proceder à análise qualitativa.

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RESULTADO

*Imagem da Aula prática:

*Imagem internet “eletroforese “eletroforese Albumina”.

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OBSERVAÇÕES •

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As proteínas apresentam agrupamentos de cargas positivas e negativas, provenientes dos aminoácidos que as constituem. As cargas são resultadas da ligação ou perda de prótons Os prótons (H +) são íons com carga positiva. Alguns grupos são neutros e ao receberem um próton, tornam-se positivos (é o caso do grupo -NH 2, que, ligando-se a prótons, é convertido a -NH 3+). Outros grupos são neutros, mas, ao perderem um  próton, tornam-se negativos negativos (é o caso do grupo-COOH, que se converte em -COO - ). Estas perdas e adições dependem do pH do meio em que a proteína se encontra.

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Uma propriedade das cargas elétricas em solução é que quando uma diferença de   potencial é aplicada à solução - ou seja, quando os pólos de uma bateria são conectados à solução – as cargas positivas são atraídas pelo pólo negativo e as cargas negativas, pelo pólo positivo, deslocando-se em direção a eles.

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A principal motriz para o movimento das cargas em solução é a diferença de  potencial. Conseqüentemente, quanto maior a intensidade da voltagem aplicada, maior será a velocidade com que as cargas se dirigem ao pólo de sinal oposto.

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Dess Dessaa forma forma,, quan quanto to maio maiorr for for a carg cargaa da macr macrom omol oléc écul ula, a, maio maiorr será será a sua sua velocidade de migração eletroforética.

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O tamanho da macromolécula também influi decisivamente na sua velocidade de migração. Isso porque existe um componente friccional entre a macromolécula, o solvente, o suporte e os demais íons em solução que faz com que quanto maior a macromolécula, menor a sua velocidade de migração em direção ao pólo de sinal oposto.

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CONCLUSÃO A aula foi satisfatória, pois conseguimos realizar a atividade proposta e conclui-se que: Os métodos de eletroforese convencionais são baseados na habilidade de um gel separar moléculas, com base no tamanho, sob a influência de um campo elétrico unidirecional. Em contraste, utilizam-se sucessivos campos elétricos alternados que forçam as moléculas a mudarem continuamente continuamente a direção de migração. A separação é baseada, provavelmente no fato que as moléculas maiores mudam de direção mais lentamente que as menores. Entretanto, o mecanismo preciso da separação ainda não é totalmente conhecido, embora seja objeto de numerosos estudos.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS • • •

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http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel http://www.ciencianews.com.br/eletroforeses.htm Marzzoco, Anita e Torres, Bayardo Baptista, Bioquímica Básica, 2ª edição, Rio de Janeiro, 1999, Editora Guanabara Koogan S.A. http://www.unitau.br/scripts/prppg/biocienc/downloads/comparatecmolec-N22002.pdf 

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