RELÁTORIO 1

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA QBQ-0116: VETERINÁRIA - ESTRUTURA DE BIOMOLÉCULAS E METABOLISMO

Relató rió 1 Relató

CINÉTICA DA INVERTASE 

Grupo: André Pegoraro Poor – Poor – Nº USP: 8020380 Fábio Shibuya – Shibuya – Nº USP: 8020150 Gabriel Prohaska – Prohaska – Nº USP: 8072405 João Cont Júnior – Júnior  – Nº USP: 8020309

INTRODUÇÃO Enzimas são catalisadores biológicos de estrutura proteica ou formados por RNA (ribozima). Como todas as proteínas, são sintetizadas pelas próprias células. Sua presença nas células torna possível a ocorrência, a velocidades apreciáveis, de reações cujas velocidades seriam desprezíveis na sua ausência. Além disso, como as enzimas apresentam alto grau de especificidade, ocorrerão em uma célula, dentre todas as reações potencialmente possíveis, apenas aquelas reações para as quais a célula possua enzimas específicas, garantindo a organização e a manutenção da vida celular. A enzima que será estudada é a invertase, que catalisa a hidrólise da sacarose. A Cinética Enzimática estuda os mecanismos de reações químicas catalisadas por enzimas. Para que ocorra uma reação, as moléculas do reagente precisam atingir um estado de maior energia. Essa energia adquirida é chamada Energia de ativação. A redução no valor da energia de ativação pode ser obtida pela presença de catalisadores (enzimas), fato que vai acelerar a velocidade da reação. A ligação da enzima com o substrato (reagente) dá-se em uma região bem determinada da enzima, chamada de sítio ativo. Essa região se caracteriza como uma cavidade revestida por cadeias laterais de aminoácidos, algumas das quais ajudam a ligar o substrato e outras que participam diretamente da catalise. Ainda mais, a ligação do substrato ao sítio ativo propicia a sua correta orientação e sua aproximação, favorecendo a reação, que passa a depender muito menos dos choques casuais de uma reação na catalisada por enzimas. Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo seu substrato a partir da reação que catalisa, utilizando um valor Km, que é a concentração de substrato necessária para se atingir metade da velocidade máxima (Vmáx/2) da reação catalisada pela enzima em questão. Um modelo da reação onde a enzima interage com o substrato está fornecido abaixo: E+S

ES

E+P

Onde E é a enzima, S é o substrato, ES é o complexo enzima-substrato e P é o produto da reação. Observe que a enzima é devolvida ao meio na mesma proporção em que foi utilizada. Michaelis e Menten, com essas considerações, desenvolveram a expressão de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente:

V0 = VMáx . [S] / KM + [S]

A equação de Michaelis-Menten é a equação de uma hipérbole retangular; portanto, os valores exatos de VMáx nunca são atingidos, pois a curva tem assíntota no valor VMáx do eixo V0. Mesmo boas aproximações devem ser obtidas com concentrações tão altas de substrato que são difíceis de conseguir experimentalmente, o que acaba impossibilitando também a determinação de KM.

O problema da determinação de VMáx e KM pode, entretanto, ser resolvido com a transformação algébrica da equação de Michaelis-Menten. Essa transformação, formulada por Lineweaver e Burk, é obtida tomando o inverso daquela equação:

1/V0 = KM + [S] / VMáx . [S] 1/V0 = (KM / VMáx ) . 1/[S] + 1/VMáx

Imagem: Bioquímica Básica – Anita Marzzoco e Bayardo B. Torres.

OBJETIVOS Estudar as influências das concentrações de enzima e substrato na velocidade de uma reação enzimática, examinar as curvas obtidas experimentalmente e calcular os parâmetros cinéticos

VMáx e KM.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1) Construção da curva padrão (Experimento A)

Distinção de seis tubos de ensaio, adicionando reagentes de acordo com a tabela a seguir:

Tubos

Branco 1 2 3 4 5

a) b) c) d) e)

Solução padrão redutora (mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Solução tampão (mL)

Reagente DNS (mL)

Absorbância (540nm)

Sacarose hidrolisada ( mols)

2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0

2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

0,000 0,036 0,199 0,331 0,491 0,620

0,000 1,200 2,400 3,600 4,800 6,000

Após a adição do DNS, colocar os tubos em banho-maria fervente por dez minutos. Após este tempo, esfriar em agua corrente e adicionar 16mL de água destilada. Agitar com inversão da posição na vertical por três vezes. Ler as absorbâncias a 540nm contra o branco. Construir o gráfico absorbância x concentração de sacarose hidrolisada Curva Padrão.

Curva padrão 7.000     )     l    o    m6.000    u     (    a 5.000     d    a 4.000    s    i     l    o    r 3.000     d    i     h 2.000    e    s    o    r 1.000    a    c    a 0.000    S

0.620 0.491 0.331 0.199 0.036

0.000 0.000 0.100

0.200

0.300

0.400

Absorbância (540nm)

0.500

0.600

0.700

2) Efeito da concentração da enzima (Experimento B)

Distinção de sete tubos de ensaio, adicionando reagentes de acordo com a tabela a seguir: Tampão pH 4,77 (mL)

Solução enzima (mL)

Branco 1

Sacarose 5% em tampão (mL) 1,0 1,0

1,0 0,9

0,1

0,00 12,5 . 10-3 M

0,000 0,048

Sacarose hidrolisada por min ( mol/min) 0,00 1,31

2

1,0

0,7

0,3

37,5 . 10-3 M

0,033

1,19

3

1,0

0,5

0,5

62,5 . 10-3 M

0,111

1,82

4

1,0

0,3

0,7

87,5 . 10-3 M

0,144

2,1

5

1,0

0,1

0,9

112,5 . 10-3 M

0,289

3,28

6

1,0

-

1,0

125 . 10-3 M

0,275

3,17

Tubos

Concentração Absorbância da enzima (540nm) ( M)

Obs.: a adição da enzima deve ser feita com os tubos arraigados em gelo. a) Após a adição da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e colocá-los imediatamente e simultaneamente em banho-maria a 37ºC por cinco minutos. b) Transcorrido esse tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo e adicionar a cada tubo 2mL de DNS. c) Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar dez minutos. d) Findo este tempo, esfriar os tubos em água corrente e adicionar 16mL de água destilada em cada tubo e agitar com inversão da posição na vertical por t rês vezes. e) Ler as absorbâncias a 540nm. f) Fazer o gráfico colocando a concentração da enzima (M) nas abscissas e a velocidade de hidrólise expressa em mols de sacarose hidrolisada por minuto nas ordenadas. Dados: Concentração da solução estoque da enzima = 20 g/mL; Peso Molecular da invertase = 80.000 g/mol. I) As concentrações da enzima nos tubos foram calculadas da seguinte maneira:

80.000 g -------- 1 mol 20 g ------------ x



x= 0,25 nanomol

0,25 nanomol ------- 1 mL = 10 -3L y-------------------- 1 L CV(inicial) = CV(final)



y= 0,25 mol/L

Exemplo para o tubo 1:

0,25 (M) x 100 . 10-6 (L) = CTubo 1 x 2 . 10-3 (L)

CTubo 1 = 12,5 . 10-3 M Desse modo, foi calculada as concentrações em todos os tubos, variando-se apenas o volume da solução de enzima. Assim, como o volume final e a concentração inicial são sempre constantes, pode-se escrever: CTubo x = k . VSolução enzima em x

II) A sacarose hidrolisada por minuto pode ser calculada por meio da equação da reta da Curva padrão.

A fórmula genérica de uma reta é dada por y=ax+b; tomando-se os dados do gráfico, constrói-se um sistema para descobrir as incógnitas a (coeficiente angular) e b (coeficiente linear). 0,620=6,0a + b 0,036=1,2a + b



a= 0,122 e b= - 0,112

Logo, a equação da reta será: y = 0,122x  – 0,112 , em que y é a absorbância e x é a sacarose hidrolisada por minuto. Exemplo para o tubo 1: y = 0,122x  – 0,112

 0,048

= 0,122x  – 0,112  x = 1,31

A sacarose hidrolisada no tubo 1 é de 1,31 mol/min.

Concentração da enzima x velocidade da reação     ) 3.5    n    i    m 3     /     l    o 2.5    m    u     ( 2    a     d    a 1.5    s    i     l    o    r 1     d    i     h    e 0.5    s    o    r 0    a    c    a    S

112.5 125

87.5

62.5 12.5

0

37.5

20

40

60

80

Concentração da enzima (uM) x

100

120

140

10 -3

Pelo gráfico, nota-se que a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima.

3) Efeito da concentração de substrato (Experimento C)

Distinção de sete tubos de ensaio, adicionando os reagentes de acordo com a tabela a seguir: Sacarose Tampão Solução Concentração Absorbância Sacarose Tubos 5% em pH 4,77 enzima sacarose (540nm) hidrolisada tampão (mL) (mL) por min ( M) (mL) ( mol/min) Branco 1,0 1,0 77 0,000 0,000 1 0,05 1,45 0,5 3,85 -0,025 0,713 2 0,1 1,4 0,5 7,7 -0,009 0,844 3 0,3 1,2 0,5 23,1 0,051 1,340 4 0,5 1,0 0,5 38,5 0,045 1,290 5 0,7 0,8 0,5 53,9 0,028 1,150 6 1,0 0,5 0,5 77 0,066 1,460

1/[S]

1/ V0

0,0130 0,2600 0,1300 0,0430 0,0260 0,0180 0,0130

0,000 1,400 1,180 0,746 0,775 0,870 0,685

Obs.: a adição da enzima deve ser feita com os tubos arraigados em gelo. a) Após a adição da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e colocá-los imediatamente e simultaneamente em banho-maria a 37ºC por cinco minutos. b) Transcorrido esse tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo e adicionar a cada tubo 2mL de DNS. c) Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar dez minutos. d) Findo este tempo, esfriar os tubos em água corrente e adicionar 16mL de água destilada em cada tubo e agitar com inversão da posição na vertical por três vezes. e) Ler as absorbâncias a 540nm. f) Fazer um gráfico da velocidade x concentração inicial do substrato. Dados: Concentração da solução estoque da enzima = 40 g/mL; Peso molecular da sacarose: 324,24g/mol. I)

A concentração da sacarose foi calculada da seguinte forma:

Como a solução sacarose tampão está em 5% (massa/volume), em 1mL dessa solução há 50 microgramas de sacarose. Assim: 324,24 g ----------------- 1 mol 50 g ---------------------- x  x = 0,154 mol 0,154 mol -------------- 1 mL = 10 -3 y------------------------- 1 L

CV(inicial) = CV(final)



y = 0,154 . 103 M = 154 M

Exemplo para o tubo branco: 154M) x 10-3 (L) = CTubo branco x 2 . 10-3 (L)

CTubo branco = 77 M

II)

A sacarose hidrolisada por minuto foi calculada da mesma forma que no experimento B, por meio da equação da reta da Curva padrão.

Exemplo para o tubo 1: y = 0,122x – 0,112  -0,025 = 0,122x – 0,112  x = 0,713 A sacarose hidrolisada no tubo 1 é de 0,713 mol/min.

Concentração do substrato x velocidade da reação 1.60

77

    )    n    i 1.40    m     /     l    o1.20    m    u     (    a 1.00     d    a    s 0.80    i     l    o    r     d    i 0.60     h    e    s 0.40    o    r    a    c 0.20    a    S

23.1

38.5 53.9

7.7 3.85

77

0.00 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Concentração de sacarose (uM)

Pelo gráfico, nota-se que a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração do substrato.

Gráfico de Lineweaver e Burk 1.600 y = 3.643x + 0.5462 R² = 0.5868

1.400 1.200 1.000    o    V     / 0.800    1

0.600 0.400 0.200 0.000 0.0000

0.0500

0.1000

0.1500 1/[S]

0.2000

0.2500

0.3000

Equação da reta do gráfico de Lineweaver e Burk: y = 3,643x + 0,5462 Para determinar VMáx , compara-se essa equação desta reta com a equação de LineweaverBurk. Dessa forma, igualam-se as duas parcelas: 0,5462 (coeficiente linear) = 1/ VMáx

VMáx= 1,83 M Para determinar KM iguala-se: 3,643 (coeficiente angular) = KM / VMáx

KM = 6,66

RESULTADOS E CONCLUSÕES Analisando os dados do experimento B, nota-se que alguns valores da absorbância foram incoerentes. Podemos observar que a absorbância do tubo 1 foi maior do que no tubo 2, quando este último é que deveria ser maior, pois as absorbâncias devem aumentar gradualmente com o aumento do volume da solução enzima. No experimento 3, os valores de absorbância foram absurdos, com valores negativos. Vamos comparar os dados corretos de absorbância, obtidos pelo grupo da aluna Érica Baumel, com os dados obtidos pelo nosso grupo: Experimento B

Nosso grupo

Érica Baumel

Absorbância Absorbância (540nm) (540nm) 0,000 0,000 0,048 0,009 0,033 0,067 0,111 0,097 0,144 0,123 0,289 0,189 0,275 0,243

Experimento C

Nosso grupo

Érica Baumel

Absorbância Absorbância (540nm) (540nm) 0,000 0,000 -0,025 0,0468 -0,009 0,0540 0,051 0,0935 0,045 0,0706 0,028 0,1619 0,066 0,2127

Devido a essas aberrações nas absorbâncias, o desenvolvimento dos cálculos e a construção dos gráficos foram afetados. Portanto as curvas obtidas, bem como os valores de KM e VMáx, não correspondem aos encontrados na literatura científica.

A causa para a aberração dos dados obtidos provavelmente está no procedimento experimental: erro durante a pipetagem, a enzima pode ter ficado na parede do tubo e não reagiu com o substrato; erro no volume adicionado de alguma das substâncias; os tubos foram deixados por tempo insuficiente ou excessivo nos banhos-maria.

QUESTÕES COMPLEMENTARES 1) O substrato utilizado foi a sacarose. A reação catalisada pela enzima invertase é a hidrolise da sacarose. Os produtos são glicose e frutose. 2) Sim, o tubo controle foi o denominado branco. Nessa reação, a função do tubo controle seria medir a velocidade da reação sem a enzima ou sem o substrato. Nos dois casos a velocidade é nula. 3) Para que, durante a adição de todas as substâncias, não ocorra atividade enzimática. Na temperatura próxima de 0°C não há atividade das enzimas. 4) A glicose (produto da reação) reduz o DNS fornecendo um produto de cor característica, cuja formação pode ser acompanhada a 540nm. Por isso as absorbâncias são lidas sob este comprimento de onda. 5) Nos experimentos B e C nota-se que a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima e do substrato. Entretanto as curvas obtidas neste experimento não correspondem às encontradas na literatura cientifica, devido aos erros cometidos no procedimento experimental. Para medir o efeito do pH, basta fazer um experimento parecido com os anteriores: Distinguir alguns tubos de ensaios e adicionar volumes constantes de reagente DNS, solução enzima, solução sacarose 5% e solução tampão, variando apenas o pH desta última. Após fazer todos os procedimentos (banhos-maria, resfriamento, adição de água destilada e leitura das absorbâncias) deve-se construir um gráfico da concentração da sacarose hidrolisada (reação catalisada pela enzima) versus variação do pH. 6) A enzima possui atividade ótima num pH em torno de 7,0. Ao adicionar o reagente DNS, que tem pH elevado, a atividade enzimática é comprometida, fazendo a reação parar.

BIBLIOGRAFIA Todas as informações da INTRODUÇÃO e de todo o desenvolvimento do trabalho, bem como algumas imagens, foram obtidas no livro Bioquímica Básica – Anita Marzzoco e Bayardo B. Torres –  Editora Guanabara/Koogan.