Relatório 1

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular  Roteiro Nº 1 – Titulação Potenciométrica de  Aminoácidos.

Grupo 3 Érica L. Marçal 404403 Guilherme K. Zanini 404535 Guilherme N. Giusti 404262 Jéssica H. Bonomo 404454 Marcos P. Santos 404560 Rafael A. L. Franco 404551

São Carlos 2012

INTRODUÇÃO ............................................................. ................................................................................................................................ ................................................................... 1 OBJETIVOS .................................................................................................... ..................................................................................................................................... ................................. 5 METODOLOGIA................................................................................................................... METODOLOGIA................................................ .............................................................................. ........... 5 Materiais ................................................................ ................................................................................................................................... ................................................................... 5 Determinação do pka de um ácido fraco ...................................................................... .............................................................................. ........ 5 Titulação potenciométrica de aminoácidos .......................................................................... .......................................................................... 5 Métodos .............................................................................................................. .................................................................................................................................... ...................... 6 Determinação do pka de um ácido fraco ...................................................................... .............................................................................. ........ 6 Titulação potenciométrica de aminoácidos .......................................................................... .......................................................................... 7 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................... ........................................................................................................... ........ 8 Procedimento 1 : determinação do pKa de um ácido fraco. .................................................... 8 Procedimento 2 : titulações t itulações de aminoácidos .................................................................... ............................................................................ ........ 8 CONCLUSÃO ............................................................... ................................................................................................................................ ................................................................. 16 REFERÊNCIAS ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... 16

INTRODUÇÃO  As proteínas são macromoléculas com inúmeras funções nos organismos vivos, tanto estrutural como funcional. Elas são formadas por  pequenas unidades chamadas de aminoácidos, cuja característica individual influencia nas propriedades das mesmas. Eles são constituídos de um grupamento amina, de um grupamento carboxila e de uma cadeia lateral, que é específica para cada um dos 20 aminoácidos. Tais unidades são ligadas pela peptidil aminoacil tranferase, cujo produto é uma ligação sem mobilidade formando um grupamento amida. A ligação ocorre pela remoção dos elementos constituintes da água de um grupo alfa carboxila e de um grupo alfa amino de dois aminoácidos, caracterizando-se em uma reação de condensação. Os polipeptídeos, para desempenharem suas funções biológicas, devem tomar  conformações específicas, provenientes das interações entre os resíduos de aminoácidos com o meio e com eles mesmos, ou seja, sua sequência é fundamental para o correto enovelamento proteico. Tem-se, portanto, que a cadeia lateral dos aminoácidos desempenha um papel primordial para que as proteínas cumpram suas funções. Os aminoácidos são divididos em grupos que levam em consideração sua cadeia lateral. São eles: Não polares e alifáticos, apolares aromáticos, polares não carregados, polares carregados negativamente (ácidos), polares carregados positivamente (básicos).

Estes grupamentos são ligados ao

carbono alfa, que realiza suas quatro ligações com o grupamento amina, carboxila, cadeia lateral e hidrogênio, configurando-se como um centro quiral. Sendo assim, observa-se estereoisômeros na conformação L, não só nos polipeptídeos, mas em quase todos os compostos biológicos quirais. Para que o organismo mantenha suas funções biológicas devidamente ajustadas, o meio em que elas ocorrem deve estar adequado. O potencial hidrogeniônico, ou pH, é um fator que influencia diretamente no seu bom funcionamento, pois este determina as condições que as proteínas estarão,

cataliticamente ativas ou conformacionalmente corretas. pHs inadequados podem levar a desnaturação proteica e a consequente perda de atividade. O termo “pH” indica a quantidade, mediante a uma escala logarítmica, de íons

hidrogênio na solução em estudo. Ele é definido como sendo o co-logaritmo da concentração de H + e nos permite saber também a concentração de OH -. Seu valor neutro é igual a 7, considerando concentrações iguais de H + e OH- , baseado no produto iônico da água, variando até 14, configurando um meio básico, e até 1, configurando um meio ácido. Sua aferição pode ser feita através de corantes como a fenolftaleína, que muda sua coloração através da perda de prótons, mas existem maneiras mais precisas e eficientes para fazêlo, como os pHmetros. Estes equipamentos possuem um eletrodo de vidro sensível a íons de hidrogênio, que, ao se associarem ao mesmo, emitem um sinal elétrico, comparado com o sinal enviado de uma solução com o pH precisamente conhecido, então o equipamento amplifica estes pulsos e os transforma em valores. Devido a isso, é importante que o pHmetro esteja calibrado corretamente dentro da faixa de pH que será utilizado, pois os valores são obtidos basicamente por comparação.  As proteínas são sintetizadas no citosol celular e depois seguem para seus respectivos locais de ação. Observa-se que desde o início elas estão imersas em soluções, sejam citosolicas ou não. Isso quer dizer que estão constantemente sob ação da concentração de íons hidrogênio e como são essenciais para a sobrevivência do organismo, métodos foram desenvolvidos para que os danos aos polipeptídeos pudessem diminuir caso a concentração de H+ mudasse de forma prejudicial. Sobretudo, as enzimas possuem condições ótimas de funcionamento, então o pH não é a única variável importante para evitar a desnaturação, mas também é necessário um ambiente favorável à atividade enzimática. Tudo isso é garantido baseado no equilíbrio entre a concentração de um ácido fraco e sua base conjugada.  A definição de ácido e base aqui utilizada é a desenvolvida por  Bronsted Lowri, na qual os compostos capazes de doar prótons são os ácidos, e os capazes de recebê-los são as bases. Assim sendo, um sistema tampão é aquele capaz de minimizar as mudanças de pH caso pequenas quantidades de H+ e OH - sejam adicionadas. Um tampão é, portanto, constituído por um ácido

fraco e sua base conjugada, e a reação de conversão entre esses dois compostos é reversível. Quando as concentrações de ácido e base forem iguais, então teremos o máximo poder tamponante, pois caso seja colocado íons de hidrogênio ou hidroxila, estes reagirão com seu respectivo composto não ficando no meio ocasionando alterações no pH. Cada par ácido-base conjugada possui uma região de pH onde há o tamponamento. Um experimento para evidenciar as regiões tamponantes é a titulação ácido-base, na qual é adicionado o devido íon (H + ou OH- ) a uma solução contendo o equilíbrio ácido- base. Seu gráfico é característico e a região tamponante é evidenciada pelo platô formado. O platô se encontra na região de pH numericamente igual ao pKa do ácido (constante de dissociação ácida). Percebe-se que estas curvas se comportam de modo igual, e podem ser  descritas por uma relação matemática desenvolvida por Henderson e Hasselbach, que calcula o ph fazendo uso do pk respectivo e das concentrações de ácido e base conjugado. Nos seres humanos, fluidos como o sangue fazem uso das propriedades de atenuação da variação de pH de certos pares ácido e base conjugada. Os principais tampões biológicos são o fosfato, bicarbonato e as próprias proteínas. Os aminoácidos também se comportam como ácidos e bases e consequentemente podem configurar regiões tamponantes. Um aminoácido monoamínico

e

monocarboxilico

cuja

cadeia

lateral

não

apresente

grupamentos ionizáveis, possui duas regiões nas quais a variação do pH é amenizada caso adicione-se pequenas quantidades de ácido ou base. Isto acontece, pois os grupos carboxila e amina, quando protonados, são capazes de perder esses prótons configurando um equilíbrio acido e base conjugada. Essa desprotonação ocorre em diferentes faixas de pH para cada aminoácido, e na região do platô tem-se que o pKa é igual ao pH. Isto significa que há um valor limite de pH o qual abaixo dele o grupo funcional não perde seu próton, levando então à diversidade de regiões tamponantes pelos diferentes aminoácidos. Além disso, a forma com carga total nula, ou seja, o grupamento carboxila desprotonado (carga negativa) e o grupamento amina protonado (carga positiva), chamada de Zwitterion e é evidenciada pelo ponto de inflexão entre os dois platôs do gráfico de titulação. Trata-se de um anfótero e

comporta-se tanto como base quanto como ácido e não exerce qualquer tipo de tamponação, esta só ocorre no platô referente às dissociações (valor do pKa do respectivo grupamento ± 1). O pH nesta inflexão central é chamado de pI ou ponto isoelétrico, ou seja, o pH necessário para tornar o aminoácido com carga líquida nula. Sendo ele definido matematicamente pela média aritmética dos pKas dos quais ele está entre. Existem também aminoácidos cuja cadeia lateral pode se ionizar, e o gráfico de titulação destes aminoácidos deixa de se assemelhar com o da glicina como no caso dos monoaminicos e monocarboxilicos, e possuem um terceiro platô tamponante referente a ionização deste grupamento presente na cadeia lateral do aminoácido. Isto implica também em um novo valor de pKa e na mudança do pI. Esta mudança no pI é utilizada para a identificação do tipo de grupo ionizável presente na cadeia lateral. Se este for uma carboxila, o pI será mais baixo pois seu pKa é mais baixo, ou seja, é mais facilmente ionizável. O único aminoácido com capacidade tamponante próximo a neutralidade é a histidina que possui no seu grupamento R o imidazol com pKa aproximadamente igual a 6, e seguindo a regra de que a região tamponante é aquela na qual o pH é igual a ± 1 do pKa, tem-se que ela tampona desde o pH 5 até o pH 7.  A solubilidade de uma molécula depende da interação entre os grupos polares dos aminoácidos, ou de cadeias laterais, quando estas são polares, com as moléculas de água através de pontes de hidrogênio. Vários fatores podem modificar a ionização destes grupos e, logo, a interação da molécula com o meio. Concentrações de íons, altas temperatura, valores extremos de pH e exposição a raios UV alteram as interações dos grupos reativos entre si e com o meio, diminuindo-as e podendo precipitar aminoácidos e proteínas. Pode-se dizer então que a presença de cargas ao longo da molécula é um dos principais fatores que afetam a solubilidade das mesmas, logo deduz-se que no ponto isoelétrico, no qual as cargas positivas e negativas estão em equilíbrio, a solubilidade da molécula é mínima, pois as forças de repulsão das moléculas e

a força de interação com o meio ficam muito fracas e com isso o composto tende-se a precipitar.

OBJETIVOS  A atividade realizada foi dividida em dois procedimentos: Procedimento 1 : determinação do pKa de um ácido fraco No primeiro o objetivo era encontrar o pKa do tampão ácido acético/acetato em diferentes volumes de ambos os reagentes em cada uma das cinco soluções preparadas utilizando a equação de HandersonHasselbalch, com as concentrações do ácido e da base conjugada previamente calculadas. Procedimento 2 : titulações de aminoácidos Para o segundo procedimento pretendia-se titular quatro aminoácidos: um neutro (glicina), um carregado positivamente (histidina), um carregado negativamente (glutamato) e um desconhecido; e obter seus gráficos, nos quais é possível observar seus pKs e pontos isométricos.

METODOLOGIA Materiais Determinação do pka de um ácido fraco 

Solução de acetato de sódio (0,1 mol/L)



Solução de ácido acético (0,1 mol/L)



pHmetro



5 Fálcon 50ml



2 provetas de 10ml

Titulação potenciométrica de aminoácidos



Solução de Glicina (0,1 mol/L)



Solução de Histidina (0,1 mol/L)



Solução de Ácido Glutâmico (0,1mol/L)



Solução de aminoácido desconhecido (0,1 mol/L)



Solução de NaOH (0,5 mol/L)



3 Béqueres de 150 ml



3 provetas de 100 ml



Phmetro



Agitador magnético



Barra magnética



Bureta de 25 ml

Métodos Determinação do pka de um ácido fraco  As soluções de acetato de sódio e ácido acético foram adicionadas em cada um dos fálcons de forma a obter volumes de 20ml de solução final, conforme valores na tabela abaixo.Para tal procedimento, as provetas foram utilizadas como aparelhos de medição.

 Ácido

 Acetato de

acético

Sódio

(ml)

(ml)

1

4

16

2

8

12

3

10

10

4

12

8

5

16

4

Fálcon

Tabela 1 – Volumes do ácido fraco

O próximo passo consistiu na medição dos Phs das soluções preparadas, sendo o pHmetro devidamente limpo antes de cada medição. Posteriormente, foram realizados os cálculos (anexo1) referentes às concentrações de acetato de sódio e ácido acético em cada solução de 20ml presente nos fálcons, bem como os referentes ao pka do composto. Esses últimos cálculos foram efetuados utilizando-se a equação de HandersonHasselbalch.

Titulação potenciométrica de aminoácidos  As soluções de aminoácidos, em volume de 50ml, foram retiradas de béqueres (presentes sobre a bancada) com auxílio de provetas, sendo colocadas, individualmente, em béqueres de 150 ml. Posteriormente, foi realizada a calibração da bureta, com a solução de NaOH 0,5 mol/L. A barra magnética foi posta no béquer, contendo a solução do aminoácido a ser titulado, sendo este submetido a agitação. Na mesma solução, introduziu-se os eletrodos do Phmetro, para início da leitura dos Phs.  A primeira medição foi realizada sem a presença de NaOH, sendo as demais realizadas a cada adição de 0,5ml do hidróxido de sódio. A titulação prosseguiu até que o pH da solução dos aminoácidos atingisse o valor  aproximado 12, salvo a do aminoácido desconhecido, cujo valor chegou a cerca de 13. Por último, os dados obtidos foram utilizados para confecção de gráficos (anexo 2), com o intuito de analisar se as curvas de titulação desses aminoácidos, bem como seus respectivos pkas e regiões tamponantes; além da identificação do aminoácido desconhecido.  As titulações foram referentes aos aminoácidos: ácido glutâmico, aminoácido desconhecido e histidina, sendo realizados os mesmos passos para todos. Os dados presentes neste relatório referentes à titulação da glicina foram obtidos de outrem.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Procedimento 1 : determinação do pKa de um ácido fraco. Calculadas as concentrações de acetato e ácido acético nas soluções, aferidos os pHs das mesmas e calculando seus pKas, obtivemos a tabela abaixo: [Acetato] mol/L 8 x 10-2 6 x 104 x 105 x 10-2 2 x 10-

Falcon 1 2 3 4 5

[Ácido  Acético]mol/L 2 x 10-2 4 x 105 x 106 x 10-2 8 x 10-

pH

pKa calculado

5,24 4,85 4,66 4,51 4,09

4,64 4,67 4,66 4,69 4,69 Tabela 2 - Reação tampão

Os pKas encontrados tiveram valores próximos entre si e semelhante ao já conhecido para o tampão ácido acético/acetato (4,76), o que era esperado.  Apesar do pKa de um tampão não se alterar, obtivemos esses resultados com leves divergências por conta de escolha de protocolo. Utilizamos, para medir os volumes dos reagentes, materiais que podem abrir  maior margem para erro de medida. Além disso, um maior N amostral apresentaria melhor precisão.

Procedimento 2 : titulações de aminoácidos  Através das titulações já descritas obtivemos dados suficientes para construção dos gráficos relativos aos aminoácidos. Os dados são apresentados nas tabelas a seguir:

Glicina NaOH (ml)

pH 0

1,13

NaOH (ml) 6,5

pH 1,38

NaOH (ml) 13

pH 1,86

NaOH (ml) 19,5

pH 3,03

NaOH (ml) 26

pH 10,18

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6

1,14 1,15 1,17 1,19 1,2 1,22 1,25 1,27 1,29 1,31 1,33 1,36

7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5

1,4 1,43 1,46 1,49 1,52 1,56 1,59 1,63 1,67 1,71 1,76 1,81

13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 17 17,5 18 18,5 19

1,92 1,99 2,06 2,13 2,21 2,29 2,39 2,47 2,57 2,67 2,77 2,88

20 3,17 26,5 20,5 3,36 27 21 3,64 27,5 21,5 4,53 28 22 8,6 28,5 22,5 9,02 29 23 9,3 29,5 23,5 9,5 30 24 9,65 24,5 9,8 25 9,92 25,5 10,04 Tabela 3 - Dados da Glicina

10,3 10,44 10,63 10,86 11,19 11,56 11,87 12,07

Histidina NaOH (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11

pH 0,8 0,8 0,8 0,81 0,83 0,84 0,85 0,87 0,88 0,9 0,92 0,94 0,96 0,98 1 1,02 1,04 1,06 1,09 1,11 1,14 1,17 1,19

NaOH (ml) 11,5 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20 20,5 21 21,5 22 22,5

pH 1,22 1,25 1,28 1,31 1,34 1,37 1,42 1,43 1,48 1,51 1,55 1,59 1,63 1,67 1,71 1,76 1,8 1,85 1,91 1,96 2,02 2,09 2,16

NaOH (ml) 23 23,5 24 24,5 25 25,5 26 26,5 27 27,5 28 28,5 29 29,5 30 30,5 31 31,5 32 32,5 33 33,5 34

pH 2,23 2,31 2,41 2,51 2,66 2,85 3,16 3,78 4,76 5,11 5,32 5,48 5,6 5,7 5,8 5,89 5,98 6,06 6,13 6,2 6,28 6,37 6,42

NaOH (ml)

pH

NaOH (ml)

34,5 6,49 46 35 6,58 46,5 35,5 6,67 47 36 6,76 47,5 36,5 6,87 48 37 6,99 48,5 37,5 7,13 49 38 7,32 49,5 38,5 7,56 50 39 7,86 50,5 39,5 8,1 51 40 8,31 51,5 40,5 8,49 52 41 8,62 52,5 41,5 8,74 53 42 8,84 53,5 42,5 8,93 54 43 9,01 54,5 43,5 9,09 55 44 9,16 44,5 9,24 45 9,32 45,5 9,38 Tabela 4 - Dados na Histidina

pH 9,46 9,53 9,6 9,68 9,75 9,77 9,93 10,03 10,14 10,31 10,44 10,69 10,93 11,29 11,51 11,72 11,84 11,96 12,04

Glutamato NaOH (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

pH 0,8 0,82 0,84 0,86 0,88 0,9 0,92 0,94 0,96 0,98 1,01 1,04 1,06 1,09 1,12 1,15 1,18 1,21 1,25 1,28 1,32

NaOH (ml) 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20 20,5

pH 1,35 1,4 1,44 1,48 1,54 1,58 1,63 1,68 1,73 1,8 1,85 1,91 1,97 2,04 2,1 2,16 2,24 2,31 2,38 2,45 2,53

NaOH (ml) 21 21,5 22 22,5 23 23,5 24 24,5 25 25,5 26 26,5 27 27,5 28 28,5 29 29,5 30 30,5 31

pH 2,61 2,7 2,79 2,9 3,02 3,13 3,25 3,36 3,49 3,6 3,69 3,79 3,89 3,97 4,06 4,14 4,23 4,31 4,42 4,51 4,62

NaOH (ml)

pH

NaOH (ml)

31,5 4,74 42 32 4,89 42,5 32,5 5,06 43 33 5,28 43,5 33,5 5,62 44 34 6,22 44,5 34,5 7,87 45 35 8,39 45,5 35,5 8,73 46 36 8,95 46,5 36,5 9,14 47 37 9,2 47,5 37,5 9,3 48 38 9,39 48,5 38,5 9,49 39 9,56 39,5 9,64 40 9,71 40,5 9,79 41 9,87 41,5 9,95 Tabela 5 - Dados do Glutamato

pH 10,03 10,11 10,2 10,3 10,4 10,52 10,67 10,87 11,12 11,4 11,62 11,8 11,93 12,03

Desconhecido NaOH (ml)

pH

NaOH (ml)

pH

NaOH (ml)

pH

NaOH (ml)

pH

NaOH (ml)

pH

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5

0,81 0,82 0,83 0,85 0,87 0,88 0,91 0,93 0,96 0,98 1,01 1,02 1,06 1,08

20 20,5 21 21,5 22 22,5 23 23,5 24 24,5 25 25,5 26 26,5

2,37 2,46 2,54 2,65 2,78 2,88 3,05 3,29 3,67 5,78 7,44 8,01 8,34 8,55

40 40,5 41 41,5 42 42,5 43 43,5 44 44,5 45 45,5 46 46,5

10,61 10,69 10,75 10,82 10,88 10,94 11,01 11,08 11,14 11,21 11,29 11,36 11,44 11,53

60 60,5 61 61,5 62 62,5 63 63,5 64 64,5 65 65,5 66 66,5

12,65 12,67 12,68 12,69 12,71 12,72 12,73 12,75 12,76 12,77 12,78 12,8 12,81 12,82

80 80,5 81 81,5 82 82,5 83 83,5 84 84,5 85 85,5 86 86,5

13,01 13,02 13,02 13,02 13,03 13,03 13,04 13,04 13,05 13,05 13,06 13,06 13,07 13,07

7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5

1,11 1,14 1,17 1,2 1,23 1,26 1,29 1,33 1,36 1,41 1,43 1,49 1,53 1,58 1,63 1,69 1,74 1,8 1,85 1,91 1,97 2,02 2,1 2,16 2,23 2,3

27 27,5 28 28,5 29 29,5 30 30,5 31 31,5 32 32,5 33 33,5 34 34,5 35 35,5 36 36,5 37 37,5 38 38,5 39 39,5

8,68 8,8 8,93 9,02 9,1 9,18 9,21 9,33 9,41 9,44 9,54 9,61 9,68 9,74 9,81 9,88 9,94 10,01 10,08 10,17 10,22 10,3 10,35 10,42 10,49 10,55

47 47,5 48 48,5 49 49,5 50 50,5 51 51,5 52 52,5 53 53,5 54 54,5 55 55,5 56 56,5 57 57,5 58 58,5 59 59,5

11,61 67 12,83 87 11,7 67,5 12,84 87,5 11,77 68 12,85 88 11,85 68,5 12,86 88,5 11,92 69 12,87 89 12 69,5 12,88 89,5 12,06 70 12,89 90 12,12 70,5 12,89 90,5 12,15 71 12,9 91 12,19 71,5 12,91 91,5 12,23 72 12,92 92 12,28 72,5 12,93 92,5 12,31 73 12,93 93 12,35 73,5 12,94 93,5 12,38 74 12,94 94 12,41 74,5 12,95 94,5 12,44 75 12,96 95 12,47 75,5 12,96 95,5 12,49 76 12,97 96 12,52 76,5 12,97 96,5 12,54 77 12,98 97 12,56 77,5 12,98 97,5 12,58 78 12,99 98 12,6 78,5 12,99 98,5 12,62 79 13 12,64 79,5 13 Tabela 6 - Dados do desconhecido

Com esses dados construímos as seguintes curvas de titulação para cada aminoácido, nos quais a região tamponante está evidenciada:

13,07 13,07 13,08 13,08 13,09 13,1 13,1 13,1 13,11 13,11 13,12 13,12 13,12 13,13 13,13 13,13 13,13 13,13 13,13 13,13 13,13 13,14 13,14 13,14

Glicina

Imagem 1 - Curva de titulação da glicina

Histidina

Imagem 2 - Curva de titulação da histidina

Glutamato

Imagem 3 - Curva de titulação do glutamato

Desconhecido

Imagem 4 - Curva de titulação do aminoácido desconhecido

 Apesar de algumas pequenas diferenças, os resultados obtidos foram próximos dos teóricos. O que é esperado levando em conta um possível erro experimental. Durante as curvas de titulação as dissociações dos aminoácidos manipulados foram:

Imagem 5 - Dissociação Glicina

Imagem 6 - Dissociação Histidina

Imagem 7 - Dissociação Glutamato

Imagem 8 - Dissociação Arginina

Os dados teóricos para comparação foram os seguintes:

Aminoácidos Glicina Glutamato Histidina  Arginina

pK1 2,3 2,2 1,8 2,2

pK2 9,6 4,3 6,0 9,0

pK3 9,7 9,2 12,5

Tabela 7 - Dados teóricos. FONTE: Lehninger - Princípios de Bioquímica

 Através da observação das regiões tamponantes e de certa similaridade com a curva teórica pudemos descobrir qual era o aminoácido desconhecido. Primeiramente eliminamos os aminoácidos com apenas dois pKs, pois o gráfico obtido experimentalmente apresentava três platôs. E a partir da análise comparativa dos pHs referentes aos platôs com os pKs dos aminoácidos restantes identificamos que o aminoácido desconhecido era arginina.  Adicionados aproximadamente 10 mL de NaOH, a solução de arginina apresentou opacidade. Após discussão deduziu-se que esse fenômeno davase devido ao fato da arginina ser pouco solúvel iniciando assim precocemente sua precipitação. O efeito foi observado com mais intensidade perto do pI, isso se deve ao fato de a carga líquida total do aminoácido nesse ponto ser zero, diminuindo ainda mais sua interação com a água.

CONCLUSÃO Concluímos que: 



Por se tratar de um tampão, mesmo com concentrações diferentes de ácido e base conjugada, o pKa permanece constante e o pH tem pouca variação . As curvas obtidas pela titulação potenciométrica de cada aminoácido estão próximas do esperado e descobrimos por análise que o aminoácido desconhecido trata-se da arginina.

REFERÊNCIAS NELSON, D. L.; COX, M. Lehninger  – Princípios de Bioquímica. 3ªed. MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioquímica Básica. 2ªed.

Anexo 1

Anexo 2