RELATÓRIO 1 - Purificação do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica
February 7, 2017 | Author: Alexandra Salvado | Category: N/A
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Purificação do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica Bioquímica Experimental I Departamento de Química e Bioquímica Licenciatura em Bioquímica
Docente: Carla Real Afonso Trabalho realizado por: Alexandra Salvado, nº 40267 Andreia Sousa, nº 40261 Telmo Paiva, nº 40243 PL 3
26 e 27 de Setembro de 2011 Ano Lectivo 2011/2012
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Índice Resumo …………………………………………………………………………... 3 Material é Métodos………………………………………………………………. 4 Material …………………………………………………………………. 4 Métodos ………………………………………………………………….. 5 Resultados e Discussão ………………………………………………………….. 12 Conclusão ………………………………………………………………………... 33 Bibliografia ………………………………………………………………………. 35 Anexos …………………………………………………………………………… I
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Resumo Este trabalho laboratorial teve como principal objectivo exemplificar um processo de purificação enzimática através da realização da purificação parcial do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica. Posteriormente à purificação realizaram-se outros objectivos, tais como: a determinação do grau de purificação do enzima (através de uma electroforese SDS-PAGE), a determinação da actividade enzimática de algumas fracções recolhidas durante a cromatografia e, por último, o cálculo do rendimento deste processo. Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Nesta cromatografia usou-se como fase estacionária um permutador catiónico fraco, o CMSephadex G-25 e como fase móvel utilizaram-se dois tipos de tampão com diferentes valores de pH. O primeiro tampão utilizado, o tampão Tris (pH 8,2) foi usado para a lavagem da coluna e para as proteínas de pI inferior a 10 serem eluídas. O segundo tampão, o tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5), foi usado para a eluição das proteínas com pI superior a 10. A lisozima apresenta um pI de 10,7 pelo que foi eluída com o segundo tampão, assim como a avidina, que apresenta um pI de 10. Como também já foi referido, neste trabalho realizou-se também uma electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com o propósito de determinar a pureza do lisozima recolhido, por comparação com um padrão do enzima puro. Como será possível ver mais à frente, nota-se umas marcas de arrastamento no poço do lisozima recolhido, pelo que é sinal da existência de impurezas (nomeadamente outras proteínas). Por fim, é de notar que nas fracções onde as actividades enzimáticas foram superiores é de suspeitar a existência do enzima. O rendimento associado à cromatografia de troca iónica foi de 112,2% e o grau de purificação obtido foi de 2002,7 vezes, os quais são incomportáveis com o esperado, pois foi usada uma absorvância de PCO de outro grupo, visto terem sido os únicos a medi-la.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Material e Métodos Material Cromatografia de troca iónica Coluna Cromatográfica 40 x 2,6 cm Bomba peristáltica Cronómetro Espectrofotómetro UV-Vis Cuvettes de quartzo Aparelho medidor de pH Gaze Material corrente de laboratório
Doseamento da actividade enzimática Homogeneizador de Potter-Elvejam Cuvettes de plástico Pipeta automática Pipeta graduada de 5mL
SDS-PAGE Sistema de polimerização de géis Placas de vidro para electroforese (mini) Tina de electroforese vertical (mini) Espaçadores (0,75mm) e pentes (0,75mm) Fonte de alimentação (500V/150mA) Pipetas automáticas
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Métodos Cromatografia de troca iónica
Montagem da Coluna Num Kitasato, deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na coluna Decantar a maior parte do tampão (75% gel sedimentado e 25% tampão sobrenadante) • Guardar num recipiente com rolha a 4oC Montar a coluna na vertical e ver se está bem fechada Encher a coluna com Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M Abrir a válvula para a entrada do tampão e introduzir cerca de 5-10 mL do tampão anterior. • Manter a sua saída fechada Verter a mistura do gel em tampão na coluna, com a ajuda de um funil e de uma vareta de vidro, até encher completamente Abrir a válvula de saída da coluna, mantendo um caudal de tampão Tris constante (1,6 - 1,8 mL/min Medir o fluxo de tampão através da coluna, medindo o volume eluído em 2 min. • ATENÇÃO: Nunca deixar secar o topo da coluna Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura Equilibrar a coluna através da passagem de um volume de tampão inicial de eluição aproximadamente igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada Medir a altura do gel, assim como o diâmetro da mesma
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Preparação da Amostra Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL
Comprimir a gaze suavemente e o material que passar é o filtrado
Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL
Diluir com 35 mL de Tampão Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (diluição 1/8) Passar a mistura através de uma camada de lá de vidro colocada no interior duma seringa de 10 mL. • O nome do filtrado será Preparado da Claro do Ovo (PCO) Manter o PCO a 4ºC, bem identificado até ao final do trabalho
Aplicação da Amostra
Calibrar um aparelho medidor de pH
Ligar a bomba peristáltica e controlar o fluxo de entrada do tampão para 1,6 - 1,8 mL/min
Parar a eluição da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua saída
Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume total Depois da amostra penetrar toda no gel, abrir a saída da coluna e iniciar a sua eluição. • Cuidado para não secar o gel! Página | 6
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Recolher fracções de 15 mL em diferentes provetas até passar na coluna um volume total de tampão aproximadamente igual ao volume da coluna preparada. • Controlar o fluxo! Medir o volume de pH de cada fracção recolhida. Colocá-las, só depois, em gelo! Proceder à eluição da coluna com tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M Recolher fracções de 10 mL até registar um aumento brusco no seu valor de pH para 8,5 Reduzir, depois, o volume de cada fracção para 5 mL Parar a eluição da coluna quando o valor de pH das fracções estabilizar perto de 10,5 Realizar as leituras de absorvências das fracções a 280 nm (acertar o zero com água destilada). • Ler também as absorvências do tampão Tris e de carbonatos de sódio Conservar as fracções bem identificadas Lavar a coluna com um volume de tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M igual a , pelo menos, 2 vezes o volume da coluna Regenerar as condições iniciais passando 2 volumes de solução tampão de eluição Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e NaN3 0,02 % (m/v) através da coluna Indicar na coluna qual o último tampão utilizado
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Doseamento da actividade enzimática
Ajustar o zero do espectrofotómetro a 450 nm com tampãio de fosfatos (pH 7,0) 0,1 M
Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma célula de absorção
Adicionar 0,1 mL da fracção em estudo e misturar rapidamente por inversão, tapando o topo da célula com parafilm
Medir o decréscimo da absorvância a 450 nm da amostra durante um minuto
SDS-PAGE Lavar muito bem as placas de vidro, os espaçadores e os pentes com etanol e secar Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de vidro maior com os espaçadores colocar a placa de vidro mais pequena
Introduzir a "sandwich" na peça de suporte para a mesma
Apertar os parafusos e confirmar se não há fugas
Introduzir um pente na "sandwich" até ficarem totalmente inseridos entre as duas placas Marcar com uma cante um traço 1,0 cm abaixo do nível inferior dos dentes do pente. Este será o nível até ao qual se introduzirá a solução de gel resolvente ou de separação
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Preparação dos géis Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) à solução de gel resolvente Adicionar a solução do gel resolvente à "sandwich" com o auxílio de uma pipeta de Pasteur Introduzir um pouco de água destilada • Evita a formação de uma superfície de polimerização irregular, que ocorreria se esta estivesse directamente exposta ao ar Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel polimerize Depois de polimerizado, inverter a caixa de polimerização de modo a escorrer toda a água da superfície do gel Introduzir o pente na "sandwich" de modo a não criar bolhas de ar Deixar a repousar para polimerizar Marcar a posição dos poços do pente no gel Quando o gel de concentração polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado Lavar os poços do gel com água destilada
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Montagem da câmara electroforética
Retirar a peça auxiliar de montagem da caixa de polimerização
Deitar na bancada a peça central da câmara de electroforese Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na peça central da câmara de electroforese Introduzir a peça central no reservatório de tampão inferior da câmara de electroforese
Electroforese Colocar a tampa da câmara electroforética
Ligar os eléctrodos à fonte de tensão (atenção à polaridade!)
Colocar a voltagem nos 100 V
Registar a intensidade de corrente no início e no fim da electroforese
Deixar correr a electroforese até o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente (1h - 1h30)
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Remoção do gel Desligar a fonte de alimentação e despejar a solução de electroforese Deitar a peça central da câmara de electroforese na bancada e remover a peça auxiliar de montagem Remover a "sandwich" Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente Levantar o espaçador de modo a que a placa de vidro superior se separe do gel Remover a placa O gel ficará agarrado a uma das placas Cortar um dos cantos do gel Medir o comprimento do gel e a distância migrada pelo azul de bromofenol
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Resultados e Discussão Gráfico de eluição da cromatografia realizada apresentando a absorvância a 280 nm e valor de pH de cada fracção em função do volume eluído. Discussão do gráfico obtido face às propriedades da técnica cromatográfica
Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Como a composição em resíduos de aminoácidos varia de proteína para proteína, a carga global destas apresenta valores diferentes para diferentes valores de pH. Assim:
as proteínas que apresentam carga global positiva, ou seja, o valor de pH é inferior ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina catiónica.
as proteínas que apresentam carga global negativa, ou seja, o valor de pH é superior ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina aniónica. Como a resina é de troca catiónica, ligou as proteínas que apresentavam carga
global positiva. As outras proteínas, como não se ligam à coluna foram eluídas com o tampão. A proteína que se pretendeu purificar tem pI igual a 10,7, como a resina é de troca catiónica, para que esta adira à coluna, é necessário que tenha carga global positiva, logo, o pH da solução utilizada na preparação da PCO teve de ser inferior ao valor de pI da proteína, bem como o pH da solução com que se fez a lavagem da coluna. Assim, ao aplicar a PCO na coluna, a lisozima liga-se à coluna enquanto as restantes proteínas, por terem pI inferior ao pH, apresentam a carga global igual à da coluna e como tal não se ligam, sendo eluídas com a solução inicial. Ao aumentar o pH do tampão de eluição proteínas ligadas ficam com carga global diferente (negativa) e como tal são também eluídas com o tampão. Desta forma, obtêm-se as diferentes proteínas contidas na PCO variando o pH das soluções. Se a variação do pH não for suficiente para eluir as proteínas da coluna, pode-se aumentar a força iónica do tampão, adicionando cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de potássio (KCl). Assim, a competição entre as partículas do sal e a proteína aumenta e o sal começa a ligar-se à coluna obrigando as proteínas a ser eluídas com o tampão.
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Quadro 1. Valores das absorvâncias (a 280 nm) e de pH das fracções recolhidas na eluição da coluna.
Volume de cada fracção 15 mL 20 mL
10 mL
5 mL
Volume de eluição total 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185
Fracções
Absorvância a 280 nm
pH
Diluição
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
0,080 0,872 0,936 0,098 0,049 0,033 0,032 0,044 0,037 0,032 0,031 0,040 0,032 0,042 0,041 0,189 0,291 0,270 0,275 0,108 0,078 0,056
8,21 8,21 8,23 8,18 8,16 8,14 8,15 8,17 8,36 8,58 8,63 8,65 8,67 8,69 8,69 8,89 9,52 9,95 10,16 10,35 10,45 10,5
1:2 1:3 -
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12
1,1
11
1
10
0,9
9
0,8
8
0,7
7
0,6
6
0,5
5
0,4
4
0,3
3
0,2
2
0,1
1
0
0
pH
1,2
Absorvância pH
15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185
Absorvância a 280 nm
Absorvância e valor de pH VS volume de eluição
Volume eluído /mL
Figura 1. Gráfico de eluição da cromatografia realizada, sendo a absorvância (a 280 nm) e o valor de pH de cada fracção em função do volume de eluição.
Como é visível no gráfico anterior (Figura 1), da fracção 1 à 4, ou seja, dos 15 aos 65 mL eluídos, é quando se observa maior absorvância; havendo um pico de absorvância quando o volume eluído é 45 mL, ou seja, na fracção 3. Como o pH do tampão inicial é de 8,2, todas as proteínas, à excepção da Lisozima e da Avidina, são eluídas juntamente com o tampão, pois não se ligam à coluna por terem carga negativa (como é visível no quadro abaixo – quadro 2). Ao alterar a solução tampão de eluição para uma com pH superior (pH 10,5), alterou-se a carga global das proteínas e como tal a sua ligação com a coluna. As fracções recolhidas começaram a ter valores de pH mais altos. A avidina que tem pI 10 ficou com carga negativa, sendo eluída com o tampão de eluição, seguindo-se o lisozima, o enzima que se pretendia separar, que ficou com carga nula.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 2. Ponto isoeléctrico (pI) das principais proteínas presentes na clara do ovo.
Proteínas pI 4,5 Ovalbumina 6,05 Ovotransferrina 4,1 Ovomucoide 10,7 Lisozima 5,1 Ovoinibidor Ovomacroglobulina 4,5 3,9 Ovoglicoproteína 10 Avidina
Explicação da variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na cromatografia de troca iónica e a compactação reversível sofrida pelo gel na coluna durante este processo cromatográfico. Cálculo da força iónica das soluções tampão utilizadas. A variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na cromatografia de troca iónica deve-se a terem sido utilizados dois tampões diferentes:
Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (utilizado nas primeiras 4 fracções – volume equivalente ao volume da coluna - ver anexos – I)
Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M (restantes fracções) Se o tampão de eluição utilizado não tivesse sido trocado, aumentando-se o seu
pH gradualmente, a variação que se veria nas fracções seria contínua, e não descontínua como foi o caso. A utilização de dois tampões de eluição diferentes influenciou a altura da coluna inicial (11 cm) devido às diferentes forças iónicas dos dois tampões. A força iónica (I) é a medida do campo eléctrico devido aos iões presentes em solução. Assim, está relacionada com a concentração de electrólitos, catiões e aniões. A forção iónica das soluções tampão utilizadas podem ser calculadas através da seguinte expressão:
Onde
é a concentração da espécie com carga e
é a carga da respectiva
espécie.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Força Iónica do Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M As equações que representam o equilíbrio do tampão são:
1.
Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga
Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:
2.
Cálculo da força iónica
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Força Iónica do Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M As equações que representam o equilíbrio do tampão são:
1.
Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga
Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:
2.
Cálculo da força iónica
Visto que a força iónica do segundo tampão é maior que a do primeiro, o segundo tampão causa o compactamento da coluna. As partículas de gel carregadas negativamente, unem-se mais aos iões Na+ do tampão de carbonatos de sódio por a concentração destes catiões ser superior neste tampão, o que em conjunto com outros iões presentes em solução aumenta a força iónica causando a compactação da coluna. Este processo de compactação é reversível – basta adicionar um tampão com menor força iónica para que a coluna descompacte. Página | 17
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Cálculo da concentração proteica de cada fracção e do PCO usando as leituras de Absorvância a 280 nm
Para o cálculo da concentração das fracções foram utilizados dois valores de coeficiente de absorção molar. (mistura de proteínas) (lisozima) Nas fracções em que se suspeita que exista lisozima (fracções 17 – 19) utilizouse o segundo valor apresentado anteriormente, nas restantes, em que existe uma mistura de proteínas (fracções 1 – 16 e 20 – 22), utilizou-se o primeiro valor. Exemplificando:
Fracção 1 (mistura de proteínas)
(mistura de proteínas)
Fracção 17 (lisozima)
(lisozima)
No caso em que existiu diluição das soluções para a obtenção de uma absorvância mais rigorosa, deve multiplicar-se a concentração obtida pelo factor da diluição. Por exemplo, a fracção 2:
(mistura de proteínas) Página | 18
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Como a solução foi diluída com factor 2, a concentração real da fracção é:
Quadro 3. Resumo dos valores obtidos durante o processo de doseamento proteico.
Doseamento Proteico Volume da Amostra Fracção (mL)
Volume de eluição Total (mL)
pH
Abs280nm
Diluição do ensaio
[Prot] (mg/mL)
PCO
-
-
8,3
1,487
1:12
17,844
1
15
15
8,21
0,080
-
0,080
2
15
30
8,21
0,872
1:2
1,744
3
15
45
8,23
0,936
1:3
2,808
4
20
65
8,18
0,093
-
0,093
5
10
75
8,16
0,049
-
0,049
6
10
85
8,14
0,033
-
0,033
7
10
95
8,15
0,032
-
0,032
8
10
105
8,17
0,044
-
0,044
9
10
115
8,36
0,037
-
0,037
10
10
125
8,58
0,032
-
0,032
11
5
130
8,63
0,031
-
0,031
12
5
135
8,65
0,040
-
0,040
13
5
140
8,67
0,032
-
0,032
14
5
145
8,69
0,042
-
0,042
15
5
150
8,69
0,041
-
0,041
16
5
155
8,89
0,189
-
0,189
17
5
160
9,52
0,291
-
0,012
18
5
165
9,95
0,270
-
0,017
19
5
170
10,16
0,275
-
0,014
20
5
175
10,35
0,108
-
0,108
21
5
180
10,45
0,078
-
0,078
22
5
185
10,5
0,056
-
0,056
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Discussão das aproximações realizadas nos cálculos anteriores. Sugestão de um método mais rigoroso para a determinação proteica de cada amostra.
Para a determinação da concentração proteica de cada fracção obtida na cromatografia de troca iónica, foi medida a absorvância de cada uma delas e seguidamente calculou-se a concentração utilizando a lei de Lambert-Beer (
).
O método utilizado pode induzir em erro, visto que a concentração medida não foi apenas das proteínas mas sim de todo o conteúdo existente nas fracções. Assim, para a determinação mais correcta da concentração proteica deveria ter sido utilizado um método específico de doseamento de proteínas, por exemplo o método de Lowry. O princípio do método de Lowry baseia-se numa mistura contendo o reagente de Folin-Ciocalteau que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II). A sua principal vantagem é a de apresentar uma alta sensibilidade na determinação das concentrações das mesmas. No entanto, apesar do método de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para as proteínas, o mesmo possui algumas desvantagens, como por exemplo estar sujeito a muitos tipos de interferentes. Estes interferentes causam, normalmente, o aumento da absorvância do branco, diminuição da absortividade específica ou formação de precipitados. Outro método que poderia ser utilizado na determinação proteica é o método do Biureto (ver anexos – II). No entanto, para além deste método ser muito menos sensível que o método apresentado anteriormente, seria afectado pelo tampão Tris-HCl, já que este é um dos poucos interferentes para este método (porque reage com o Cu 2+ presente na mistura).
Representação da actividade enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da PCO e ainda para a fracção que apresentava maior actividade enzimática. Resumir os cálculos num quadro.
Em condições adequadas, a velocidade da reacção medida é proporcional à quantidade de enzima presente no extracto (neste caso, PCO). No entanto, como muitas enzimas não são encontradas puras, não é possível quantificá-las, pelo que os resultados são expressos em termos de unidades de actividade (UA), que são definidas Página | 20
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica arbitrariamente como a quantidade de enzima capaz de variar 0,001 unidades de absorvância por minuto. Relativamente à lisozima, a unidade enzimática é dada pela quantidade de centros catalíticos que conduz a uma variação de absorvância a 450nm de 0,001 unidades por minuto. Para se fazer o cálculo das unidades enzimáticas é utilizada uma fórmula que relaciona a variação de absorvância (∆Abs) e a variação do tempo (∆t). Para calcular , fez-se uma regressão linear das rectas obtidas na realização dos ensaios enzimáticos, onde
representa o declive dessas rectas. Nesta fórmula o tempo vem
em minutos, mas como o espectrofotómetro apresentou o tempo medido em segundos (60 segundos), foi necessário converter-se esse valor para variação de absorvância por minuto. Estes valores foram também divididos por 0,001, de modo a obter-se o número de unidades enzimáticas. Assim, a fórmula para calcular o número de unidades enzimáticas é: , em que a unidade é U, sendo este U = µmol.min-1
Nos ensaios enzimáticos realizados, só a PCO e a fracção 17 foram diluídas, pois são as que se espera registar maior actividade enzimática. Ainda assim mediu-se a actividade enzimática para outros picos de absorvância (Figura 1) para concluir se tinham a lisozima ou não. Para exemplificar os cálculos efectuados tome-se como modelo os seguintes cálculos:
PCO diluição 1:5
O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver Anexos – III, Figura III). Neste caso,
.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica O número de unidades enzimáticas é:
Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:
Fracção 17 diluição 3:5
O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver Anexos – III, Figura IX). Neste caso,
.
O número de unidades enzimáticas é:
Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:
Fracção 2
O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver Anexos – III, Figura XII). Neste caso,
.
O número de unidades enzimáticas é:
Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:
Página | 22
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Quadro 4. Resumo dos ensaios da actividade do lisozima da clara do ovo na PCO e nas fracções correspondes aos picos do gráfico 1.
Diluição
[Prot]
|∆Abs450nm/∆t|
Actividade
realizada
(mg/mL)
(UA/min)
(U/mL)
1:1
17,844
0,0007
420
1:2
8,922
0,0006
360
1:5
3,5688
0,0004
240
1:10
1,7844
0,0002
120
1:20
0,8922
0,0002
120
1:40
0,4461
0,0002
120
1:1
0,012
0,0008
480
4:5
0,0096
0,0008
480
3:5
0,0072
0,0007
420
2:5
0,0048
0,0006
360
1:5
0,0024
0,0004
240
Fracção 2
1:1
1,744
1,8
Fracção 3
1:1
2,808
0,36
Fracção 8
1:1
0,044
48
Fracção 18
1:1
0,017
0,0002
120
Fracção 19
1:1
0,014
0,0001
60
Amostra
PCO
Fracção 17
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Actividade Enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO 450 Actividade Enzimática (U/mL)
400 350 300 250 200
Actividade Enzimática
150 100 50 0 0,4461
0,8922 1,7844 3,5688 8,922 17,844 Concentração de Proteína (mg/mL)
Figura 2. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO.
Actividade Enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da fracção 17 Actividade Enzimática (U/mL)
600 500 400 300 Actividade Enzimática 200 100 0 0,0024
0,0048 0,0072 0,0096 0,012 Concentração de Proteína (mg/mL)
Figura 3. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da fracção 17.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Determinação da actividade específica (SA) da PCO e de cada fracção eluída da coluna A actividade específica de um enzima (SA) corresponde ao nº de moles de substrato ou produto convertidos por unidade de tempo e por unidade de massa de enzima. Por outras palavras podemos dizer que é igual à actividade enzimática por unidade de massa de enzima usada no ensaio. Assim, para a actividade específica da PCO e de cada fracção eluída, tem-se que: , onde as unidades enzimáticas são dadas por U.mg-1.
Durante a actividade experimental apenas se mediu a absorvância a 450 manómetros durante 1 minuto para as fracções que apresentavam maior concentração proteica. Desta forma, apenas foi possível calcular a actividade enzimática e a actividade específica para estas fracções. Em seguida demonstra-se um exemplo do cálculo da actividade específica para uma das fracções:
Fracção 8
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Quadro 5. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica
Abs280nm
Diluição do ensaio
[Prot] (mg/mL)
8,30
1,487
1:12
17,844
1
15
15
8,21
0,080
-
0,080
2
15
30
8,21
0,872
1:2
3
15
45
8,23
0,936
4
20
65
8,18
5
10
75
6
10
7
0,0007
SA (U/mg)
pH
-
(U/mL)
Volume de eluição Total (mL)
-
Actividade
Volume da Fracção (mL)
PCO
Doseamento da actividade enzimática (UA/min)
Amostra
Doseamento Proteico
420
23,54
1,744
1,8
1,03
1:3
2,808
0,36
0,13
0,093
-
0,093
8,16
0,049
-
0,049
85
8,14
0,033
-
0,033
10
95
8,15
0,032
-
0,032
8
10
105
8,17
0,044
-
0,044
12
272,73
9
10
115
8,36
0,037
-
0,037
10
10
125
8,58
0,032
-
0,032
11
5
130
8,63
0,031
-
0,031
12
5
135
8,65
0,040
-
0,040
13
5
140
8,67
0,032
-
0,032
14
5
145
8,69
0,042
-
0,042
15
5
150
8,69
0,041
-
0,041
16
5
155
8,89
0,189
-
0,189
17
5
160
9,52
0,291
-
0,012
0,0008
480
40000
18
5
165
9,95
0,270
-
0,017
0,0002
120
7058,82
19
5
170
10,16 0,275
-
0,014
0,0001
60
4285,71
20
5
175
10,35 0,108
-
0,108
21
5
180
10,45 0,078
-
0,078
22
5
185
10,50 0,056
-
0,056
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Gráfico de eluição da cromatografia realizada representando a concentração de proteína e SA de cada fracção em função do volume de eluição. Discussão dos resultados obtidos.
4,5
45000
4
40000
3,5
35000
3
30000
2,5
25000
2
20000
1,5
15000
1
10000
0,5
5000
0
Actividade Específica (SA) (U/mg)
Concentração da Proteína (mg/mL)
Concentração de Proteína e SA em função do volume de eluição
[Prot] (mg/mL) SA (U/mg)
0 30
45 105 160 165 Volume de Eluição (mL)
170
Figura 4. Gráfico representativo da concentração de proteína e SA em função do volume de eluição.
Como é visível no gráfico anterior (Figura 4), a actividade específica é maior onde a concentração proteica é menor. Apesar de haver uma maior concentração proteica na primeira parte do gráfico (volume de eluição de 20 a 105), a enzima não está presente, ou está presente em muito pouca quantidade, pois estas foram as primeiras fracções a serem recolhidas e só as proteínas com carga negativa foram eluídas, ou seja, todas as que tem pI inferior a 8,2, que não é o caso do lisozima, enzima do qual se está a calcular a actividade específica. Este gráfico mostra então que a separação da lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica foi eficiente, já que nas fracções em que se esperava obter o enzima, existe actividade enzimática.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Estudo do electroforama obtido e identificação das principais proteínas em cada pista. Relação do electroforama com os cromatogramas anteriores.
A electroforese realizada neste trabalho experimental foi uma electroforese unidimensional em gel de SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE). Foi utilizado o gel de poliacrilamida, pois este apresenta uma grande resolução originando, portanto, uma boa separação dos diferentes componentes de uma mistura. Estes géis também têm a vantagem de serem fáceis de preparar e corar, permitindo revelar e identificar facilmente os compostos separados. Esta electroforese foi realizada sob condições desnaturantes (devido ao SDS, que é um detergente), que dissocia as cadeias e as ligações persulfureto, permitindo a identificação aproximada, por comparação, do tamanho da proteína
Figura 5. Electroforama obtido no SDS-PAGE.
Na realização do gel para a electroforese, foram preparados dois tipos de gel. O gel resolvente (a 12%) e o gel concentrador (a 5%). A camada superior, o gel concentrador, tem poros maiores, enquanto o gel resolvente, a camada inferior, tem poros mais pequenos. Desta forma, as proteínas maiores, com maior massa molecular
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica ficam retidas na camada superior, enquanto as proteínas de menores dimensões passam para a camada inferior. Em cada poço seria suposto colocar
de proteína, podendo ter no máximo
da solução proteica. Como algumas fracções possuem concentrações muito baixas, o volume a colocar nos poços era muito maior que 10
logo, na
impossibilidade de colocar o volume calculado (ver Anexos - IV), colocou-se
.
No electroforama obtido, a ordem de colocação das amostras nos poços é a seguinte: 1- Amostra de PCO; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 2- Amostra do pico 1 (Fracção 3); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 3- Amostra do pico 2 (Fracção 8); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 4- Amostra do pico 3 (Fracção 17); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 5- Amostra do lisozima; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 6- Marcador; tampão e β-mercaptoetanol; 7- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol; 8- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos: 9- Amostra de β-globulina; tampão de aplicação; aquecidos durante 5 minutos. Através da comparação das bandas obtidas com as bandas do marcador (Quadro 6), cujas massas moleculares são conhecidas, é possível verificar se a fracção que se suspeita ter lisozima está pura. Quadro 6. Proteínas que constituem o marcador.
Proteína
Mr (KDa)
Rf
Erro
Fosforilase b
94
0,36
0,32-0,40
BSA
67
0,44
0,39-0,47
Ovalbumina
43
0,52
0,46-0,56
Anidrase carbonica
30
0,65
0,58-0,70
Inibidor de tripsina
20
0,75
0,66-0,80
α-lactalbumina
14,4
0,84
0,75-0,91
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Sabendo que a lisozima tem massa molecular 14,3 KDa, é de esperar que as amostras que contenham lisozima apresentem uma banda situada onde, em comparação com o marcador, a massa molecular é 14,4 KDa. Assim, é possível concluir que as amostras colocadas no poço 1, 2, 3, 4 e 5 contem uma percentagem notável de lisozima. Nas restantes amostras, foi estudado o efeito do aumento de temperatura (9), o efeito do β-mercaptoetanol (7) e o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8) na β-globulina. A β-globulina é construída por 2 subunidades, quando fica sujeita à acção de agentes desnaturantes, as duas subunidades separam-se, mostrando no electroforama três bandas distintas. Uma banda para a proteína não desnaturada, e duas para cada uma das subunidades. No caso em que foi estudado o efeito do β-mercaptoetanol (7), é possível observar várias bandas a diferentes massas moleculares, o que significa que o βmercaptoetanol desnaturou a proteína de tal forma que para além das subunidades se separarem uma da outra, ainda se dividiram em fracções com tamanhos variáveis (desde 94 a 14,4 KDa). Na amostra aplicada ao poço 8, a proteína também desnaturou dando origem a 4 bandas distintas, ou seja, fracções com tamanhos variáveis. No caso em que se estudou o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8), obteve-se aproximadamente o mesmo resultado que no caso anterior, mas obteve-se menos bandas. No caso em que apenas se estudou o aumento da temperatura aconteceu o descrito anteriormente, o electroforama apresenta 3 bandas, uma banda para a proteína não desnaturada (a primeira banda), e duas para cada uma das subunidades (a subunidade de menor tamanho apresenta-se numa banda na parte inferior do electroforama).
Quadro de purificação final do lisozima da clara do ovo
Para determinar o rendimento e a purificação do enzima seleccionaram-se as fracções com maior actividade específica, pois é nestas fracções que se encontra a maior parte do enzima que se pretendia purificar, o lisozima. As fracções seleccionadas foram a 17, 18 e 19, já que apresentam actividade específica 40 000, 7058,82 e 4285,71, respectivamente.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Para exemplificar o cálculo do rendimento e da purificação do enzima, procedeu-se a este cálculo para a fracção 17, sendo o cálculo para as outras fracções e para a PCO semelhante.
Fracção 17
Sendo a actividade total o somatório de todas as actividades totais de todas as fracções.
Sendo a actividade específica total o quociente entre a actividade total e a soma das massas totais de enzima purificado.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Massa Proteica total (mg)
Actividade (U/mL)
Actividade Total (U)
SA (U/mg)
17,844
124,91
420
2 940
23,54
17
5
0,012
0,06
480
2 400
40 000
18
5
0,017
0,085
120
600
7 058,8
19
5
0,014
0,07
60
300
4 285,7
0,215
660
3 300
47 142,86*3
Total
15
0,014*
2
Purificação (x)
[Prot] (mg/mL)
7*1
Rendimento (%)
Volume Total (mL)
PCO Fracções
Passo de Purificação
Quadro 7. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica.
112,2
2002,7
*1 O volume da PCO deveria ser 8 % do volume total da coluna. No entanto, colocou-se 7 mL. *2 O valor de concentração total é a média dos valores de concentração obtidos em cada fracção. *3
Como é visível no quadro anterior (Quadro 7) tanto o rendimento como a purificação dão valores bastante mais altos que o esperado. Durante a realização deste trabalho experimental não se mediu a absorvância da solução da PCO utilizada e como tal, para se obter um valor aproximado ao obtido se tivesse sido medido, foi utilizado o valor de absorvância registado por outro grupo. Desta forma o valor da concentração e consequente absorvância da PCO para a solução utilizada durante o trabalho, deveria ser maior que aquele que obtemos do outro grupo.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Conclusão Globalmente, este trabalho laboratorial foi constituído por quatro etapas principais: Cromatografia de troca iónica; Doseamento da concentração de proteína; Doseamento da actividade enzimática; Electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). A cromatografia de troca iónica permitiu-nos separar diferentes fracções da amostra da clara de ovo (PCO) e, como tal, diferentes soluções constituídas por diferentes conjuntos de proteínas. Após a sua análise, ao serem medidas as absorvâncias das fracções, foi possível identificar aquelas que teriam o enzima pretendido (lisozima) na sua constituição. A partir daí foi possível analisá-las mais detalhadamente e avaliar diversos parâmetros que nos permitiram estimar a presença e o comportamento do lisozima. Através da determinação da actividade enzimática de cada fracção, às quais se adicionou substrato de parede celular de células de M. luteus, foi possível medir o decréscimo da absorvência a 450 nm e, desta forma, verificar experimentalmente a actividade do lisozima sobre as paredes celulares da bactéria em questão. Calculou-se também a actividade enzimática e actividade específica das diferentes diluições da amostra da PCO e das fracções correspondentes a picos de absorvância. Por fim, pela realização da electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) conseguiu-se identificar as principais proteínas presentes em cada poço, nomeadamente, na amostra da PCO e nas amostras correspondentes aos três picos. Tendo-se utilizado um marcador de massa molecular conseguiu-se concluir que, de facto, o pico 3 (fracção 17) continha lisozima na sua constituição, enquanto que os restantes (eluídos inicialmente) continham outras proteínas que fazem parte da constituição da clara de ovo. Este método permitiu, assim, concluir que foi possível purificar o lisozima, tal como se esperava. Através das fracções com maior actividade específica determinou-se o grau de purificação do lisozima bem como o rendimento de toda a actividade. Os valores Página | 33
Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
obtidos para estes parâmetros não podem ser aceites como verdadeiros nem discutidos, uma vez que para efectuar os cálculos foi necessário recorrer ao valor de absorvância da PCO de outro grupo, não correspondendo à realidade daquilo que foi observado. Em suma, apesar de não ter sido possível quantificar o rendimento nem o grau de pureza do lisozima obtido, foi possível verificar qualitativamente a sua presença e observar a sua actividade catalítica. Desta forma, pode fazer-se um balanço positivo relativamente a todo trabalho que teve como principal objectivo a purificação do lisozima da clara do ovo.
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Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica
Bibliografia Boyer, RF (1993) Modern Experimental Biochemistry, 2ª ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., Redwood City. Holme, D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry, Cap. 8, Addison Wesley Longman: New York. Ninfa, A.J. e Ballou, D.P. (1998) Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology, Fitzgerald Science Press: Bethesda, MA, pp. 199-206. Switzer, R. e Garrity, L. (2003) Experimental Biochemistry. Theory and Exercises in Fundamental Methods, 3rd. ed., W.H. Freeman: New York, pp. 95-104. Wilson, K (1994) Principles and Techniques of Practical Biochemistry, (Wilson, K e Walker, J, eds.) 4ª ed., Cambridge University Press, Cambridge.
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