regulacion beta-galactosidasa.docx

“Regulación

de la síntesis de la β- Galactosidasa”

OBJETIVO El alumno determinará mediante datos experimentales y conociendo los mecanismos de regulación metabólica, cuál es el tipo de regulación que lleva a cabo Escherichia coli en la síntesis de la enzima β-galactosidasa.

OBJETIVOS 

Medir la velocidad de inducción y represión catabólica de la β-Galactosidasa cambios en la fuente de carbono del medio de cultivo de la bacteria en cuestión.



Observar el efecto de inducción y represión de la β-Galactosidasa cuando se cambia la fuente de carbono.

FUNDAMENTOS Determinación Determinación de la actividad de β-Galactosidasa. β -Galactosidasa.

El ONPG  (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido), es un sustrato análogo para la

βgalactosidasa, dado su estructura química puede entrar fácilmente a la célula, es hidrolizado por la β-galactosidasa produciendo D-galactosa y el ortonitrofenol, compuesto de color amarillo, el cual es utilizado para d eterminar la actividad de la β-galactosidasa, (1) por espectrofotometría a una longitud de onda de 420 nm.

Velocidad de inducción y represión catabólica.

El cloranfenicol es un antibiótico antibiótico que inhibe la síntesis de proteínas bloqueando bloqueando la actividad de la enzima peptidil transferasa al unirse a la subunidad 50S del ribosoma evita la formación del enlace peptídico., impidiendo el crecimiento celular; después celular; después se trato con tolueno para disgregar la membrana celular, al ser los fosfolípidos solubles en sustancias no polares, y a si poder obtener a las proteínas permeadas de la lactosa y poder trabajar trabajar 2 con ellas cuantificando su actividad.

Tolueno: Solubiliza la membrana para que entre el ONPG a la célula y sea hidrolizado por la β-Galactosidasa.

DISEÑO EXPERIMENTAL. Determinación de la actividad de β- galactosidasa.

De cada una de las suspensiones de células obtenidas se ajustan a 1.0 de absorbencia a 600 nm, esto para tener aproximadamente la misma cantidad de células para que la determinación no se vea afectada. A una de esas suspensiones se le agrega tolueno y se agita vigorosamente en el vórtex por 2 minutos y se coloca en baño de hielo. En una celda para espectrofotométrica se colocan 3.8 mL de regulador de fosfatos, ONPG que es un análogo de la lactosa, lo utilizamos para conocer si un microorganismo posee ßgalactosidasa se utiliza como sustrato este compuesto orgánico, y la suspensión celular, se agita y se lee inmediatamente a la absorbencia a 420 nm esto por la reacción colorida que es de color amarillo. Las lecturas se registran cada minuto durante 10 minutos. El aparato se ajusta cero de absorbencia con una celda que contenga 3.9 mL de regulador de fosfatos y 0.1 mL de ONPG, esto para ajustarlo como blanco de reactivos.

Velocidad de inducción y represión catabólica. Inocular con cultivo de 18 horas un matraz de Erlenmeyer con 200 mL de medio sintético adicionado de glicerol e incubar a 37ºC en agitación durante 3 horas, el medio sintético por que tiene lo necesario para mantener al microorganismo con sus funciones vitales y

porque conocemos exactamente las cantidades de lo que está hecho. Retirar una alícuota de 10 mL y adicionar al cultivo que queda en el matraz el volumen de lactosa estéril a una concentración final de 1.2 %. Incubar a 37ºC en agitación y seguir retirando las alícuotas de 10 mL a los 2.5, 5, 10, 15, 20 y 30 min. Al retirar la alícuota de 30 min, agregar inmediatamente el volumen de glucosa (50%) y continuar retirando alícuotas a los 35, 40, 50, 60 y 70 minutos. Esto nos dice que a partir del minuto treinta E. Coli empezará a utilizar a la glucosa para seguir creciendo. Todas las alícuotas se reciben en tubos cónicos de polipropileno para centrífuga que contengan 0.1 mL de cloranfenicol, un antibiótico bacteriostático, de amplio espectro ejerce sus efectos mediante la unión irreversible a la subunidad ribosomal 50s. Los tubos cónicos una vez recibiendo las alícuotas inmediatamente se conservan en baño de hielo, después de retirar la última alícuota centrifugar a 3,000 rpm / 10 min. Se lava con regulador de fosfatos y ajustamos a 1.0 de absorbencia a 600 nm. Tratar con tolueno y medir actividad enzimática conforme a lo indicado en el inciso anterior, efectuado las lecturas de absorbencia una a los cero min y otra a los 10 min.

MANEJO DE DATOS 

Velocidad de inducción y represión catabólica; medición de actividad enzimática respecto a densidad óptica. Tiempo de incubación (min) 0 10 20 30 35 40 50 60

Absorbencia a 420nm en la determinación de la actividad de βgalactosidasa. t= 0 min t= 10 min ∆Abs √   0.050 0.035 0.038 0.050 0.060 0.061 0.070 0.175

0.034 0.043 0.060 0.139 0.209 0.152 0.182 0.299

0 0.008 0.022 0.089 0.149 0.091 0.112 0.124

CÁLCULOS Determinación de Δ absorbancia velocidad de inducción y represión catabólica

       Ejemplo minuto 40

0 0.089 0.1483 0.2983 0.3860 0.3016 0.3346 0.1113

   

  

  

Determinación de √   Ejemplo minuto 40:

√0.091 = 0.301

RESULTADOS

CINÉTICA DE INDUCCIÓN Y REPRESIÓN CATABÓLICA DE β-GALACTOSIDASA EN Escherichia coli. 0.45

glucosa

0.4 0.35    s     b 0.3    A 0.25       Δ       √

0.2

0.15 lactosa 0.1 0.05 0 0

10

20

30

40

50

60

Tiempo (minuto)

DISCUSION

En la gráfica, observamos el comportamiento de la β-galactosidasa al ser inducida por la lactosa, puesto que en los primeros tres tiempos se ve un incremento en su actividad claramente; al tiempo 30 en donde se adiciona glucosa al medio, comenzamos a observar una disminución en la actividad de la misma y conforme pasa el tiempo esta sigue bajando, lo que nos dice que la glucosa actúa como represora de la β-galactosidasa, como sabemos cuando estos dos sustratos se encuentran presentes en el mismo medio el microorganismo prefiere consumo de la glucosa. Esto se da debido a un mecanismo de regulación, denominado represión por catabolito, el cual impide la expresión de los genes para el catabolismo de la lactosa y otros azucares en presencia de glucosa; el efecto de la glucosa sobre la CRP está facilitado por la formación del complejo CRP-cAMP. La CRP se une al operón lac con mayor afinidad cuando las

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concentraciones de cAMP son altas. Con la glucosa la síntesis de cAMP se inhibe y se estimula la salida de la célula, a medida que las concentraciones de esta disminuyen la unión del complejo por igual y en consecuencia también se disminuye la expresión del operón lac. Debido a este mecanismo de regulación después de haber sido adicionada la glucosa la gráfica sigue una tendencia descendente, , ya que en este tiempo la acción de represión que tiene la glucosa sobre el operón lac ya es más evidente, debido a que para presentar una fuerte inducción en el mismo operón se requiere lactosa, para inactivar el represor lac, además de una baja concentración de glucosa, para tener un incremento del complejo CRP-cAMP.

Figura 6. Reacción del ONPG.

Es importante mencionar que se utilizó también tolueno cuando la fuente de cabono fue lactosa, el tolueno es un disolvente orgánico que actuará sobre la membrana lípidica, lo que ocasionará que el transporte de lactosa sea más “rápido y eficiente”, lo que provoca que al utilizar tolueno, la actividad de β-galactosidasa sea mayor. Los niveles celulares de algunos productos génicos aumentan disminuyen en respuesta a señales moleculares; esta es la expresión génica regulada. Los productos génicos que aumentan de concentración bajo determinadas circunstancias moleculares se llaman inducibles; el proceso de aumento de su expresión se denomina inducción. (Nelson,2004) Los represores se unen a sitios específicos del DNA que en células procarióticas estos sitios de unió se denominan operadores, que generalmente se encuentran cerca de un promotor. La unión de la RNA polimerasa, o su movimiento a lo largo del DNA después de la unión, se bloquea cuando el represor está presente. La regulación mediante una proteína represora que bloquea la transcripción se denomina regulación negativa. La unión del represor al DNA se regula por una señal molecular (o efector), normalmente una

molécula pequeña o una proteína, que se une al represor y provoca un cambio conformacional. (Nelson, 2004)

Figura 7. A) En ausencia de lactosa, el represor lac se une al DNA y reprime la transcripción del operón lac, B) la alolactasa u otro inductor se une al represor lac provocando su disociación del DNA y la producción del mRNA de lac.

Los activadores consituyen el contrapunto molecular de los represores; se unen al DNA y potencian la actividad de la RNA polimerasa en el promotor; se trata de la regulación positiva. En el operón lac, en realidad el inductor natural no es exactamente la lactosa, sino el isómero alolactosa, que se orignia por nadamás de la presencia de lactosa en la célula. La molécula unida a cada monómero de represor no es la lactosa sino alolactosa. La alolactosa, al igual que la lactosa, está compusta por glucosa y glactosa, pero el enlace entre los dos azúcares es diferente. Sucede que una reacción secundaria de la β galactosidasa (que normalmente actúa hidrolizando lactosa en glucosa y galactosa) convierte estos dos productos en alolactosa. La β -galactosidasa convierte unas pocas moéculas de lactosa en alolactosa, que posteriormente se unen al represor y provocan la inducción del operón. (Devlin, 2004)

Figura 8. Estructuras de la lactosa y los productos por acción de la β-galactosa. Estructura de la Alolactosa.

Conclusiones.   

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El operón de la lactosa de Escherichia coli es un operon catabolico inducible El operón lac está sujeto a regulación positiva El Tolueno es un disolvente orgánico que ayuda a que el trasporte de lactosa sea más eficiente. La glucosa participa en el mecanismo de represión catabólica para el operón lac. El glicerol es la fuente de carbono para las células, se utiliza esta fuente de carbono por qué no induce la síntesis de la β-galactosidasa. La alolactosa es el inductor para la síntesis de la β-galactosidasa. .