Recuento de Microorganismos 1

 

I Introducción: establece los criterios de higiene del proceso de producción en los mataderos basándose en el recuento recuento de microorganismo microorganismoss aerobios aerobios mesófilos mesófilos (RA) y de enterobacterias enterobacterias (RE) de muest muestra rass to toma mada dass medi median ante te el méto método do de destr struc uctiv tivo. o. Adem Además ás in indi dica ca qu quee lo loss explotadores de los mataderos podrán usar otros procedimientos de toma de muestras si  pueden demostrar que proporcionan al menos garantías equivalentes. equivalentes.  El análisis de los al alim imen ento to y pien pienso sos s para para dete determ rmin inar ar la exis existe tenc ncia ia,, tipo tipo y núme número ro de microorganismos microorga nismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo ninguno ningu no de los métodos métodos utilizados utilizados habitualment habitualmente e permite permite determina determinarr el número exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento.

II OBJETIVO Evaluar la eficacia del método del hisopado en la recuperación de microorganismos aerobios mesófilos y enterobacterias de la superficie de Canals de placa petri  

III MARCOTEORICO

Se compararon dos metodologías de cuantificación de esófilosaerobiostotales: el método propuesto por la Foodestudiadas and Drug 25 Administration (FDA)vegetales y el método recuentoestándar en placas Petrifilm®.Fueron muestras de drogas en de envases individuales. Se encontraron diferencias ignificativas con un p< 0,001 entre el método estándar y el método de placas Petrifilm® para el recuento de mesófilos aerobios, con un 95% de probabilidad. El análisis de regresión del log10 de la media geométrica del recuento deesófilos aerobios totales versus el log10 del recuento por placas Petrifilm, para recuentos entre 104 y 106 ,indica una correlación de 0,964 entre ambos métodos. Las placas Petrifilm®  podrían considerarse como método alternativo para el recuento de mesófilos aerobios totales en los controles microbiológicos en los procesos de industrialización de las drogas vegetales para

3.1Recuento de aerobios mesófilos En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este este recuen recuento to se estim estima a la micro microflo flora ra tota totall sin especi especific ficar ar tipos tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no signif sig nifica ica pr prese esenci ncia a de flora flora patóge patógena. na. Ahora Ahora bien, bien, sa salvo lvo en alimen alimento tos s obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: 1 - Excesiva contaminación de la materia prima 2 - Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración elaboración 3 - La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos 4 - La inmediata alteración del producto El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de

 

1 3.2 Captación y envío de la muestra La captación de las muestras no es una actividad incluida en la competencia del laboratorio acreditado para este análisis. Para este tipo de análisis no se utilizarán contramuestras. La toma y envío de muestras deben ser realizada por el Médico Veterinario Oficial del SAG (MVO), el cual debe adjuntar las muestras a un Protocolo Oficial SAG, en cuyo documento debe señalar al menos la identificación de cada una de ellas, el tipo de muestras, la fecha y la hora de la recolección de éstas. Lo anterior debe realizarse de acuerdo a lo definido en el “Manual de Procedimientos para Muestreo Mue streo Microbiológ Microbiológico ico Oficial Oficial en Carnes Carnes fae faenad nadas as en Matader Mataderos os de Exportac Exportación. ión. SAG”, SAG”, última versión vigente.

1

3.3 Recepc cepció ión n y manejo nejo de la mues uestr tra a

La recepción y manejo de las muestras en el laboratorio debe realizarse de acuerdo a lo señalado en el “Manual de Procedimientos para Muestreo Microbiológico Oficial en Carnes faenadas en

1 2

• Temper Temperatur atura a de rec recepció epción n (r (rang ango o acepta aceptado: do: 4 – 8 ººC). C). • Tiempo Tiempo entre entre la to toma ma de mu mues estra tras s y la rec recep epció ción, n, ya que DE DEBEN BEN SER SER PROCESA PROCESADAS DAS DENTRO DE LAS 24 HORAS DESDE LA TOMA DE LAS MUESTRAS.

3

• Int Integ egri rida dad d de de las las mu mues estr tras as..

4

• Cantid Cantidad ad sufic suficien iente te de m mue uestr stras as pa para ra el el aná anális lisis. is.

5

• Id Iden enti tifi fica caci ción ón ad adec ecua uada da..

6

• Cont Conten ened edor or con con sel sello lo S SAG AG iint ntac acto to..

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• Pr Prot otoc ocol olo o fuer fuera a de dell cont conten ened edor or y con con los los da dato tos s requ requer erid idos os de acuer acuerdo do al Manu Manual al anteriormente mencionado.

1 2

3.4 Metodología Car Caracte cteríst ístic icas as del del pro procedim dimien iento de ensayo

Las placas Petrifilm para el Recuento de Microorg Microorganismos anismos Aerobios Mesófilos están diseñadas para determinar las poblaciones totales de bacterias aerobias. Se basa en el crecimiento de colonias de la flora aerobia mesófila que lleva la muestra. El diseño de esta placa presenta una película con nutrientes y agentes gelificantes soluble en agua y un indicador rojo de Te

3.4 Preparación de la muestra 1

• Piel cuello de ave

2 - Asépt Asépticam icamente ente pesar pesar a lo menos (m (mante antenien niendo do rela relación ción 1:10 1:10 con el diluyente) diluyente) 10 ± 0.1 g de muestra representativa dentro de una bolsa estéril Stomacher.

 

3 - Agreg Agregar ar 90 ml de Diluyente Diluyente Bu Butterfield’s tterfield’s Tampona Tamponado. do. Esta dilución dilución es es denominada denominada 10 10 -1. No usar tampones que contengan citrato, bisulfito o tiosulfato con las placas Petrifilm, ya que pueden inhibir el crecimiento. 4 - Homog Homogenizar enizar la muestra en en equi equipo po Stomac Stomacher her por 1 minuto a velocidad velocidad media. media. 5 - Lueg Luego o depositar depositar 1 ml de esta dilución d de e acuer acuerdo do a lo descrito en punto 5.3.3. 5.3.3. 6 - La siemb siembra ra en duplicad duplicado o qued queda a a criterio criterio del laborato laboratorio, rio, para para lo cual se debe debe repetir repetir el procedimiento antes descrito. 7 Dil - Auyente partir la di diluci lución ón anterior riornado. to tomar mar 1 ml depositar sitarlo lo en un tubo qu10 e contenga conte -2 nga 9 tas mls de Diluye nte de Bu Butte tterfi rfield eld’s ’s ante Tampo Tamponad o. Esta Est a ydiluci dildepo ución ón es de denom nomin inada adaque . Con Co n esta es 2 diluciones se continúa en el punto 5.3.3. 8 - En caso de ser neces necesario ario,, el laboratori laboratorio o puede realiz realizar ar más dilucione diluciones s sucesivas sucesivas con el objeto de obtener placas con recuentos contables.

1

3.5Protocolo de trabajo

1 - Rotu Rotula larr la las s plac placas as Petr Petrif ifil ilm m con con la iden identi tifi fica caci ción ón de la las s mues muestr tras as y la di dilu luci ción ón correspondiente. 2 - Col Coloc ocar ar la placa placa Petr Petrifi ifilm lm Rec Recue uento nto de Micro Microor orga ganis nismo mos s Aerobi Aerobios os Mesóf Mesófilo ilos s en una superficie plana. 3 - Levan Levantar tar el film superio superiorr e inocular inocular 1 ml de la dilu dilución ción decima decimall apropiada apropiada en el centro centro del film inferior. 4 - Baj Bajar ar cuida cuidado dosam samen ente te el film film sup superi erior or encima encima de la muest muestra ra,, ev evita itand ndo o la fo form rmaci ación ón de burbujas de aire. 5 - Colocar el aplicador aplicador con la cara lisa hacia ar arriba riba en e ell centro de la placa. placa. 6 - Presio Presionar nar ligeram ligeramente ente el centro centro del aplicad aplicador or para distr distribui ibuirr la muestra muestra uniform uniformemen emente. te. Distribuir el inóculo por toda el área de crecimiento del Petrifilm antes de que se forme el gel. No deslizar el aplicador por el film. 7 - Sacar el aplica aplicador dor y esp esperar erar al menos un minuto para para per permitir mitir que solidifique el gel. 8 - Por ca cada da dilució dilución n existente existente siemb siembre re en u una na o dos p placa lacas. s. 9 - Inc Incub ubar ar las pla placas cas en posic posición ión hor horizo izonta ntal, l, cara arriba arriba,, en pilas pilas de hasta hasta 20 placas. placas. La incubadora debe estar humidificada 10 - Incubar las placas Petrifilm Petrifilm Recuento de Microo Microorganismos rganismos Aer Aerobios obios Mesófilos por 48 ± 3 hrs a 35ºC ± 1ºC. 2

3.6Cá .6Cálc lcu ulo e in infforme rme de lo los s recue cuentos en pla lac ca

1 - Selec Seleccion cionar ar las placas placas que pr presen esenten ten un ra rango ngo de co conteo nteo entre entre 30 – 300 colonias. colonias. 2 - Alta Altas s conc concen entr trac acio ione nes s de colo coloni nias as en las las plac placas as oc ocas asio iona nará rá que que to toda da el ár área ea de crecimiento se vuelva roja o rosada. Ocasionalmente, en placas demasiado cargadas, el centro de la placa puede carecer de colonias visibles, pero pueden apreciarse muchas colonias pequeñas en los bordes. Cuando esto ocurre, diluir más la muestra para obtener un

3.7. Análisis Recuento de Microorganismos Aerobios

Métodos Recuento en placa, siembra en

 

Mesófilos (RAM) en alimentos

Recu Re cue ent nto o de de S. S. aur aureu eus s en en ali alime ment ntos os

NMP Staphylo Staphylococcu coccus s aureus aureus en alimentos alimentos

profundidad. Para análisis de productos congelados, refrigerados, precocidos, o preparados. Bacteriological Analytical Manual Online. Enero 2001 Recu Re cuen ento to en pla placa ca si siem embr bra a en en sup super erfi fici cie. e. Bacteriological Analytical Manual Online. Enero 2001 NMP. Bacteri Bacteriolog ological ical Analytic Analytical. al. Manual Manual Online. Enero 2001

Recuento de mohos y levaduras en alimentos

Recuento en placa, siembra en profundidadICMSFMicroorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis microbiológico microbiológ ico Vol I- 2ª Ed Detección de Nucleasa termoestable en Tatini-Cords-Gramoli. Screening for  alimentos Staphylococcal Enterotoxins in Foods. Food Technology April 1976, Lachica -Hoeprich Metachromatic agar diffusion microslide technique for detecting staphylococcal nuclease in foods. Appl. Microb. 168-169, Jan 1972 Recuento de Microorganismos Aerobios Recuento en placa, siembra en Mesófilos (RAM) en agua profundidad.Standard Methods for  Examination of Water and Wastewater 19th Ed 1995 Recuento de S. aureus en agua Recuento en placa siembra en superficie. Bacteriological Analytical Manual Online. Enero 2001 Recue Rec uento nto de de moho mohos s y levadur levaduras as en agu agua a Recue Rec uento nto en en placa, placa, siem siembra bra en en profundidadICMSFMicroorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis microbiológico Vol I- 2ª Ed. Detección de toxina de S. aureus en cepas Técnica Aglutinación Reversa Pasiva en aisladas de alimentos Látex (R P L A) Igarashi H. and Sugiyama J. 1987. Reversed passive latex aglutination test for the rapid and simple detection of  bacterial toxins. Culture Oxoid. vol 8 Nº 1 Recuento de microorganismos Heterótrofos Recuento en placa, siembra en en placa profundidadStandard Methods for  Examination of Water and Wastewater 19th Ed 1995

IVMATERIALES Y MÉTODOS a. MATERIALES

• • • • •

• •

Mechero de bunsen. Asa de vidrio esterilizado Horno estufa Contador de colonias Muestra problema   Néctar  Agua peptonada Agar nutritivo

 

•

Materiales de Vidrio:   

Tubo de ensayo3 unidades. Placas petri 3 unidades Pipeta 2 unidades.

b. MÉTODOS 1.

El recuento estándar en placas. Se util utiliz izaa pa para ra de dete term rmin inar ar el nú núme mero ro de gé gérm rmen enes es po porr gr gram amo o o mililitro del alimento en estudio, partiendo de la “serie de diluciones decimales”, mediante el empleo de técnicas en placas de agar.

2.

procedimiento o

o

o

o

o o

o

De la muestra problema tomar 1 ml. o 1 gr. y depositarlo en un tubo que contiene 9 ml. de diluyente, agitar, se obtiene la dilución 10 -1 (1/10). La diluciones se preparan de la forma siguiente: de la solución 10 -1 tomamos un ml. y la colocamos en un tubo que contiene 9 ml. de diluyente, mezclar bien y se obtiene la dilución dil ución 10-2 (1/100). Repeti Rep etimos mos el mismo mismo pro proce cedim dimien iento to par obt obtene enerr la diluci dilución ón 10-3 (1/1000). De cada dilución tomar 1 ml. y drenarlo en cada placa petri estéril y va vací cía, a, prev previa iame ment ntee rotu rotula lada da,, por por dupl duplic icad ado o (s (sem embr brar ar por  por  incorporación). Agregar agra licuado y ºT de 44 – 45ºC a las cajas petri (15 ml.). Mezclar por rotación dejar solidificar y agregar una capa de agar y dejar solidificar. Una vez solidificado el agar invertir las placas e incubar a 27ºC por  48 horas.

o

Luegoutilizando de la incubación efectuar el conteo d las colonotas en la placa  petri, una cuenta colonias colonias o un microscopio si simple. mple.

V RESULTADO Los microorganismos aerobios se detectaron en todas las canales por ambos métodos y las enterobacterias en el 77,5% y 72,5% de las canales muestreadas por  escisión e hisopado respectivamente. Los RA y RE (Log ufc/cm2) hallados a partir de muestras obtenidas por escisión (4,29 y 2,01 respectivamente) fueron significativamente (p