Reactivo de Bradford

Cuantificación de proteínas AUTOR: Mariel Rodríguez Salinas B. Ximena Olivares Guadarrama Francisco Javier Mora Ávila Xochitl Dávila González Asley María Solano Sánchez

Profesores: GERARDO PÉREZ HERNÁNDEZ, REFUGIO CRUZ TRUJILLO UEA: LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Trimestre: 13I

Autoevaluación:

Evaluación del profesor:

INTRODUCCIÓN En método Bradford se basa en utilizar un colorante hidrofóbico (comassie blue G-250) cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo que al entrar en contacto con la parte hidrofóbico del interior de una proteína se fija. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de proteínas, con los que se construye una curva de calibración: a mayor cantidad de proteínas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia, es por ello que se considera un cromóforo exógeno. Es un método que depende de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofobico y las proteínas, por lo que es sensible a la presencia de contaminantes tales como los restos de detergentes y líquidos orgánicos, ya que las proteínas pueden perder su estabilidad y perder su forma nativa, lo que provocaría la perdida de la unión entre el cromóforo y la zona hidrofóbica de las proteínas. Para determinar la concentración total de proteína se realiza una curva de calibración empleando una proteína patrón que generalmente es la seroalbumina bovina. Se preparan tubos testigos con distintas cantidades de proteína y otra disolución llamada “blanco” que solo contiene agua y reactivo Bradford y en los tubos testigos se les mantiene constante el reactivo Bradford siendo los volúmenes de todos los tubos iguales. Una vez preparados los tubos se mide la absorbancia a cada uno de ellos a una longitud de onda de 595nm, es calibrado el equipo con el tubo blanco (no contiene proteína) de esta manera se construye la gráfica de absorbancia vs concentración

OBJETIVOS   

Conocer el procedimiento empleado para cuantificación de proteína. Interpretar los resultados, mediante una curva de valores conocidos. Realizar un análisis matemático, para saber cuál es la concentración de proteína, una vez se haya realizado un ajuste lineal de la curva patrón.

Materiales y método.

Procedimiento 1. Se agrega 10 ml de agua destilada a cada uno de los tubos falcon que contienen las muestras tras las diferentes centrifugaciones, y se remueve con una espatula para poder diluir. 2. Se tomó 10 microlitros de cada muestra ya diluidas y se depositó en diferentes alicuotas, a cada una de ellas se le adicionó 990 microlitros de agua destilada. 3. Colocar en siete tubos de ensayo albumina en diferentes proporciones 0, 5, 10, 25, 40, 50 y 60 microlitros, añadir agua destilada hasta tener un volumen de 200 microlitros y posteriormente agregar 800 microlitros de reactivo de bradford. 4. Colocar en otros diez tubos de ensayo 10 microlitros de albumina de las difernentes alicuotas, 2 muestras de cada alicuota, 190 microlitros de agua destilada y 800 microlitros de reactivo de bradford. 5. Posteriormente se medira la absorbancia a cada una de las soluciones que contienen los tubos. Estas soluciones deberan ser deporsitadas en …….. para que puedan ser leidos por el espectrofotometro. El tubo uno se tomará como muestra blanco ya que no contiene albumina. TUBO

REACTIVO DE BRADFORD

1

800

200

0

2

800

195

5

3

800

190

10

4

800

175

25

5

800

160

40

ALBÚMINA

6

800

150

50

7

800

140

60

Tabla1. Cantidades a adicionar en los tubos. TUBO

REACTIVO DE BRADFORD

ALBÚMINA

MUESTRA Ø 1

800

190

10

2

800

190

10

MUESTRA 1ra. CENTRIFUGACIÓN 3

800

190

10

4

800

190

10

MUESTRA 2da. CENTRIFUGACIÓN 5

800

190

10

6

800

190

10

MUESTRA 3ra. CENTRIFUGACIÓN 7

800

190

10

8

800

190

10

MUESTRA DIALISIS 9

800

190

10

10

800

190

10

Tabla 2. Cantidades a adicionar en los tubos

RESULTADOS

Fig.1 Alícuotas con muestra de albúmina y diálisis respectivamente.

Fig. 2 Se colocó en cada tubo la cantidad señalada en la tabla de BSA y de agua.

Fig. 3 Posteriormente se añadió el Reactivo de Bradford a cada tubo. Es importante que el reactivo se adicione al final.

Fig. 4 Imagen de los tubos, una vez terminado de añadir todo lo necesario.

Fig. 5 Los tubos de la parte delantera contienen BSA y en la parte trasera contienen nuestra proteína X.

Fig. 6 Preparando el espectrofotómetro para analizar la absorbancia, tanto de la proteína patrón, como de la proteína X.

Fig. 7 Para colocar las muestras dentro del espectrofotómetro, se deben vaciar dentro de los pequeños tubos mostrados.

Fig. 9 Se cierra el espectrofotómetro y se presiona el botón para que nos señale la absorbancia.

Muestra Licuado

Fig. 8 Una vez colocada la muestra en ese tubo, se mete en el espectrofotómetro.

Fig. 10 Una vez obtenida la absorbancia, se retira el tubo pequeño y se vacía la muestra al tubo original.

Volumen

1° Centrifugación

2° Centrifugación Sulfato de Amonio

40%

3° Centrifugación Sulfato de Amonio

60%

Diálisis

Tabla 1 Disolución del sobrenadante en agua destilada.

[Poteína] Bradford

Tabla 2. Representa concentración BSA, agua y absorbancia de albúmina, proteína a comparar con LDH-Deshidrogenasa. Tubo 1 2 3 4 5 6 7

BSA (Albúmina) O 5 10 25 40 50 60

Absorbancia (nm) 0.562 0.204 0.357 0.710 0.987 1.047 1.233

[P] 30.710 11.1475 19.508 8.554 53.934 57.213 67.377

Curva patrón

R² = 0.9763

1.4

ABSORBANCIA

1.2 1

0.8 0.6

Series1

0.4 0.2 0 0

10

20

30

BSA (μL)

40

50

60

70

Gráfica 1. Representación lineal de absorbancia, con respecto a la concentración de albúmina en cada tubo.

Concentración de albumina

R² = 0.7712

1.4 A b s o r b a n c i a

1.2

1 0.8 0.6

Absorbancia(y)

0.4 0.2 0 0

20

40

60

80

[P]

Grafica 2. Representación de los datos obtenidos de la concentración de albúmina con respecto a la absorbancia En la siguiente tabla se presentan los valores de la cantidad de proteína y absorbancia obtenida en cada tubo de nuestra proteína desconocida. Muestra Tubo (Licuado) 1 2 Tubo (1ra ) 3 4 Tubo (2nda ) SA 40% 5 6 Tubo (3ra ) SA 60% 7 8

Concentración de próteína

Absorbancia (nm)

[P]

10 10

0.109 0.114

5.956 6.229

10

0.074 0.078

4.043 4.262

10 10

0.047 0.035

2.568 1.912

10 10

0.050 0.052

2.732 2.841

Tubo (Diálisis) 9 10

10 10

1.467 1.541

80.163 84.207

Concentración de proteína "x"

R² = 1

1.8 a B S O R B A N C I A

1.6 1.4 1.2 1 Absorbancia(y)

0.8 0.6 0.4

0.2 0 0

20

40

[PX]

60

80

100

Gráfica 3. Representación de la concentración de proteína desconocida con respecto a la absorbancia en cada muestra

DISCUSIÓN

El método para cuantificar proteína empleando cromoforos exógenos, puede ser afectado por los componentes de la solución como el tipo de buffer. La elección de uno u otro cromoforo va a depender de la cantidad que deseemos medir. En esta práctica se empleo azul de coomassie, y lo que se midió fue la unión de este a los diferentes tipos de proteína desconocida y albúmina. Una vez obtenidos los valores, se grafico la absorbancia de albúmina (ver grafica1) la cual será nuestra curva patrón ya que bien se sabe la concentración de proteína empleada para el análisis. Además se tiene la certeza de que la albúmina no está junto con otro tipo de proteínas sino esta ya purificada, característica que aun falta definir en el cumulo de proteína desconocida. Una vez que se adicionaron los reactivos necesarios (ver, procedimiento) se midió la absorbancia de albúmina, y los valores obtenidos fueron mayores a 0.204nm y menores a 1.233nm. Por dicha razón, la

absorbancia a diferentes concentraciones de proteína desconocida, no deben sobrepasar este rango, ya que no conoceríamos la cantidad ni actividad a analizar más allá de 1.233nm. Sin embargo, al medir la absorbancia de la proteína desconocida se encontraba entre 0.035nm a 1.541nm evidentemente menores y mayores a los ya establecidos, por eso se aumentó hasta tres veces la concentración de proteína en cada tubo. Pero tampoco, se obtuvieron los valores dentro del rango previsto, inferimos que las diluciones que contenían la proteína no se agitaron antes de pipetear la cantidad requerida o que el espectrofotómetro no fue calibrado adecuadamente, fueron las posibles causas que dieron lugar a datos, que no favorecen al análisis de cuantificación mediante el reactivo de Bradford. Por otro lado los valores, de concentración en cada tubo tanto, de albúmina como de proteína desconocida se muestran en las figuras 2 y 3. CONCLUSIÓN De acuerdo a las observaciones vistan el clase y los resultados obtenidos se puede llegar a la conclusión que el metodo de Brandford esta basado en el cambio de color del colorante esto se debe a las desigualas en la concentracion de proteina este intereactua especialmente con Arginina (es un aa básico con grupos R cargados positivamente), esto provoca un cambio en el máximo de absorbancia del colorante desde 465 a 595 nm. Este método nos permite cuantificar la concentración de proteínas presentes, basados en las propiedades que muestran las proteínas en solución. También se puede subrayar algunas de las ventajas de este método que son: La intensidad de absorbancia que depende del contenido de aminoácidos que tiene la proteína, de igual manera la unión colorante-proteína es estable durante algún tiempo (1 hora), por lo tanto resulta un método rápido, además se puede saber que tan fuertemente una substancia absorbe la luz a una longitud de onda proporcionada (coeficiente de extinción). En comparación con otros métodos por ejemplo el de Lowry es un técnica colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas tiene como desventaja que algunos agentes como los quelantes y Cu interfieren en la reacción esto provoca que las proteínas producirán diferentes intensidades de color dependiendo del contenido de Tyr y Trp. De acuerdo a la obtención de nuestra curva patrón de la cual partimos de datos conocidos en este caso fue (BSA) que se utiliza universalmente como proteína estándar y así poder determinar la cantidad de proteínas presentes en nuestra muestra incógnita. Esto se refleja en los resultados que obtuvimos con la absorbancia de nuestra proteína se vieron afectados directamente por nuestra técnica y manipulación de los reactivos y de los instrumentos que en este caso fueron las pipetas. Esto se pudo observar con mayor precisión al momento de graficar ya que los valores de la diálisis sobrepasaron los valores de 1.0 por lo tanto ya no pudimos utilizarlo o tomarlos en cuenta dentro de nuestra curva patrón

PERSPECTIVAS    

Tener cuidado de que las burbujas no se formen durante la agitación y la adicion de reactivos, porque esto puede generar que la enzima se desnaturalice. Es importante tener precisión al momento de utilizar las micropipetas, pues si se le da un manejo inadecuado pueden variar las cantidades que se desean medir. Se tienen que agitar las alícuotas para que no quede el precipitado en el fondo y asi no alteren los datos de absorbancia. Mantener cuidado con las puntillas para las micropipetas, evitando tocar las puntas pues podrían ser contaminadas.