Radicales Libres y Antioxidantes PDF

 

 

Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas

BLACPMA

 

ISSN 0717 7917

Fragaria vesca

Volumen 8, Número 6, Noviembre de 2009 Editorial

−  Edgar Pastene (Chile) Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante.   Revisiones

−  Ramirez et al. (Brasil) Efectos beneficiosos del extracto de frutas rojas y de sus antocianos.   −  Fredes (Chile) Antioxidantes en berries nativos chilenos. 

Artículos 

−  −  −  −  −  − 

Avello et al. (Chile) Extractos antioxidantes y antimicrobianos de  Aristoteli  Aristotelia a chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosméticos. Letelier et al. (Chile) Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation. Rojo et al. (Chile) Antioxidant capacity and polyphenolic content of twelve traditionally used herbal medicinal infusions from the South American Andes. Gorriti Gutiérrez et al. (Perú) Antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas del maíz morado ( Zea mays L.): Método de extracción. Gaviria Montoya et al. (Colombia) Actividad antioxidante e inhibición de la peroxidación lipídica de extractos de frutos de mortiño ( Vaccinium meridionale SW). Dadé et al. (Argentina) Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21 aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina).

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Comité Editorial | Editorial Board Fundadores

Gloria Saavedra

José L. Martínez (Chile) - Jorge Rodríguez (Cuba)

Centro de Tecnología Agroindustrial, Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia.

Editores

Luizde Simeoni Universidad Brasilia, Brasil

José L. Martínez  Escuela de Kinesiología, Universidad Santo Sant o Tomas, Talca, Chile.

Editores Asesores

José M. Prieto

School of Pharmacy, London University, Reino Unido. Gabino Garrido

Facultad de Ciencias, Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile.

Arnaldo Bandoni

Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Armando Cáceres

Universidad de San Carlos, Guatemala, Norman Farnsworth

Editores Ejecutivos Damaris Silveira

Facultade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, Brasil. Peter Taylor

Centro de Medicina Experimental, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela. Carla Delporte

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. Editores de Eventos María Inés Isla

Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional de Tucumán, Argentina. Marcelo Wagner

Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Co - Editores Bárbara Arias

Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales Universidad  Nacional de Córdoba, Argentina.  Rosa Degen

Universidad Nacional de Asuncion, Instituto de Investigaciones Interdisciplinarias, Paraguay. Jeannette Gavillan

Universidad de Puerto Rico. Harold Gómez

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Cartagena, Colombia.

College of Pharmacy, University of Illinois at Chicago, Estados Unidos. Michael Heinrich

The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Peter Houghton

Pharmaceutical Sciences Research Division, King's College, Coll ege, London, Reino Unido. Leonora Mendoza

Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Francisco Morón

Laboratorio Central, Universidad de Ciencias Médicas de La Habana, Cuba. Patrick Moyna

Facultad de Química, Universidad La República, Montevideo, Uruguay. Pulok K. Mukherjee

School of Natural Product Studies, Jadavpur University, Kolkata, India. Lionel Robineau

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de las Antillas y Guyana (UAG), Pointe à Pitre, Guadalupe. Elisabeth Williamson

School of Pharmacy, University of Reading, Reino Unido. Consejo Editorial Talal Aburjai, Faculty of Amman, Jordan  Christian Agyare, College

Pharmacy, University of Jordan,

Edgar Puente

of Health Sciences, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutics, KNUST, Kumasi, Ghana. Julio Alarcón, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad del Bio Bio, Chillán, Chile. Rocío Alarcón, The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Jorge Alonso, Asociación de Fitoterapia de Argentina, Buenos Aires, Argentina. Giovanni Apendino, DISCAFF, Universidad del Piemonte Oriental, Novara, Italia.

Centro de ToxicologíaGabriela y Biomedicina, Santiago de Cuba, Cuba, Ricciardi Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes, Argentina,

Elizabeth Barrera, Sección Botánica, Museo Nacional de Historia  Natural, Santiago, Chile. Bhaskar Behera, Agharkar Research Institute, Plant Science Division, Pune, India

Vicente Martínez

Escuela de Agricultura, Universidad de San Carlos, Guatemala. Edgar Pastene

Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Chile. Janet Piloto Ferrer

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos La Habana, Cuba, Edison Osorio

Universidad de Antioquia, Colombia

 

 

Salvador Cañigueral, Facultad de Barcelona, España. Sergio Castro, Facultad de Química

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Farmacia, Universidad de

Pedro Melillo de Magalhaes, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas

Santiago de Chile. Geofrey Cordell, College of Pharmacy, Illinois University at Chicago, Estados Unidos.

Químicas e Biológicas, UNICAMP, Campinas, Brasil. Fabian Michelangeli, Centro de Biofisica y Bioquimica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela. Brenda Modak, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile.

Rene Delgado , Centro Nacional Coordinador de Ensayos Clínicos, La Habana, Cuba.

Miguel Facultad de Medicina, de Chile.  John AMorales, .O. Ojewole , Faculty of HealthUniversidad Sciences, University

y Biología, Universidad de

Department of Pharmaceutical Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Jenny Duran, Facultad de Ciencias Químico Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor Real y Pontificia de San Francisco Xavier de Chuquisaca, Sucre, Bolivia.  Josean Fechine Tavares, Laboratorio de Tecnología Farmacéutica, Universidade Federal da Paraiba, Brasil. Elena Fornet, Instituto Cubano de Meteorología, Holguín, Cuba. Mildred García, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica. Martha Gattusso. Área de Biología Vegetal, Universidad  Nacional de Rosario, Argentina. Alejandra Gil, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Ileana González, Universidad Católica del Maule, Talca, Chile. Rodolfo Juliani, School of Environmental and Biological

of KwaZulu-Natal, Sudáfrica. Horacio Olivo, Division of Medicinal and Natural Products Chemistry, Iowa University, Estados Unidos. Mahendra Rai, Department of Biotechnology, Amravati University, Maharashtra, India. Luca Rastrelli, Dipartamento di Scienze Farmaceutiche, Universita de Salerno, Salerno, Italia. Elsa Rengifo, Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana, Iquitos, Perú. José Luís Ríos, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, España. Alicia Rodríguez, Universidad de La Habana, Cuba. Chaiyong Rujjanawate, School of Health Science, Mae Fah Luang University, Chiangrai, Tailandia.  Aurelio San Martín, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile.

Sciences, Rutgers University, New Jersey, Uni dos. Unidos. Luis Kanzaki, Facultad de Ciencias de laEstados Salud, Universidade de Brasilia, Brasil. Ana Ladio, Departamento de Ecología, Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Argentina. Patricia Landazuri, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad del Quindio, Armenia, Colombia. Claudio Laurido, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Suzana Leitao, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. Olga Lock de Ugaz, Departamento de Ciencias, Pontificia Universidad Católica del Perú. Victor López, Facultad de Farmacia, Universidad de Navarra, España.  Subhash C. Mandal, Faculty of Engineering and Technology, Jadavpur University, University, Kolkata, India.

Guillermo Facultad de Ciencias Médicas, Universidad  Nacional deSchinella La Plata,, Argentina. Andrew Scholey, Brain Sciences Institute, Melbourne, Australia.  Natasa Skalko-Basnet, Department of Pharmacy, University of Tromsø, Noruega. Nilka Torres, Centro Regional Universitario de Azuero, Universidad de Panamá. René Torres, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Angélica Urbina, Facultad de Agronomía, Universidad de Concepción, Chile. Beatriz Varela, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Carlos Vicente, Editor Revista Biodiversidad, Argentina. Mohammad Zafarullah, University of Montreal, CHUM-NotreDame Hospital, Montreal, Canada. Talal Zari, Faculty of Science, King Abdulaziz University, Arabia

Abdul Manan Mat-Jais, Department of Biosciences, University of Putra, Putra, Malasia.

Saudita.

Saikat Dewanjee,

 

BLACPMA es una publicación de la Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáti cas   http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. ((http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder.  Nothing in this license impairs or restricts the author's moral moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia “Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional” ((http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

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© 2009 The Authors © 2009 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 8 (6), 449 - 455 BLACPMA ISSN 0717 7917

 

Editorial

Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante [Current state of the search for plants with antioxidant activity] activity] Edgar R. PASTENE*1 1Laboratorio de Farmacognosia, Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Casilla 237, Barrio Universitario s/n, Universidad de Concepción, Concepción, Concepción, Chile.

 

Abstract Research on the antioxidant properties of edible and medicinal plants is marking sustained growth o decades. A significant nu mber of products obtained from the plant Kingdom like essential oils, alkaloids and polyphenols have antioxidant effects which are evidenced by different in vitro and in vivo assays. However, it is difficult to harmonise and extrapolate the reported results, given the variety of available assays and constraints associated with each of them. The potential of polyphenols as antioxidant agents has been the most popular subject due to its high consumption in the diet and their ubiquitous presence in many plant species. The current state of knowledge shows us that their potential benefits as prophylactic and therapeutic agents are still not fulfil but their applications in the fields of nutraceutics and functional ingredients have been more immediate. In such products, besides their antioxidant capacity, other  properties such as the anti-microbial and gastro and cardio-protective activities should be considered. Their use in isolated form is controversial with some authors questioning the real contribution of polyphenols as responsible for the benefits of plants and foods because many polyphenols do not achieve the systemic concentrations required to exert their effects. Therefore, there is an urgent necessity to shed some light about other plant components, a concern which should be shared by the scientific c ommunity involved in this area of expertise. Latest evidence points towards a primary action of these compounds in the digestive tract rather than a systemic one, where not only they could display antioxidants properties but that also act as pro-oxidants and/or free radical generators. Thereby, researchers are encouraged to expand the vision currently ascribed to the polyphenolic antioxidants, by proposing new models and experimental protocols, according to the final destination of these compounds. Antioxidants;; Free radicals; Medicinal plants; polyphenols; essential oils; functional food Keywords: Antioxidants

Resumen La investigación de las propiedades antioxidantes de las plantas medicinales y alimenticias lleva décadas marcando un crecimiento sostenido. Un número importante de productos obtenidos del reino vegetal, como los aceites esenciales, alcaloides y los polifenoles, posee efectos antioxidantes los cuales son evidenciados mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo. Sin embargo, resulta difícil armonizar y extrapolar los resultados reportados, dada la gran variedad de ensayos disponibles y las limitac iones asociadas a cada uno de ellos. Por su elevado consumo a través de la dieta y la presencia ubicua en muchas especies vegetales, el potencial de los polifenoles como agentes antioxidantes ha sido el más estudiado. El estado actual del conocimiento nos muestra que además de sus beneficios como agentes profilácticos/terapéuticos, para dichos compuestos debemos visualizar aplicaciones en el campo de las formulaciones nutracéuticas e ingredientes funcionales. En tales productos, a la capacidad antioxidante se sumarían otras propiedades como las antimicrobianas, gastro y cardio-protectoras. Aunque en forma aislada, algunos autores han puesto en duda el aporte de los polifenoles como entidades únicas que expliquen los  beneficios de las plantas y alimentos. Particularmente, se sabe que muchos no logran las concentraciones sistémicas necesarias para ejercer sus efectos, lo que  plantea la necesidad de buscar explicaciones en otros componentes vegetales. Dicha preocupación debiera ser compartida por to da la comunidad científica involucrada en el área. En virtud de lo anterior, se han planteado que el sitio de acción primordial de estos compuestos estaría en el tubo digestivo donde no sólo podrían actuar como antioxidantes sino que también como pro-oxidantes e incluso generadores de radicales libres. Por todo lo dicho, se llama a los investigadores a ampliar la mirada que hasta ahora se tiene de los antioxidantes, proponiendo nuevos modelos y protocolos experimentales, más acordes con el destino final de estos compuestos.

Palabras Clave: Antioxidantes; radicales libres; plantas medicinales; polifenoles; aceites esenciales; alimentos funcionales. Recibido | Received: October 22, 2009.  Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version:  November 12, 2009.  2009.   Publicado en Línea | Published Online:  November 30, 2009.   Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests.   Financiación | Funding: This work was supported by a grant from the Universidad Nacional de La Plat a (Programa de Incentivos X 446) This article must be cited as: Edgar R. Pastene. 2009. Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aro mat 8(6):449 8(6):449 –   –  455.  455. {EPub November 30, 2009}. 

*Contactos | Contacts: Edgar R. PASTENE. E-mail:  E-mail:  [email protected] . [email protected] .  

Introducción:

BLACPMA es una publicación de la Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas Aromáticas   http://creativecommons.org/licenses/by mons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ -nc-nd/3.0/ ) This is an open access article distributed under the terms o f a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-N Attribution-Non-Commercial-No o Derivative Works 3.0 Unported Licence.http://creativecom ( which permits to copy, distribute and t ransmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts t he author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los términos de una licencia “Atribución Creativa Común-No Común-No Comercial-  No No trabajos derivados 3.0 Internacional” Internacional” (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) nd/3.0/deed .es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del t itular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

 

Pastene

Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante

INTRODUCCIÓN

determinar con mayor claridad aspectos mecanísticos y concentraciones necesarias para logar los efectos  pesquisados.. Sin embargo, cabe señalar que aún se  pesquisados esta muy lejos de entender cómo las plantas contribuyen a prevenir o mejorar enfermedades ligadas a la producción de radicales libres. Lo anterior representa una tarea pendiente que necesariamente requiere de una mirada diferente. Al respecto, en el mundo científico existe una tendencia sostenida a considerar los aspectos siguientes:

En la presente edición de BLACPMA se presenta una serie de artículos científicos que cubren varios aspectos de la investigación en plantas medicinales con propiedades antioxidantes. En dichos trabajos, el lector puede encontrar esfuerzos destinados a generar datos sobre la capacidad antioxidante de plantas medicinales de uso regional, y cómo ésta se asociaría con algunas de las propiedades terapéuticas reportadas por la etnomedicina (Rojo et al., 2009; Dadé et al., 2009, éste número). Desde hace varias décadas se ha venido reconociendo que el consumo regular de antioxidantes contribuye a disminuir el riesgo relativo de desarrollar enfermedades crónicas degenerativas no-transmisibles. Al respecto, gran  parte de esta literatura hace referencia a fuentes alimentarías ricas en antioxidantes, principalmente del tipo polifenólico. En este número, la necesidad de  profundizar en en la química química y actividad actividad biológica de los  pigmentos antociánicos antociánicos de berries nativos y granos, es abordada en tres trabajos (Ramírez et. al., 2009; Fredes, 2009, Gorrini et al., 2009, éste número). Las  propiedades antioxidantes  propiedades antioxidantes no sólo deben ser enfocadas desde el punto vista de las interacciones químico-biológicas señaladas anteriormente, además,  pudieran verse como una oportunidad para frenar el deterioro oxidativo que ciertamente afecta a los alimentos y los productos de uso cosmético. Dichos aspectos, en conjunto con la determinación de sus  propiedadess  propiedade antimicrobianas antimicrobianas sobre patógenos patógenos relevantes a la piel, son reportados para extractos de las hojas de Ugni molinae  molinae  y  Aristotelia chilensis chilensis  (Avello et al., 2009, éste número). Dadas sus características fisicoquímicas, los aceites esenciales  pueden ejercer interesantes interesantes efectos antioxidantes antioxidantes tanto en matrices alimentarias como en sistemas  biológicos. Hasta hace poco, era infrecuente infrecuente encontrar trabajos que describieran otros efectos de los antioxidantes, particularmente aquellos que  potencialmente  potencialm ente pueden modular la biotransformación de xenobióticos. Por tal motivo, resulta altamente relevante el enfoque planteado por Letelier et al., (2009, éste número) y sus observaciones relativas al efecto de un extracto de Romero sobre las reacciones de biotransformación. Los ensayos utilizados en éste y otros estudios realizados con células, se podrían clasificar en un nivel más avanzado, debido a su mayor cercanía con sistemas biológicos complejos. Al existir un mayor número de sustratos biológicos oxidables y sistemas antioxidantes endógenos (enzimáticos o no), éstos ensayos permiten www.blacpma.org

RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES, CAMBIO DE PARADIGMAS. Aspectos metodológicos: ¿Usamos uno o más ensayos antioxidantes? La importancia de los polifenoles en salud humana ha sido ampliamente revisada (Ross, 2002; Kim et al., 2003; Kris-Etherton et al., 2004; Raumussen et al., 2005; Ramassamy, 2006; Lira Mora et al., 2009). No obstante, uno de los aspectos críticos de la investigación sobre la capacidad antioxidante de productos naturales se relaciona con la elección de las herramientas de medición. El estado del arte nos indica que cada vez es necesario contar con una batería de ensayos que nos permitan obtener información complementaria. Al respecto, en esta edición se incluye un trabajo donde el potencial antioxidante de los pigmentos antociánicos de frutos de Mortiño fue evaluado mediante varios ensayos (Montoya el al., 2009, este número), destinados a revelar el potencial de este fruto como agente antioxidante de matrices oleosas. Al respecto, el uso de radicales estables coloreados como el DPPH, ABTS, DMPD, o reactivos como el FRAP; se recomiendan como criterio preliminar para  jerarquizar las distinta  jerarquizar distintass plantas, extractos extractos o fraccione fraccioness de éstos, de acuerdo a su poder antioxidante. Dado que en los ensayos mencionados ocurren reacciones de transferencia de electrones y/o hidrógeno, el adecuado conocimiento de la química de tales sistemas es condición  sine qua non  para interpretar interpretar correctamente los resultados, particularmente cuando estos ensayos se aplican a muestras de fluidos  biológicos. Como se puede apreciar en muchos estudios, los datos a menudo son cruzados con el contenido de  polifenoles totales de las muestras, determinados determinados como equivalentes de ácido gálico (GAE). Sin embargo, cada vez es más frecuente recurrir a técnicas de separación acopladas a sistemas de

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detección como el arreglo de diodos (DAD) o la espectrometría de masas (LC-MS). Dichas técnicas  permiten diseccionar diseccionar de mejor manera la actividad actividad antioxidante y asignarla a un grupo específico de compuestos. Si bien es cierto, no existe una metodología que pueda ser considerada como un “Gold Standard ”, ”, numerosos estudios consideran que ciertos ensayos como el ORAC (Oxygen ( Oxygen Radical  Absorbance Capacity), Capacity), poseen ventajas comparativas en relación al resto (Ou et al., 2001). El índice ORAC  permite combinar en un solo parámetro, información información sobre la cinética de oxidación utilizando el área bajo la curva de decaimiento de la fluorescencia o absorbancia de una sonda como la fluoresceína (ORAC-FL) o el rojo de pirogalol (ORAC-PGR), la cual es desafiada por radicales peroxilo (AAPH). En el ensayo ORAC-FL los tiempos de inducción están fuertemente influenciados por el número de grupos fenólicos presentes en la muestra mientras que, en el ensayo ORAC-PGR, dichos tiempos prácticamente no se observan y el decaimiento de la absorbancia se

empleado para la determinación de la capacidad antioxidante de polifenoles, ácido ascórbico y tioles (Apak et al., 2004; Cekic et al., 2009). El ensayo también se ha adaptado para al análisis de antioxidantes hidrofílicos como lipofílicos (Celik et al., 2007) y en la determinación de la capacidad captadora de radical hidroxilo (Bektasoglu et al., 2008). Hace poco, el uso del índice ORAC como criterio de poder antioxidante ha sido empleado por la USDA (United (United States Department of Agriculture), Agriculture ), la cual ha publicado una serie de tablas con la composición antioxidante de alimentos y plantas medicinales de uso en Norteamérica. (http://www.ars.usda.gov/nutrientdata/ORAC) . Recientemente, dicha experiencia ha sido tomada como ejemplo por el Laboratorio de Antioxidantes del Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Chile (INTA, CORFO-Innova, http://www.inta.cl ). Ellos se han embarcado en un ambicioso proyecto para analizar el contenido de antioxidantes de gran parte de los frutos

ve por la reactividad los influenciado fenoles de principalmente la muestra. Recientemente, se de ha  planteado que ambos índices ORAC (FL y PGR) son complementarios y su relación es un mejor indicador de la calidad promedio de los antioxidantes de una muestra (Poblete et al., 2009). El mismo grupo de investigadores, ha propuesto el ORAC-PRG como una forma rápida de determinar el contenido específico de vitamina C en extractos y fluidos  biológicos, dado que esta sustancia es una de las  pocas que genera tiempos de inducción en forma concentración-dependiente (Atala et al., 2009; Torres et la., 2008). En busca del “Santo “Santo Grial metodológico”, metodológico ”, y con con el objetivo de ampliar su

consumidos en Chile, convirtiéndose en de el datos segundo  país del mundo en contar con una base de similares características a la de la USDA.

espectro de aplicación, varios refinamientos han sido introducidos a este ensayo. Por ejemplo, el uso de ciclodextrina metilada permite obtener el índice ORAC lipofílico en distintas muestras vegetales o fluidos biológicos (Huang et al., 2002). Adicionalmente, el ensayo ha demostrado ser altamente versátil, debido a que en él se han introducido modificaciones que permiten medir el efecto de antioxidantes sobre otras especies reactivas del oxígeno y nitrógeno dando origen a variantes para el radical hidroxilo (HORAC), peroxinitrito (NORAC), anión superóxido (SORAC), (Ou et al., 2002; http://www.brunswicklabs.com/). Paralelamente, otros investigadores han desarrollado

 polifenoles podrían actuar como generadores generadores de especies reactivas del oxígeno (ERO) ha sido abordada por varios investigadores (Aragawa et al ..,, 2003; Arakawa et al . 2002, 2004; Aoshima et al . 2005). Utilizando como modelo de polifenol, catequinas de té verde (cuya propiedad bactericida es conocida), los autores demostraron que a pH 7-8 (o superiores), tal tipo de estructura es capaz de generar cantidades significativas de peróxido de hidrógeno. De acuerdo a los autores, la generación de peróxido de hidrógeno podría explicar el efecto bactericida de los flavan-3-oles. La habilidad de las catequinas para generar peróxido de hidrógeno sería favorecida por el arreglo de grupos hidroxilo en este tipo de moléculas,

un ensayo denominado CUPRAC (Cupric (Cupric ion reducing antioxidant capacity), capacity), el cual se ha

lo que permitiría la disociación del H + en solución y un electrón en el fenol que reduce al oxígeno,

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Cambiando paradigmas: Uso de las plantas medicinales y alimenticias como fuente de sistemas generadores de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno. Cada vez es más evidente que los polifenoles son moléculas promiscuas que pueden afectar distintas funciones biológicas para bien o para mal. Al respecto, existe creciente evidencia que éstos compuestos en determinadas condiciones pueden actuar como pro-oxidantes. La forma en que los

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generándose en consecuencia anión superóxido. El anión superóxido posteriormente sufre reducción por la catequina (ej. EGCG), lo que lleva a la formación 2de O2 ; adicionalmente, el protón se combina con el superóxido generando H2O2. Este mecanismo no sólo explicaría la generación de H2O2  producida por catequinas puras sino también por parte de infusiones de té negro, té verde y té Oolong   conteniendo del orden de 1-2.4 x 10 -4  mol/L de catequinas. Estas concentraciones de H2O2  serían suficientes para ejercer una acción bactericida en cepas Gram  positivas y negativas (Arakawa et al.,  al.,  2004). La generación de H2O2 por parte de las catequinas catequinas del té verde no sólo es un fenómeno concentracióndependiente sino también dependiente del contexto celular (Yamamoto et al.,  al.,  2004). Llama la atención que en estos modelos se observe una capacidad de inducir muerte y/o arresto de la proliferación en líneas celulares inmortalizadas derivadas de tumores (Wang, 2000; Lu et al ., ., 2002). Esta polifuncionalidad por parte de algunos compuestos

ácidas del estómago. El NO, puede ser oxidado a nitrito nuevamente a nivel portal y finalmente ser convertido en NO en aquellos vasos sanguíneos que  presentan resistencia. resistencia. El aaumento umento de la producción producción de  NO a nivel gástrico también puede ser beneficioso, beneficioso,  protegiendo la mucosa en aquellos pacientes pacientes sometidos a tratamientos con anti-inflamatorios no esteroidales (AINE) o infectados por  Helicobac  Helicobacter ter  pylori.. Más aún, se ha observado que ciertos  pylori  polifenoles promueven promueven la formación formación no enzimática enzimática de  NO en el estómago, estómago, lo que consecuentemente consecuentemente  produce una relajación relajación del músculo liso vascular in vivo (Silva Rocha, 2009). Así, para las manzanas (cuya pulpa es rica en ácido clorogénico), ya se había reportado un aumento de la producción gástrica de  NO a partir del nitrito previamente generado por las  bacterias de la lengua (Peri et al., 2005). De esta manera, se han ido sumando reportes de efectos de los polifenoles que no requieren concentraciones  plasmáticas  plasmátic as elevadas de éstos y que nos llevan a  pensar que el sitio más importante de acción de ellos

fenólicos por ejemplo), evidentegenerar si se considera (EGCG, que además, éstos es podrían ambientes oxidativos diferenciales que permitan  proteger a las células del huésped de las ERO y por otro lado promover la apoptosis de las células tumorales (Yamamoto, et al ., ., 2003). En otro ámbito, la investigación de las  propiedadess antioxidantes in vivo, habitualmente  propiedade habitualmente está expuesta a las vicisitudes propias de los sistemas  biológicos. Resulta emblemático emblemático el caso de la elevación de la capacidad antioxidante plasmática  post-consumo  post-consum o de manzanas, manzanas, la cual finalmen finalmente te fue asociada a un aumento del ácido úrico derivado del metabolismo metabolis mo de la fructosa (Lotito y Frei, 2004). Aún

es el tracto digestivo (vide (vide infra). infra).

más sorprendente resultan los hallazgos recientemente publicados en la revista  Hyperten  Hypertension sion   (Webb et al., 2008), en la cual se reporta que los efectos anti-hipertensivos, vasoprotectores y antiagregantes plaquetarios de muchos frutos estarían más bien asociados a su concentración de nitratos. En efecto, en voluntarios sanos, la administración de 500mL de jugo de betarraga (remolacha) produjo una disminución significativa de la presión sanguínea, la cual coincidió con un pico plasmático de nitrito. La disfunción endotelial también fue contrarestada por el consumo de jugo de betarraga. Los autores proponen que la reconversión entero-salival de nitrato a nitrito (facilitada por bacterias anaerobias situadas en la superficie de la lengua), facilita la posterior  producción de óxido nítrico (NO) en las condiciones condiciones www.blacpma.org

¿EL TRACTO GASTROINTESTINAL COMO PRINCIPAL SITIO DE ACCIÓN DE LOS ANTIOXIDANTES? Sabemos que la actividad antioxidante parece estar asociada a determinadas especies vegetales de uso médico y/o alimenticio, y por consiguiente  pudiera estar limitada a sólo algunas familias de metabolitos secundarios. Ejemplos de esto lo constituyen diferentes bayas (berries ricos en  polifenoles), algunas crucíferas crucíferas (brócoli rico en glucosinolatos), propóleos y especies con aceites esenciales. Al respecto, dentro de los grupos de metabolitos secundarios más estudiados destacan los  polifenoles. Sin embargo, como ya adelantamos, adelantamos, lo disperso de la información relativa con su absorción, metabolismo, distribución y excreción ha llevado a muchos investigadores a poner en duda los efectos de los polifenoles a nivel sistémico. De esta forma, se ha sugerido que el primer y tal vez principal sitio donde éstos compuestos podrían ejercer su acción antioxidante, sería el tracto gastrointestinal  (Revisado  por Clifford, 2004).  Muchos estudios en humanos destacan que sólo algunos polifenoles son absorbidos en el intestino delgado. Cabe destacar que la mayor  parte de los que logran llegar a nivel sistémico sistémico lo hacen conjugados por glucuronidación, sulfoconjugación y metilación, y siempre en concentraciones plasmáticas extremadamente bajas.

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Sólo entre un 5 y un 10% de los polifenoles absorbidos circulan en forma no-conjugada. Por lo tanto, es muy difícil realizar estudios reales de farmacocinética, y las muestras de plasma u orina habitualmente deben ser sometidas a hidrólisis con  glucoronidasa y/o sulfatasa para liberar las agliconas. Tales estudios pseudos-farmacocinéticos han llevado a concluir las concentraciones en  plasma sonque bajos, muy variables de y polifenoles con máximos transitorios (Tmáx  1 - 2.5 horas). Es improbable que los conjugados sobrepasen concentraciones de 10 M en total, o de 1 M en el caso de las agliconas. Puesto que es un hecho que gran parte de los polifenoles no se absorben, entonces es válido formular la pregunta ¿qué funciones pueden cumplir esta gran masa de antioxidantes en las diferentes porciones del tubo digestivo? Recientemente, Selma et al., (2009), han  publicado una impecable revisión que da cuenta del universo de potenciales interacciones y reacciones entre los polifenoles y la biota intestinal. En este trabajo se sugiere que el efecto sistémico de los

 bactericida, asociada  bactericida, asociada probablem probablemente ente a mecanismos mecanismos inespecíficos que no necesariamente guardan relación con su actividad antioxidante (citoprotectora) sobre las células del epitelio gástrico (Puupponen-Pimia et al.,   2001, 2008). Una de las hipótesis que se ha al., aceptado como paradigma, es que los polifenoles ejercen parte de su actividad antimicrobiana mediante una interacción no específica con componentes de la membrana plasmática  (Mori et al.,  al.,  1987; Haraguchi et al.,  al.,  1998; Funatogawa et. al., 2004). al., 2004). Otro enfoque que resulta altamente atractivo, es cómo los  polifenoles pueden modular la adhesión tanto de  bacterias patógenas como de aquellas con función  probiótica (Lactobacilo (Lactobacilos). s). Mientras la mayoría mayoría de los  polifenoles muestra capacidad capacidad antimicrobiana antimicrobiana en distintos rangos, sólo algunos como la floridzina (chalcona) y la rutina (flavonol), aumentan la adherencia de  Lactobac  Lactobacillus illus rhamosus  rhamosus  a células Caco-2 (Parkar et al., 2008). Interesantemente, la  propiedad adhesiva adhesiva de las bacterias bacterias prebió prebióticas ticas es uno uno de los tantos obstáculos que se deben sortear para

 polifenoles seria atribuible a la modulación modulación del equilibrio bacteriano intestinal y a los metabolitos intestinaless generados a partir de éstos. intestinale El estrés oxidativo asociado a la respuesta inmune que sucede a la presencia de algunos patógenos como  Helicobacter  Helicobac ter y  Salmonella, Salmonella, representa uno de los  principaless mecanismos  principale mecanismos de defensa pero pero que, a su vez vez ocasiona daño colateral a la mucosa gástrica e intestinal. Por lo tanto, parece muy relevante disponer de eficientes sistemas antioxidantes (tanto endógenos como dietarios) en la zona de infección. Sin embargo, algunos patógenos como  H. pylori pylori   poseen estrategias de supervivencia contra el estrés oxidativo que hacen surgir la interrogante de   cuán beneficiosa

lograr un efecto beneficioso en el intestino (Revisado  por Prakash et al., 2008) En virtud de lo anterior, ¿En qué medida se vinculan mecanísticamente la actividad antibacteriana  antibacteriana  con la actividad antioxidante de los polifenoles? Al respecto, dependiendo del grupo de metabolitos secundarios presentes en la especie estudiada, existiría una asociación “no“no-obligada” entre la actividad antioxidante de algunos polifenoles y su actividad anti-microbiana (Correia et al., 2004; Shin et al. 2005). Por ejemplo, se sabe que las antocianidinas contribuyen en forma importante a la capacidad antioxidante del arandano, no obstante, recientemente se ha demostrado que la inhibición de

 puede ser la administración administración o ingesta de antioxidantes. Los antecedentes sugieren que estos compuestos podrían tener un efecto protector, no sólo  para el huésped (citoprotegiendo (citoprotegiendo el epitelio), sino también sobre el  H. pylori (contribuyendo a sus defensas antioxidantes). Teóricamente, al aumentar la capacidad de las bacterias  bacterias  para para “lidiar” con las ERO generadas por el sistema inmune del huésped, se aumentaría también la posibilidad de que la infección se consolide. No obstante, estudios en los cuales se han testeado extractos de plantas ricos en compuestos antioxidantes dan cuenta de efectos anti- H.  H. pylori tanto in vitro  vitro  como in vivo  vivo  (Nostro et al., 2005; Mahady et al., 2005; Ustun at al., 2006). De acuerdo

la adhesión de H. de H. pylori, a la mucosa gástrica humana se debería, más bien, a sus constituyentes de alto peso molecular (procianidinas) (Burger et al ., ., 2000).

a antecedentes preliminares, los compuestos  polifenólicos  polifenólicos poseen reconocida actividad actividad www.blacpma.org

PALABRAS FINALES. Durante años, diversas sub-disciplinas de la química y la biología nos han enseñado y revelado aspectos sesgados, que sólo permiten una visión  parcial de la complejidad complejidad de los procesos oxidativos. oxidativos. Claramente se requiere complementar las herramientas de medición existentes e incorporar  paulatinamente  paulatinam ente tecnologías tecnologías de punta así como consensuar metodologías entre academia e industria. Lejos aún de entender como se mueven los delicados engranajes que sub-yacen al equilibrio redox celular, en algún punto se hace absolutamente necesario que

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la investigación de antioxidantes tienda hacia modelos celulares. En ellos se podría refinar y comprender el comportamiento de estas sustancias en un escenario real, lo que finalmente nos permitirá diseñar por ejemplo, mejores estrategias de  prevención y tratamiento tratamiento de las enfermedade enfermedadess o crear nuevos alimentos funcionales. Para que la tarea sea exitosa, se requiere de un esfuerzo mancomunado de colaboración entre todos aquellos investigadores que deseen ampliar la frontera del conocimiento. En otras  palabras, a ratos los científicos científicos debiéramos debiéramos abandonar abandonar  paulatinamente  paulatinam ente los demiurgos propios del Hegelianismo, que ponen al pensamiento por sobre la realidad.

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© 2009 The Authors © 2009 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 8 (6), 456 - 468 BLACPMA ISSN 0717 7917

 

Revisión | Review

Efectos beneficiosos de extractos de frutas rojas y de sus antocianos [Beneficiall properties of red berries extracts and their anthocyanins] [Beneficia anthocyanins] Maria Rosana RAMIREZ1*, Laura GERACITANO 2, Daniela MARTI BARROS 2, Amelia Teresinha HENRIQUES1*  1

Universidade Federal de Rio Grande do sul (UFRGS). Av. Ipiranga 2752, PoA, RS, Brasil;

2

 Fundação Universidade Federal de Rio Grande (FURG), Av. Av. Itália Km 8, CEP CEP 96.201-900, RS, Brasil.

Abstract Epidemiological reports have indicated that individuals who consume diets containing large amounts of fruits and vegetables may reduce their risk for developing age-related diseases. These reductions might be expressed as improvements in motor and cognitive behavior. This review summarized data related to in vitro  vitro  and in vivo  vivo  antioxidant activity of polyphenols, emphasizing the main role of anthocyanins. In particular, their physiological effects, their metabolism, bioavailability as well as their direct interaction with lipids and DNA.

Keywords: Red berry; Antioxidant activity; Anthocyanins; DNA.

Resumen Los polifenoles constituyen un grupo de sustancias químicas considerados metabolitos secundarios de las plantas. Actualmente existe un renovado interés por estos compuestos en virtud de su actividad antioxidante y sus posibles implicaciones beneficiosas en la salud humana, tales como prevención de enfermedades crónico-degenerativas. En esta revisión, resumimos los datos relacionados con la actividad antioxidante de in vitro e vitro e in vivo de vivo de los polifenoles,  particularmente los antocianos. Concretamente, sus efectos fisi ológicos, su metabolismo, biodisponibilidad así como su interacción di recta con moleculas de relevancia biológica como la molécula de ADN y los lípidos.

Palabras Clave: Frutas rojas; Antocianos; Actividad antioxidante; ADN.

Recibido | Received: December 9, 2008.   Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version:  May 12, 2009.  2009.   Publicado en Línea | Published Online:  November 30, 2009   Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests.   Financiación | Funding: This work was not financed. This article must be cited as: Maria Rosana Ramirez,  Laura Geracitano, Daniela Marti Barros  , Amelia Teresinha Henriques. 2009. E fectos beneficiosos de extractos de frutas rojas y de sus antocianos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):456 –  8(6):456  –  468.  468. {EPub November 30, 2009}.

0055-51-3308-5258 258 Fax: 0055-51-3308-5 0055-51-3308-5437. 437. *Contactos | Contacts: Email  Email [email protected] ; [email protected]  Tel: 0055-51-3308-5

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Ramírez et al.

Propiedades antioxidantes de las frutas rojas

INTRODUCCIÓN Durante el año 1989 la Organización Mundial de la Salud realizó un trabajo de investigación denominado proyecto Mónica, el mismo suscitó interés debido a los resultados obtenidos que demostraron que las tasas de mortalidad por

colesterol y el 15% son hipertensos. No obstante, existe una ciudad denominada Veranópolis, la misma misma está situada en el estado de Rio Grande do Sul, la cual se destaca por presentar el mayor índice de expectativa de vida del país y el tercero en el mundo. Los trabajos de investigación realizados en ésta ciudad también relacionaron el elevado índice de vida

enfermedades cardiovasculares en Francia eran menores que en otros países industrializados como  por ejemplo el Reino Unido y los Estados Unidos y que esa reducción significativa en las mismas estaba relacionada con el consumo de vino en esos países. Este trabajo de investigación fue realizado en la ciudad de Burdeos (Francia) en el cual se seleccionaban individuos que tenían el hábito de consumir una dieta rica en grasas y consecuentemente presentaban un riesgo elevado de  padecer enfermedades enfermedades cardiovasculares cardiovasculares entre otras. También fueron considerados otros factores como el hábito de fumar y la presión arterial, comprobándose que a pesar de practicar hábitos alimentares

con el consumo moderado de vino tinto así como de alimentos producidos en la región. Del mismo modo, los estudios epidemiológicos realizados en poblaciones orientales, demostraron que existe una relación entre la disminución en la incidencia de cáncer de mama, el consumo elevado de soja, así como de alimentos derivados de la misma los cuales son particularmente ricos en isoflavonas. De acuerdo con los estudios se calcula que la  población japonesa ingiere una cantidad diaria aproximada de 30 a 40 mg/día de isoflavonas. Siendo el consumo en los países occidentales inferior debido al menor consumo de soja y de productos derivados de la misma (Kimira et al., 1998).

 perjudiciales la población exhibía un bajo índice de  perjudiciales enfermedades cardiovasculares, de colesterol sanguíneo así como una baja frecuencia de ataques cardiacos, esta particular situación fue denominada como “paradoja francesa”. La explicación a los resultados obtenidos fue fundamentada en el tipo de dieta basada en frutas, verdura e vino, alimentos  particularmente  particularm ente ricos en compuestos fenólicos (Criqui y Riegel, 1994; Renaud y Ruf, 1994). En el mismo sentido, otros autores demostraron que los consumidores moderados de vino tinto, cuando comparados con los abstemios presentan menor riesgo de padecer tanto la enfermedad de Alzheimer, como demencia senil. De acuerdo con otros autores la reducción del riesgo en los consumidores de vino de contraer Alzheimer es de aproximadamente 25% y menor del 20% de padecer demencia senil (Orgogozo et al., 1997). En Brasil se considera que las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte (32%), se calculan aproximadamente 820 casos por día y aproximadamente 300 mil muertes por año, es decir por cada cien mil habitantes ocurren en torno de 160 muertes, éste índice cuando comparado con otros  países como el Japón donde se registran 42 muertes  por cada cien mil habitantes, habitantes, el índice brasilero es extremadamente elevado. De acuerdo con los datos divulgados por la Sociedad Brasilera de Cardiología (FUNCOR) aproximadamente 42% de los individuos adultos brasileros presentan un índice elevado de

Considerando que la mayor parte de esos estudios fueron realizados teniendo como base una determinada práctica dietaria (rica en alimentos funcionales), y no en los compuestos individuales  presentes en éstos alimentos, alimentos, se considera necesario necesario llevar a cabo rigurosos estudios de caracterización química para determinar los compuestos individuales y las cantidades, que están presentes en éstos alimentos con propiedades beneficiosas. Utilizando  para esto métodos correctamente correctamente estandarizados, estandarizados, intentando establecer la eficiencia de absorción en el tracto gastrointestinal, su biodisponibilidad y sus mecanismos de acción para posteriormente realizar recomendaciones para el consumo humano.

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Hasta el momento las evidencias científicas son insuficientes y la mayor parte de la información  proviene, con excepción excepción de los estudios epidemiológicos, de estudios experimentales realizados en condiciones in vitro, vitro, además poco se conoce sobre su metabolismo, distribución en tejidos específicos, así como de la interacción con metabolitos de relevancia biológica como por ejemplo la molécula de ADN, los lípidos, las  proteínas, bien como las lipoproteínas (plasmáticas (plasmáticas o celulares) son objetivos poco explorados que requieren de mayores estudios para así comprender el efecto biológico ejercido. En ésta revisión se resumen los datos relacionados con los efectos antioxidantes de las frutas rojas  particularmente ricas en antocianos, su metabolismo,  particularmente metabolismo,

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Propiedades antioxidantes de las frutas rojas

 biodisponibilidad y distribución  biodisponibilidad distribución tecidual. La  propuesta radica en comparar comparar de forma crítica la significancia biológica de los resultados obtenidos en condiciones in vitro  vitro  en relación a los observados in vivo,, particularmente, nos centraremos en la vivo interacción con la molécula de ADN y con los lípidos, como ejemplos ilustrativos de las complejas

Esa propiedad antioxidante es de interés tanto tecnológico como nutricional debido a que estos compuestos son antioxidantes naturales presentes en los alimentos de origen vegetal, por tanto la elaboración de alimentos con una elevada concentración de compuestos fenolicos supone una reducción en la utilización de aditivos antioxidantes y

interacciones las moléculas alimenticias y la respuesta de laentre célula/tejido.

Las plantas producen una serie de compuestos orgánicos que no participan de forma directa en el desarrollo y crecimiento de las mismas. Esas substancias fueron tradicionalmente denominadas como metabolitos secundarios. De acuerdo con la nomenclatura adoptada por la British Nutrition Foundation, los metabolitos secundarios pueden ser divididos en 4 grupos mayoritarios: los compuestos  polifenolicoss e fenolicos los cuales corresponden  polifenolico corresponden aproximadamente a 8000 compuestos, los terpenoides

de forma se obtendrían alimentos más saludables, queesainclusive podrían ser considerados como alimentos funcionales (Martínez – Valverde, Valverde, 2000). Desde el punto de vista nutricional, este poder antioxidante se relaciona con el papel preventivo en diversas enfermedades crónicas no transmisibles como por ejemplo, las enfermedades cardiovasculares, cáncer entre otras patologías, así como en el proceso normal y patológico de envejecimiento,  por ese motivo está siendo intensamente intensamente estudiado mediante ensayos tanto in vivo como in vitro (Li et al., 2009; Katsube et al., 2003; Dai et al., 2009). Además a diferencia de otros antioxidantes presentes en la dieta como por ejemplo, el ácido ascórbico y el

éste grupo comprende cerca de 25000 compuestos, los alcaloides alrededor de 12000 (Goldberg, 2003). Los polifenoles, se caracterizan por presentar un anillo aromático y un anillo benceno con uno o más grupos hidroxilados incluyendo derivados funcionales, como por ejemplo ésteres, metilésteres, glucósidos, etc. Entre los mismos, se pueden distinguir dos grandes grupos los no flavonoides (acidos fenólicos, estilbenos, taninos hidrolizables) y los flavonoides (flavonas, Isoflavonas, flavonoles, flavanoles, antocianos, flavanonas, taninos condensados) (Manach et al., 2005). Los polifenoles en general son capaces de eliminar O2, O2· –   – , OH·, NO· y radicales libres

α - tocoferolfosfolipídica que actúan en acuosoeny/o en la membrana los medio polifenoles cambio, son capases de actuar en ambas fases y a pesar de la reconocida capacidad antioxidante in vitro  vitro  de estos compuestos su eficacia in vivo debe vivo debe ser mas estudiada debido a que existen pocos datos con relación a su  biodisponibilidad.  biodisponibil idad. Los mecanismos de la absorción gastrointestinal de los compuestos fenolicos son desconocidos. Estos compuestos se caracterizan por ser hidrofílicos y por ese motivo no podrían penetrar la barrera intestinal mediante difusión pasiva. Hasta el momento, el único transportador activo de membrana descrito, que  podría estar involucrado en la absorción de éstos

alquilos y peroxilos, a través de su capacidad de donar electrones, generando un radical fenoxilo estable. Los flavonoides que poseen un grupo O –  dihidroxifenilo como anillo B y un anillo C saturado, como las catequinas y algunas procianidinas, poseen el lugar de contacto con los radicales libres en el anillo B, y la sustitución del anillo A solamente  presenta una influencia influencia limitada en los potenciales potenciales de reducción del radical semiquinona formado, que se muestra relativamente estable. Las galocatequinas, con un anillo B 3’, 4’, 5’– trihidroxifenilo, trihidroxifenilo, eliminan radicales libres de una forma más eficaz que las catequinas. También, la galoilación junto con el grupo 3, 4, 5 – trihidroxifenilo trihidroxifenilo en la molécula, favorece la capacidad de eliminación de radicales (Rice – Evans Evans et al., 1997).

metabolitos, es un mecanismo de transporte sodio –  dependiente vinculado con la absorción de ácido ferúlico y cinámico en el intestino de roedores (Ader et al., al., 1996).  1996). Los flavonoides en general, con excepción de los flavanoles se encuentran glicosilados o glucosilados en los alimentos, por ese motivo no pueden ser clivados por las enzimas digestivas humanas. Sin embargo estudios recientes demostraron aproximadamente, un 50% de absorción para determinados flavonoides (Passamonti et al., 2003, 2005; Matuschek et al., 2006). En un estudio realizado con seres humanos a los cuales se les administró glicósidos de quercetina, fue observado que la

Metabolitos secundarios

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absorción ocurre aproximadamente 0,5 – 0,7 0,7 h después de producirse la ingestión de quercetina 4 – glucósido glucósido

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y 6 – 9 h después de la ingestión de rutina (quercetina –  3 – ß – rutinósido). rutinósido). Demostrándose a partir de éstos resultados, que la absorción de los glucósidos de quercetina ocurre en el intestino delgado, siendo la eficiencia de absorción superior que la eficiencia de absorción de sus agliconas. Por otro lado, los  polifenoles que poseen una unidad ramnosa antes de

concentraciones detectadas oscilan entre 10-97 nmol/L dependiendo de la dosis administrada (Shahrzad et al., 2000; Goldberg et al., 2003; Graefe et al., 2001; Zubik y Meydani, 2003; Setchell et al., 2003; Manach et al., 2005).  No obstante, experimentos experimentos realizados en condiciones in vitro  vitro  demuestran un significativo

ser absorbidos,presentes son hidrolizados en el colonintestinal por las ramnosidasas en la microflora (Hollman y Katan, 1999; Morand  Morand  et al., 2000; Crespy  Crespy  et al., 2002; Mullen et al., 2002). En este mismo sentido, la detección en la sangre  portal y mesentérica mesentérica de metabolitos metabolitos glucuronidados glucuronidados después de realizar una perfusión con polifenoles en el intestino delgado de ratas comprueba que la glucuronidación de estos compuestos ocurre en  primer lugar en los enterocitos enterocitos antes de que sean más conjugados en el hígado (Sfakianos  (Sfakianos   et al., 1997; Spencer   et al., 2001). Probablemente, éste mismo  proceso ocurre en seres humanos, debido a que se ha comprobado en condiciones in vitro, que la

 poder antioxida en concentraciones concentra oscilan entre 0,1 0,antioxidante 1 a 100nte μmol/L (Ludwigciones et al.,que 2004 2004) ). De acuerdo con datos de la literatura científica, los niveles fisiológicos se encuentran aproximadamente en 1 μmol/L; por ese motivo se sugiere que no todos los polifenoles ingeridos presentan poder antioxidante. Inclusive ciertos compuestos testados no poseen relevancia biológica in vivo  vivo  y además, durante el proceso de absorción y metabolización gastrointestinal pueden ocurrir modificaciones químicas, generalmente no consideradas debido a que la mayoría de los estudios experimentales realizados fueron hechos en condiciones in vitro  vitro  (por ejemplo cultivo de células) y los compuestos de interés fueron

glucuronidación de quercetina luteolina microsomas del intestino es más yelevada que en la glucuronidación existente en microsomas del hígado humano (Boersma et al., al., 2002).  2002). La absorción y distribución de estos compuestos también fue analizada utilizando métodos cromatográficos, cromatográfi cos, en diversos tejidos de roedores como cerebro, células endoteliales, corazón, riñón,  bazo, páncreas, próstata, útero, ovario, glándula mamaria, testículos, vejiga, hueso y piel (Youdim et al., 2003; Maubach et al., 2003). En esos estudios fueron determinadas concentraciones que se extienden entre 30 a 3000 ng aglicona eq/g de tejido dependiendo de la dosis administrada y del tejido

simplemente adicionados a los mismos, obviamente esas investigaciones no representan el metabolismo real de los fitoquimicos en condiciones in vivo, vivo, además excluyen las posibles interacciones con otras moléculas, así como las actividades sinérgicas y aditivas entre los componentes presentes en el extracto y/o alimento. En ese mismo sentido, los efectos de la matriz de los alimentos sobre la biodisponibilidad de los compuestos fenolicos es un hecho que tampoco se ha estudiado en detalle, podrían darse interacciones entre éstos compuestos y otros componentes  presentes en los alimentos, alimentos, como proteínas y  polisacáridos,  polisacárid os, afectando afectando de ésta forma el proceso de

estudiado (Coldham y Sauer, 2000). En éste estudio fue también demostrado que después de la administración de altas concentraciones de quercetina (aglicona), éste compuesto así como sus metabolitos se distribuyen en diversos tejidos, alcanzando una concentración de nanomoles por gramo de tejido, siendo que la concentración más alta fue detectada en  pulmones y la más baja en cerebro y bazo de ratas y de cerdos (de Boer et al., 2005). En seres humanos la cantidad absorbida es muy  baja, siendo el acido galico y las isoflavonas los compuestos que mejor se absorben (0,22-1,8 µmol/L y 0,5-1,65 µmol/L respectivamente), seguidos por flavanonas y por quercetin glicosideo. Entre los

absorción de los mismos. Igualmente factores como el pH gástrico e intestinal, fermentaciones intestinales y la excreción biliar, podrían también afectar la absorción de los polifenoles (Manach  (Manach et al., 2004). Consecuentemente, estos diseños experimentales  proporcionan información limitada y por ese motivo debe existir cautela antes de realizar una extrapolación directa de los resultados obtenidos en condiciones in vitro a  in vivo. vivo. Porque los efectos moleculares de los polifenoles observados en condiciones in vitro pueden vitro pueden no ser relevantes in vivo, vivo, como sugerido por varios autores (Manach et al., 2005).

fitoquimicos menos absorbidos se encuentran las  proantocianidinas  proantocianidinas y los antocianos, antocianos, las www.blacpma.org

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Antocianos En la actualidad, este grupo de compuestos fenolicos presentan un gran interés nutricional por su contribución al mantenimiento de la salud humana. Asimismo, varias de las propiedades beneficiosas descritas en las frutas rojas, están vinculadas con la  presencia y el contenido contenido de antocianos antocianos (Ramirez et

inestabilidad de estos compuestos cuando se encuentran como agliconas o a la existencia de un mecanismo particular de absorción e metabolismo  para estos compuestos compuestos (Passamonti (Passamonti et al., 2005; Joseph et al., al., 2005).  2005). En ese sentido Passamonti et al. (2003), proponen un sistema de transporte para los antocianos por

al al.., 2005; Dai et al., 2009). Los antocianos, son pigmentos flavonólicos, que  presentan una estructura química adecuada adecuada para actuar como agentes antioxidantes, donar hidrógenos o electrones a los radicales libres, así como capturarlos y desplazados en su estructura aromática (Heim et al., al., 2002).  2002). La capacidad antioxidante de los mismos, se relaciona con la presencia de grupos hidroxilos en las posiciones 3´ y 4´ del anillo B, los cuales conceden estabilidad al radical formado. Por otro lado los grupos hidroxilos libres en las posición 3 del anillo C y en la posición 5 del anillo A, en conjunto con el grupo carbonilo en la posición 4 actúan como donadores de electrones (Tsuda et al., al .,  

medio de translocasas a nivel gástrico,presentan basándoseuna en el hecho de que estos compuestos importante afinidad por el sistema previamente mencionado. Otros autores postulan que los antocianos podrían ser convertidos en glucurónidos  por la acción de una de las enzimas enzimas UDP glucosa deshidrogenada (Wu et al., 2005). Similarmente Felgines et al. (2002) comprobaron que después de 8 días de administración de extracto de blackberry blackberry,, los antocianos pueden ser detectados de forma intacta o  bien metilada, metilada, en la orina de estos animales animales demostrando de esa forma que su viabilidad es muy  baja comparada comparada con otros flavonoides (Ohnishi et al., 2006).

1994; Espin et al., al.,   2000; Prior y Wu, 2006.). Los antocianos, también conocidos como antocianinas y sus agliconas como antocianidinas, son los  principaless responsables  principale responsables del color característico característico de las frutas rojas y vinos tintos. En la Tabla 1 se indican los diferentes nombres que reciben estos compuestos según sean las sustituciones R1 y R2 (Tsuda et al., al.,   1994).

Otros investigadores analizaron la confirmando distribución de estos compuestos en diversos tejidos, la  presencia de antocianos antocianos glicosilados glicosilados como la cianidina, la peonidina y la delfinidina, y de sus agliconas, glucuronideos y derivados metilados en diversos tejidos como estomago, intestino delgado, hígado, riñón, ojos y cerebro. Asimismo se ha comprobado que en estos 2 últimos tejidos (ojos y cerebro) estos compuestos pueden ser detectados después de media hora de administración siendo que la cantidad total determinada oscila entre 100 a 200 ng/g (Passamonti et al., al.,   2003, 2005; Manach et al., al .,   2005; Matuschek et al., al., 2006).  2006). Del mismo modo, evidencias recientes indican

Tabla 1. Nomenclatura de los antocianos. R1

R2

Compuesto

OH

H

Cianidina

OH OH

OH OCH3

Delfinidina Petunidina

OCH3

H

Peonidina

OCH3

OCH3

Malvidina

Las propiedades beneficiosas de los antocianos se han puesto de manifiesto en diferentes estudios, in vivo como in vitro realizados tanto en animales de experimentación como en seres humanos. Si bien no se conocen los mecanismos de absorción gastrointestinal de los compuestos fenolicos, se considera que los antocianos constituyen una excepción a la regla, debido a que se han encontrado glicósidos intactos en el plasma, autores sugieren que este hecho podría estar relacionado con la www.blacpma.org

que los antocianos son absorbidas y metabolizados en seres humanos y que sus metabolitos pueden ser detectados en la orina 24 h después de la administración y que los mismos conservan su estructura básica. Resultados farmacocineticos demuestran que la concentración de los glucósidos y sus derivados glucuronidos pueden ser detectados en sangre entre las 0-5 h después de la ingesta, y que dentro de ese periodo, se observa un aumento en el grado de metilación. Por ese motivo los autores sugieren que la bioactividad de los antocianos está  probablemente  probableme nte condicionada condicionada a un determinado determinado  periodo de tiempo el cual estaría relaciona relacionado do con su transformación metabólica (Mazza, 2002; Prior y Wu, 2006)

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Del mismo modo se ha investigado la viabilidad de los antocianos utilizando diferentes dosis, fuentes (tipo de berry) y matrices (jugo, extracto, capsulas). Confirmándose que los mismos son rápidamente absorbidos, y pueden ser detectados 1,5 h después de la administración. Los autores sugieren que el  proceso de absorción ocurre probablemente probablemente en el

En nuestro laboratorio se han realizado varios estudios sobre la capacidad antioxidante de extractos  provenientess de diferentes cultivares de Vaccinium  proveniente ashei   y de  Rubus ashei  Rubus   sp., utilizando la técnica de 2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), demostrándose que el extracto total, las fracciones aisladas (flavonóidica, o ácidos fenólicos) como también

estomago y/o en intestino delgado al 2005; Prior y elWu, 2006). Sin (Manach embargo,et al., las.,   concentraciones plasmáticas detectadas varían significativamente y en general se detectan niveles muy bajos menores a 1 µM. Los autores también sugieren, que la actividad de la microflora del colon y la baja estabilidad de los antocianos frente al pH del intestino, serian en parte responsables por la conversión de estos compuestos en moléculas menores, y que los mismos son eliminados a través de la urina entre las 4-6 h después de la administración. Considerando que la proporción de los antocianos excretados es menor al 0,1% de la suma total ingerida, gran parte del metabolismo de

antocianos significativo poder antioxidante aislados cuando exhiben comparados al TROLOX (análogo de la vitamina E). Se ha comprobado también que el extracto de  Rubus  Rubus   presenta efecto antiinflamatorio en ratas, se cree que ésta propiedad se debe a la capacidad de los antocianos para disminuir la liberación de citocinas. Además, los antocianos pueden efectuar su actividad antiinflamatoria debido principalmente a su capacidad para inhibir la liberación del ácido araquidónico, asi como las enzimas ciclooxigenasa y lipooxigenasa, o bien debido a la fosforilación de  proteínas específicas específicas causantes causantes de la ac activación tivación de las las mismas (Ramirez et al., al., 2009).  2009).

estos (Priorcompuestos y Wu, 2006).no esta completamente dilucidado.

Similarmente, y Nair  in(2002), también comprobaron que Seeram en condiciones  condiciones vitro, el vitro, poder antioxidante de los antocianos individuales esta directamente relacionado con la estructura química de los mismos, y que la eficacia aumenta de forma  proporcional al número de grupos OH en el anillo B, y en el caso de la cianidina en particular, la presencia de unidades glicosiladas en la posición 3 del anillo C decrece la actividad antioxidante, resultados similares fueron obtenidos por Tsuda et al.(1994). Matsumoto et al. (2004) analizaron los efectos de la administración de extracto de chockeberry en un modelo animal de lesiones gástricas hemorrágicas inducidas con etanol, comprobando que el extracto

Efectos fisiológicos asociados a los antocianos Los efectos fisiológicos dos antocianos se deben a su estructura química, siendo sus principales  propiedadess la capacidad de eliminar radicales libres,  propiedade libres, efectos sobre la fluidez de la membrana plasmática, efecto antiinflamatorio y antinociceptivo, efecto cardioprotector y neuroprotector efecto antimutagénico, efecto anticarcinogénico, efecto antivírico y antibacteriano (Espin et al., 2000; Cheplick et al., 2007). Dentro de estas propiedades la capacidad antioxidante es una de las más analizadas. Diferentes estudios ponen de manifiesto que el poder antioxidante de los antocianos y de sus agliconas es equivalente a las vitaminas C y E, y que la capacidad de capturar radicales libres está directamente relacionada con el efecto anticarcinogénico de estos compuestos (Bagchi et al. 1998). Resultados similares obtuvieron Narayan et al. (1999), al comparar la capacidad antioxidante de los antocianos con α tocoferol, hidroxianisol butirato e hidroxitolueno butilado. Además parece ser que existe una correlación linear entre la cantidad de antocianos totales y la capacidad antioxidante en diversas frutas como: blackberries, red raspberries, black raspberries  raspberries  y  strawberr  strawberries ies   (Henoinen et al., 1998; Kakonen et al., al., 1998,  1998, Sellappan et al., 2002). www.blacpma.org

exhibe propiedades terapéuticas y/o preventivas gastrointestinales. gastroint estinales. Del mismo modo se ha evaluado la capacidad antioxidante de éstas frutas rojas sobre la oxidación de las LDL, demostrándose que el extracto de chokeberry y uvas disminuye los niveles séricos de colesterol total y triglicéridos, al mismo tiempo que provoca un aumento de los niveles de colesterol ligado a HDL y una disminución de los niveles de colesterol ligado a LDL y VLDL (Valcheva-Kuzmanova et al., al., 2007).  2007). Adicionalmente, Cooper et al. (2004) han demostrado en seres humanos, que el consumo moderado de vino tinto durante 10 días (200 mL), reduce los niveles de colesterol/LDL. Por otra parte se ha comprobado que extractos  provenientes de diferentes cultivares  provenientes cultivares de  Rubus  Rubus,,

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 pueden inhibir la actividad de las enzimas α-amilasa, α-amilasa, α -glucosidasa y de la enzima conversora de angiotensina-1 (ACE) in vitro, vitro, las cuales están asociadas con la diabetes del tipo II e hipertensión respectivamente (Cheplick et al., al.,   2007). Asimismo Herrera-Arellano et al. (2007), comprobaron que el extracto de  Hibiscus sabdariffa, sabdariffa, rico en antocianos,

tratadas con los extractos. Observaron que, los niveles plasmáticos y hepáticos de α-tocoferol en ratas, disminuyen significativamente después de 12 semanas de tratamiento; la peroxidación lipídica se incrementa significativamente en plasma, hígado y células sanguíneas. Adicionalmente los niveles de especies reactivas de oxígeno y de piruvato kinasa

disminuye presión hipertensos. sanguínea y reduce la actividad de ACE enla pacientes Las propiedades antimutagénicas y anticarcinogénicas de los antocianos se han puesto de manifiesto en numerosos estudios tanto in vitro  vitro  como in vivo (Duthie   et al., (Duthie al., 2007). Según datos bibliográficos, durante el proceso de desarrollo del cáncer se  producen una secuencia secuencia de eventos denominados denominados como iniciación (inducción de mutaciones en el ADN), promoción (expansión tumorogénica) y  progresión (conversión de un tumor benigno/maligno benigno/maligno a cancerígeno). En éste sentido, debe considerarse el hecho de que una vez iniciado este proceso el mismo es prácticamente irreversible, por ese motivo es

están aumentados en fagocitos y plasma. Por otro lado, los bajos niveles de vitamina E no alteran la estabilidad del ADN en linfocitos de ratas, hígado o colon. Similarmente el tratamiento con cianidina-3glicosideo no altera la peroxidación lipídica o el ADN en ratas. Sin embargo produce un efecto quimioprotectivo en la molécula de ADN en colonocitos humanos como resultado del tratamiento con antocianos. Si bien se conoce que la vitamina E altera los niveles de oxidación lipídica in vivo, vivo, su  papel en el mantenimiento de la estabilidad del ADN todavía no fue completamente dilucidado. Asimismo fue observado que el tratamiento con cianidina-3glicosideo protege a la molécula de ADN del daño

importante prevenir el desarrollo del cáncer, e identificar los compuestos que puedan inhibir la  propagación del tumor cancerígeno. cancerígeno. De acuerdo con datos bibliográficos, los puntos mas importantes que deben ser controlados son la producción de hidroperóxido, el incremento de la síntesis de ADN y la inducción de la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa (Li et al., 2009; Katsube et al., 2003). Para protagonizar un efecto real in vivo, vivo, los compuestos de interés deben ser absorbidos de la dieta y dirigidos hacia los órganos diana. En un estudio realizado in vivo vivo,, por Ramirez-Tortosa et al. (2001) con un extracto rico en antocianos (delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y

oxidativo in vitro, vitro, en concentraciones nutricionalmente relevantes no altera el daño oxidativo in vivo. vivo. Los autores sugieren que esta discrepancia entre los resultados observados en condiciones in vitro/in vivo  vivo  esté relacionado con la baja biodisponibilidad y al metabolismo de los antocianos. Otros autores comprobaron, que es posible reducir hasta 50% la oxidación de bases de la molécula de ADN después del tratamiento con  Aronia melanocarpa   ELLIOT (black chokeberry), en melanocarpa colonocitos humanos extraídos por biopsia. Estos autores determinaron, el daño endógeno bien como el daño inducido con peróxido de hidrógeno (Rechkemmer (Rechkem mer y Pool-Zobel, 1998). Asimismo, Pool-

malvidina, 1 g/kg) fue comprobado que cuando combinados éstos compuestos, se observa una mejora significativa de la capacidad antioxidante plasmática en los animales tratados y que además existe una disminución en los niveles de hidroperoxidos y 8oxo-deoxiguanosina en el hígado de esos animales, ambas sustancias son marcadores específicos de la dieta deficiente en vitamina E, e indicadores de  peroxidación lipidica y de daño endógeno en la molécula de ADN. Similarmente Duthie et al. (2004), investigaron las consecuencias de una dieta deficiente en vitamina E,  juntamente  juntamen te con el efecto citoprotector del antocian antociano o cianidina (100 mg/kg) sobre la molécula de ADN y

Zobel et al. (1999) demostraron que compuestos aislados y purificados a partir de Aronia de  Aronia melanocarpa melanocarpa   ELLIOT reducían el daño de ADN inducido por  peróxido de hidrogeno en una línea de células tumorales humana, no obstante el tratamiento no altera el daño endógeno de la molécula de ADN. También observaron que los compuestos purificados tanto las agliconas como los glicosideos presentan el mismo poder antioxidante, estos resultados sugieren que los antocianos podrían ejercer efectos protectores en tejidos específicos como por ejemplo el colon humano. Del mismo modo, Lazzé et al. (2003) comprobaron que el pretratamiento con antocianos y

los lípidos celulares, utilizando un modelo in vitro de vitro de cultivo de células y otro in vivo en vivo en ratas previamente

sus derivados: delfinidina y cianidina, protegen a la molécula de ADN del daño inducido con tert -butil-butil-

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hidroperóxido en músculo liso y en una línea celular de hepatoma de ratos. También observaron que éstos compuestos inhiben la citotoxicidad, la peroxidación lipídica y la formación de aductos en la molécula de ADN, por el contrario, no modifican el estado redox de la célula y tampoco la oxidación de bases de la molécula de ADN. No obstante, la presencia de

membrana plasmática relacionadas con el proceso de envejecimiento (por ej. rigidez), este hecho puede condicionar la distribución intracelular de los componentes del extracto, así como los efectos  biológicos de de éste (Ramirez et al., 20 2008). 08).  Noda et al. (2002) comprobaron que las antocianidinas aisladas y purificadas purificada s a partir de

azúcar en laprincipalmente estructuraente de laenmolécula reduce el efectoa  protectivo principalm las células de hepatoma hepatom de ratos. Estos resultados ponen de manifiesto que existe una relación estructura/función de los antocianos y de sus derivados, y que inclusive la sensibilidad específica de cada tejido frente al estres oxidativo, la distribución y localización intracelular de estos compuestos determinan el efecto protector. Diferentes estudios de intervención nutricional ponen de manifiesto que extractos provenientes de frutas rojas en general así como sus antocianos aislados e  purificados disminuyen disminuyen o retardan los efectos deletéreos relacionados con la edad e inclusive  previenen enfermedades enfermedades neurológicas neurológicas y alteraciones alteraciones

 Punica granatum  granatum   L.:en ese delfinidina, cianidina ión y  pelargonidi  pelargonidina, na, inhiben orden la peroxidación peroxidac lipídica inducida por peróxido de hidrógeno en cerebro de ratas en condiciones in vitro. vitro. Asimismo,  Narayan et al. (1999), demostraron que los antocianos aislados disminuyen significativamente la autoxidación y la peroxidación lipídica de forma no competitiva, en un modelo in vitro  vitro  de peroxidación lipídica enzimática y no enzimática. Similarmente, resultados provenientes de nuestro laboratorio demostraron que el extracto de  Rubus  Rubus   promueve lipoperoxidación en hipocampo, estriado y córtex cerebral de ratas después de 30 días de suplementación (3,2 mg/kg/día de antocianos). No

cognitivas. Del mismo modo fue demostrado que los antocianos presentes en esos extractos atraviesan la  barrera hematoencefálica, hematoencefálica, y ejercen efectos en diversas estructuras cerebrales como córtex, cerebelo e estriado (Passamonti et al., 2003, 2005; Youdim et al., 2003, 2004; Andrés-Lacueva et al., al ., 2005).  2005). En nuestro laboratorio se ha estudiado el efecto de la suplementación por 30 días con extracto de  blueberry (3.2 mg/kg/dia de antocianos) antocianos) en cerebro de ratones, demostrandose que el extracto total ejerce un efecto protector del daño endógeno de la molécula de ADN en hipocampo y cortex cerebral de estos animales, por el contrario no presenta efectos  protectivos frente al daño inducido con peroxido de

obstante, fueron observados efectos protectivos después de la suplementación por 30 días con cianidina aislada a partir de la misma fruta (Ramirez et al., al., 2008).  2008). También se ha observado que el extrato total de  Rubus  Rubus   induce un aumento significativo de glutamato en ambas estructuras cerebrales estudiadas (cortex, hipocampo), en cambio la suplementación con cianidina 3 glicosideo produce una reducción significativa en las cantidades totales de ese neurotransmisor neurotransm isor (Ramirez  (Ramirez  et al., al.,   2009). De acuerdo con la literatura un aumento en las concentraciones de glutamato está asociado a la formación de radicales libres. Como consecuencia de estos antecedentes, en nuestro laboratorio decidimos

hidrogeno en las mismas estructuras cerebrales. Para algunos autores estos resultados sugieren que los antocianos presentes en el extracto, forman un complejo con la cadena de ADN estabilizando de esta forma a la molécula frente al daño oxidativo (Ramirez et al., al., 2005;  2005; Barros et al., al., 2006).  2006). Resultados similares fueron encontrados en ratas idosas, después de la suplementacion por un período de 6 meses con el mismo extracto no se observaron efectos protectores en la integridad de la molécula de ADN, no obstante después de la inducción de daño con peróxido de hidrógeno se comprobó que el extracto protege de forma significativa al ADN en el córtex cerebral de los ratos tratados; por lo que se

estudiar el efecto antinociceptivo del extracto de mirtilo. Comprobando que después de 21 días de suplementación oral, el extracto ejerce un efecto antinociceptivo de forma dosis dependiente por mecanismos todavía desconocidos (Ramirez et al., 2009).  No obstante, intervenciones intervenciones dietéticas dietéticas realizada realizadass en seres humanos muestran resultados controvertidos, se ha comprobado en individuos voluntarios que el tratamiento con aronia aronia,, blueberry blueberry   y boysenberry boysenberry,, ejerce un efecto protector de la integridad del ADN (efecto antigenotóxico), en células mononucleares (Rechkemmer y Pool-Zobel 1998). Del mismo modo, se ha observado que el consumo por 4 semanas de

 piensa que esos resultados estarían relacionados relacionados con las modificaciones en las propiedades físicas de la

 jugo proveniente proveniente de una mezcla mezcla de diferentes diferentes tipos de  berries produce un disminución del daño oxidativo

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celular y un aumento en los niveles de glutatión reducida (Weisel et al., al.,   2006). Contrariamente, en otro estudio donde los voluntarios fueron divididos en dos grupos: el primer grupo recibió jugo de blackcurrant y el segundo grupo jugo de antocianos  purificados a partir de la misma fruta durante un  periodo de 3 semanas, no se observaron diferencias diferencias

Por otro lado, varios autores describen que las  propiedades antioxidantes antioxidantes de los compuestos compuestos fenólicos son reducidas in vivo  vivo  por causa de su afinidad por las proteínas (Serafín et al., al.,   2009). Estudios recientes evaluaron la disponibilidad de los  polifenoles en plasma de voluntarios humanos después de la ingestión de jugo de blueberry sin leche

significativas en marcadores de (Moller daño delet ADN entre los grupos tratados y controles al., 2004). Senthilmohan et al. (2003) utilizaron el extracto comercial denominado Enzogenol® , en un estudio donde   individuos adultos de entre 55 a 75 años de donde edad, recibieron 240 mg de Enzogenol® y 120 mg de vitamina C durante un periodo de 6 o 12 semanas. Los autores demostraron que después de 12 semanas de tratamiento se observó una reducción en el daño endógeno de ADN en células sanguíneas como en la oxidación de proteínas en suero. Por otra parte, se ha comprobado que si bien la capacidad antioxidante plasmática es un indicador adecuado del estatus antioxidante, los marcadores

y asociado 1, con2,leche, muestrasdedelaplasma fueron colectadas y 5 las h después ingesta. Los individuos que consumieron únicamente blueberry  presentan un aumento en las concentra concentraciones ciones de los marcadores plasmáticos ácido ferúlico y ácido cafeico. En contraste, la ingesta de blueberry con leche produce una disminución de éstos compuestos, es decir no se detectó un aumento en la capacidad antioxidante en el plasma. Esos resultados sugieren que la ingestión de blueberry en asociación con leche  perjudica las propiedades propiedades antioxidantes antioxidantes y reduce la absorción in vivo  vivo  de los compuestos bioactivos  presentes en en esas frutas (Serafín (Serafín et al., 2009).

 biológicos de estrés como de daño oxidativo se encuentran en niveles muy bajos en los individuos voluntarios (Mazza et al., al.,   2002). Por ese motivo, en estudios subsecuentes se utilizaron voluntarios que habitualmente viven en condiciones de estrés, por ejemplo, fumadores, obreros que utilizan la fuerza muscular para realizar sus tareas o también individuos que pertenecen grupos de riesgo  previamente  previame nte identificados, identificados, dentro de este contexto fue observado que la ingesta de cápsulas de  blackcurrantt produce un incremento  blackcurran incremento del flujo sanguíneo periférico y que también alivia la fatiga muscular característica de las personas que realizan trabajos físicos repetitivos (Matsumoto et al., 2005).

CONCLUSIÓN

Similarmente fue comprobado que el consumo de  jugo de chokeberry estimula las defensas antioxidantes endógenas y limita el daño oxidativo después de ejercicios físicos regulares (PilaczynskaSzcesniak et al., 2005). Asimismo, en fumadores crónicos la ingesta prolongada de blueberry, reduce los niveles de lípidos hidroxiperóxidos (McAnulty et al al., .,   2005). En pacientes que padecieron ataque isquémico y que bebieron jugo de chokeberry en combinación con estatina, durante 6 semanas, se observó una reducción en los niveles séricos de iso prostanos y de LDL oxidada y un incremento de adiponectin y reducción de la presión sanguínea y consecuentemente una reducción significativa de la inflamación (Naruszewicz et al., al., 2007).  2007).

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 Notablemente, numerosos trabajos científicos  Notablemente, científicos demostraron una asociación entre el consumo de frutas y verduras con el bajo riesgo de padecer ciertas enfermedades crónico-degenerativas, esa propiedad fue atribuida principalmente a la capacidad antioxidante de los componentes de esos alimentos. Si bien un amplio espectro de compuestos con  propiedades antioxidantes antioxidantes están presentes en los alimentos de origen vegetal en general, es necesario considerar que la capacidad antioxidante puede ser  perdida o reducida durante el proceso de absorción debido a la transformación metabólica que está comúnmente asociada con la conjugación de moléculas. Además las moléculas que presentan una estructura química compatible con la propiedad antioxidante en condiciones in vitro  vitro  podrían in vivo  vivo  ejercer otros efectos independientes de sus  propiedades antioxidantes, antioxidantes, por ejemplo alterar la actividad de ciertas enzimas, unirse a determinados receptores de membrana, o a receptores nucleares como ligando o imitadores. Otro importante aspecto a considerar son los efectos ejercidos por compuestos aislados con relación a las matrices complejas que contienen una amplia gama de compuestos que interaccionan entre si. Deben ser realizadas más investigaciones para explorar el mecanismo de acción de esos compuestos aislados, y de esta forma utilizarlos como referencia  para el estudio estudio de matrices complejas.

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Actualmente también se considera a la dieta como un factor clave para el mantenimiento de la estabilidad genómica, considerando que diversos micronutrientes son coenzimas de enzimas vinculadas con la síntesis y la reparación de la molécula de ADN, otro aspecto que necesita ser mejor dilucidado es la interacción de los compuestos fenolicos in vivo  vivo  con metabolitos de

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relevancia biológica la molécula de ADN, las  proteínas y los como lípidos. Esas interacciones, interacc iones,  probablemente,  probablem ente, desempeñan desempeñan un importante papel en los efectos biológicos comprobados de esos compuestos. Con relación a este punto surge un nuevo paradigma, ¿cuál es la dosis adecuada de compuestos individuales o de extracto total que podrá ejercer un efecto biológico? ¿Durante cuánto tiempo deberá ser realizada la suplementación y cuál es el momento adecuado para iniciar ésta? En ese sentido también necesitan ser realizados estudios de toxicidad, principalmente para los trabajos en los cuales las suplementaciones son realizadas durante un  periodo de tiempo prolongado. prolongado.

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Antioxidantes en berries nativos chilenos [Antioxidants in Chilean native berries] Carolina FREDES  Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile . 

Abstract Among plant natural products, interest in polyphenols is mainly due to its antioxidant properties. Many fruits recognized as berries have higher antioxidant capacity than other fruits and vegetables. In Chile, there t here are native berries with medicinal uses deep-rooted to mapuche culture and country people that have been studied by researchers both nationally and internationally. The aim of this article was to review the state of the art related to polyphenols identification, antioxidant capacity and polyphenols bioavailability of four native berries. Maqui fruits distinguish significantly for their polyphenols content and antioxidant Research in Magellan barberry (calafate), is Chilean (murtathe or properties murtilla) and Chilean strawberry relative of their antioxidantactivities. properties. However, higher scientific background neededguava to validate of these species so as todeliver achieve a real contributions appreciation of these unique raw materials for the development of functional foods and nutraceuticals. Keywords: Aristotelia chilensis chilensis; Ugni molinae; Fragaria chiloensis; Berberis buxifolia; buxifolia; Polyphenols.

Resumen Dentro de los productos naturales de origen vegetal, el interés por los polifenoles se debe principalmente a sus propiedades antioxidantes. Muchos frutos conocidos como berries presentan capacidades antioxidantes más altas, en relación a otras frutas y verduras. En Chile, existen berries nativos con usos medicinales muy arraigados a la cultura mapuche y rural del país, que han sido estudiados tanto por investigadores nacionales como internacionales. El objetivo de esta publicación fue revisar el estado del arte relacionado a la identificación de polifenoles, la capacidad antioxidante y la biodisponibilidad de compuestos polifenólicos de cuatro berries nativos. Los frutos de maqui destacan significativamente por sus contenidos de polifenoles y capacidad antioxidante, e investigaciones en calafate, murtilla y frutilla chilena entregan aportes relativos a sus propiedades antioxidantes. Sin embargo, aún, son necesarios mayores antecedentes científicos que validen las propiedades de estas especies de manera de lograr su real valorización como materias primas únicas, para el desarrollo de alimentos funcionales y nutracéuticos. buxifolia; Polifenoles. Palabras Clave: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Fragaria chiloensis; Berberis buxifolia;

AOX, antioxidantes; AT, antocianos totales; BNCh, berries nativos chilenos; CA, capacidad antioxidante; DAD, detector con arreglo de diodos; ESI, Electro Spray Ionization, fma, forma forma botánica; ssp, sub-especie botánica; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; ; PT, polifenoles polifenoles totales; UV-vis, ultravioleta-visible; var, variedad. Recibido | Received: May 15, 2009.  Recibido  2009.  Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: July Version:  July 27, 2009.  Publicado en Línea | Published Online: Online: November  November 30, 2009  2009   Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. interests.   Financiación | Funding: This work was not financed. This article must be cited as: Carolina Fredes. 2009. Antioxidantes en berries nativos chilenos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):469 – 478. {EPub November 30, 2009}.

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Fredes

Antioxidantes en berries nativos chilenos

Los productos naturales (metabolitos secundarios) son compuestos orgánicos, producidos  por las plantas, que parecen no tener una función directa sobre su crecimiento y desarrollo (Taiz y

de la CA total in vitro  de un compuesto, mezcla de AOX o alimento consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias cromógenas de naturaleza radicalaria, en que la pérdida de color ocurre de forma proporcional con la concentración.  No obstante, las determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro dan tan sólo una idea

Zeiger, 1991). Estos compuestos un rol reconocido sobre procesos comonolatienen fotosíntesis, asimilación de agua y nutrientes y la respiración celular (Salisbury y Ross, 1994); sin embargo, tienen un rol importante en la defensa y adaptación de las  plantas a su ambiente y como fuentes de principios activos con uso farmacéutico y alimenticio (Croteu et al., 2000). De acuerdo al origen de sus rutas de biosíntesis, los productos naturales se dividen en terpenos o terpenoides, polifenoles y alcaloides. El interés  principal sobre los polifenoles se debe a sus  propiedades antioxidantes (AOX). Manach et al. (2004) clasifica los polifenoles de acuerdo al número

aproximada de . lo ocurrede laenCAsituaciones complejas in vivo Los que resultados in vivo de muchos polifenoles pueden diferir significativamente de los resultados in vitro (Manach et al., 2005; Sies, 2007; Mermelstein, 2008), ya que la absorción de los  polifenoles en el organismo está determinada por sus estructuras químicas por lo que la real efectividad en el organismo dependerá de la biodisponibilidad de estos compuestos. La CA de una mezcla de AOX no está determinada sólo por la suma de las CAs de cada uno de sus componentes; también depende del microambiente en que se encuentra el compuesto. Los compuestos interactúan entre sí pudiendo

de sus estructuras químicas las anillos formas aromáticos en que estosdeanillos se unen entre sí. Dey acuerdo a esta clasificación, los polifenoles se dividen en no flavonoides (ácidos fenólicos), donde se encuentran los ácidos hidroxibenzoicos (ácido elágico) e hidroxicinámicos (ácido cafeico), flavonoides, estilbenos y lignanos. Los flavonoides que poseen dos anillos aromáticos, unidos por tres carbonos que forman un heterociclo oxigenado, se subclasifican en flavonoles, flavonas, isoflavonas, flavanonas, antocianidinas y flavanoles. Además de esta variedad de moléculas, las antocianidinas se  pueden unir a diferentes azúcares en distintas  posiciones formando los antocianos. Por otro lado,

 producirse efectos sinérgicos o inhibitorios (Prior y Cao, 1999; Robards et al., 1999). Existe una gran variedad de especies de diversas familias botánicas ( Rosaceae  Rosaceae,  Ericaceae,  Myrtaceae,  Berberidaceae,  Elaeocarpaceae, entre otras), a cuyos frutos se les denomina berries o bayas. Éstas se caracterizan por sus frutos pequeños de colores rojo y  púrpura. En términos botánicos, se define una baya como un fruto de múltiples semillas, de mesocarpio y endocarpio carnoso que proviene de una flor de ovario súpero (Bowling, 2000). Por lo tanto, en términos estrictamente botánicos, muy pocos de estos frutos son bayas verdaderas (sí lo serían el maqui y el calafate). Sin embargo, el uso del término berries es

los ácidos hidroxibenzoicos (ácido elágico) son componentes de compuestos de estructuras complejas como los taninos hidrolizables (elagitaninos)  presentes en frutillas, frambuesas y moras, entre otras (Clifford y Scalbert, 2000). Los flavonoides (Espin et al., 2000; Heim et al., 2002) muestran una gran capacidad para captar radicales libres causantes del estrés oxidativo, atribuyéndoseles a su vez un efecto beneficioso en la  prevención de enfermedades cardiovasculares, cancerígenas y neurológicas (Ishige et al., 2001; Katsube et al., 2003; Schramm y German, 1998). Existen diversos métodos para evaluar la capacidad antioxidante (CA) (Gil et al., 2000; Mermelstein, 2008), ya sea in vitro o in vivo. Una de las estrategias más aplicadas en las determinaciones

muy extendido a nivel comercial (Seeram, 2008), por lo quecientífico en esta yrevisión, sin desmedro del uso adecuado del término botánico, se referirá a algunas especies que no poseen bayas verdaderas o que corresponden a otro tipo de frutos (por ejemplo, a poliaquenios). El interés por el estudio de los berries nativos de Chile (BNCh) obedece a una tendencia mundial de  búsqueda de frutas y nuevas materias primas con altos contenidos de AOX. Muchos berries se destacan  por sus contenidos altos de polifenoles (Kahkonen et al., 1999; 2001; Seeram, 2008; Speisky et al., 2008). Halvorsen et al. (2002) determinaron la CA (método FRAP) de una serie de frutas y verduras consumidas en Noruega, en el que se destacaron las mayores CAs de algunas especies de berries silvestres (nativas), en

INTRODUCCIÓN

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relación a las especies cultivadas. Es así como, por ejemplo, la frutilla silvestre europea ( Fragaria vesca)  presentó 6,88 mM equivalentes Trolox/ 100 g, en comparación con la frutilla cultivada (Fragaria  x ananassa) que presentó 2,17 mM equivalentes Trolox/ 100 g (de fruta fresca). Algo similar se observó con el mirtilo (Vaccinium myrtillus) que

científicos que describen sus propiedades AOX que intentan validar sus usos tradicionales. El maqui ( Aristotelia  Aristotelia chilensis  (Mol.) Stuntz),  pertenece a la familia  Elaeocarpaceae (Fig. 1). Es una especie siempre-verde nativa de Chile que se distribuye entre Limarí (IV Región) y Aisén (IX Región), tanto en el valle central como en los faldeos

 presentó 8,23 mM Trolox/ (Vaccinium 100 g, en comparación con equivalentes el arándano corymbosum) que presentó 3,64 mM equivalentes Trolox/ 100 g (de fruta fresca). Dada las condiciones edafoclimáticas donde crecen muchas especies de BNCh y a que los polifenoles (en especial los flavonoides) son compuestos cuya síntesis es favorecida por condiciones de estrés, se esperaría que estas especies presentaran contenidos altos de este tipo de AOX. El objetivo de esta publicación fue revisar el estado del arte relacionado a la identificación y cuanti-ficación de polifenoles, CA y  biodisponibilidad  biodisponibi lidad de polifenoles ddee BNCh.

cordilleranos, desde(Rodríguez cerca del nivel del marPosee hastauna los 2.500 m de altitud et al. 1983). gran plasticidad morfológica, presentándose como arbusto en la zona septentrional de su distribución y como árbol en la zona meridional. Para la cultura mapuche es una especie sagrada, símbolo de “Buena intención” (Hoffmann, 1982). Los usos tradicionales de esta especie se basan en la utilización de infusiones de hojas para el tratamiento de enfermedades de la garganta, los frutos como antidiarreicos y el jugo de los frutos, para darle tinte al vino y otras bebidas (Muñoz et al., 2001; Montenegro, 2002).

Usos tradicionales de algunas especies de BNCh La flora chilena representa un recurso genético importante, especialmente si se considera su riqueza de especies. Chile central es un “hotspot” de  biodiversidad. Tiene alrededor de 1.605 plantas endémicas, que equivalen al 0,5% de las 300.000 especies de plantas descritas mundialmente. Esto se traduce en que el 46,8% de las plantas descritas en Chile sean endémicas (Myers et al., 2000). La flora nativa fue utilizada por los habitantes prehispánicos con fines diversos, entre los cuales estuvo el uso alimenticio, combustible, religioso, ornamental, cestería, tintóreo y medicinal. La tradición de uso medicinal de las plantas chilenas por las poblaciones nativas ha quedado registrada en crónicas de los colonizadores quienes, a su vez, la enriquecieron con el aporte de plantas medicinales provenientes de Europa y otras regiones (Massardo y Rossi, 1996). Los libros de medicina naturista muestran que el uso medicinal de las plantas nativas de Chile incluye un amplio espectro de afecciones y prácticas curativas (Rozzi y Massardo, 1994 a, 1994 b). Esta revisión se concentró en cuatro BNCh (maqui, calafate, murtilla y frutilla) que poseen usos tradicionales muy difundidos por la población rural del país (Smith-Ramírez, 1994; Massardo y Rossi, 1996) y muy arraigados a la cultura mapuche (Houghton y Manby, 1985; Molares y Ladio, 2009). Para estas especies existen diferentes estudios

Figura 1. Maqui 1. Maqui (Paredones, VI Región)

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El calafate ( Berberis  Berberis

buxifolia  Lam.)

pertenece a

 Berberidaceae nativo la familia siempre-verde (Fig 2). de Es un arbusto espinas, Chile que con se distribuye desde la Región Metropolitana a la XII Región. Las raíces de esta especie han sido utilizadas  para el control de fiebres e inflamaciones, dolores estomacales, indigestiones y colitis y los frutos, por sus pigmentos naturales (Muñoz et al., 2001; Montenegro, 2002; Freile et al., 2003). La murtilla o murta (Ugni molinae  Turcz),  pertenece a la familia  Myrtaceae (Fig. 3). Es un arbusto siempre-verde nativo de Chile que se distribuye desde el sur de Talca (VII Región) a Río Palena (XI Región). La murta es conocida por este nombre en las provincias de Valdivia y Chiloé, como

murtilla más al(Urban, norte (Concepción) y como uñi, por los mapuches 1934). Los usos tradicionales de esta especie se basan en la utilización de

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infusiones de hojas para el tratamiento de infecciones urinarias y enfermedades de la garganta y los frutos,  por su poder astringente (Muñoz et al., 2001; Montenegro, 2002).

Figura 4. Frutilla 4. Frutilla chilena: a) fma. patagonica (Chiloé, X Region) y b) fma. chiloensis (Pichihuillinco, VIII Region).

Figura 2. 2. Calafate (Puerto Williams, XII Región)

La frutilla chilena (Fragaria chiloensis  (L.) Duch. ssp. chiloensis  fma. patagonica Staudt y fma. chiloensis Staudt), pertenece a la familia  Rosaceae. Es una planta herbácea perenne nativa de Chile que se distribuye entre la VIII y XII Región (Darrow, 1996). Lavin et al.  (2000) indican que la fma.  patagonica de frutos rojos (Fig. 4a) se distribuye entre Iloca (VII Región) y Chiloé (X Región), mientras que la fma. chiloensis (Fig. 4b) de frutos  blancos se distribuye hasta la XII Región. El fruto de la frutilla corresponde a un poliaquenio que consiste en un tálamo central carnoso con múltiples aquenios en su superficie (frutos verdaderos). Los aquenios contribuyen entre un 0,3 y 1,1 % al peso total del fruto fresco (Cheel et al. 2007). No se describen usos medicinales para hojas y frutos; sin embargo, los frutos han sido utilizados tradicionalmente para la elaboración de mermeladas y conservas. Figura 3. Murtilla 3. Murtilla (Cañete, VIII Región).

Identificación y cuantificación de polifenoles en BNCh La identificación de polifenoles de BNCh se ha realizado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a diferentes tipos de detectores (DAD, ESI-MS). Para la cuantificación de  polifenoles totales (PT) se ha descrito el método del reactivo de Folin-Ciocalteau (Singleton y Rossi, 1965) y para antocianos (AT), el método diferencial de pH (Giusti y Wrolstad, 2001) mediante espectrofotometría UV-vis (ultravioleta-visible). (ultravioleta-visible). El interés por el maqui se ha centrado  principalmente en su contenido de antocianos. Escribano-Bailón et al. (2006) identificaron mediante HPLC-DAD-MS ocho antocianos, para los que propusieron las siguientes identidades: delfinidina-3- sambubiósido -5-glucósido, delfinidina 3,5 diglucósido, cianidina-3- sambubiósido-5glucósido, cianidina 3,5-diglucósido, delfinidina 3sambubiósido, delfinidina 3- glucósido, cianidina 3sambubiósido y cianidina 3- glucósido. Los derivados de delfinidina (73%) predominaron sobre los derivados de cianidina (37%), siendo la delfinidina-3sambubiósido -5-glucósido (34% del total de antocianos).elEl principal contenido antociano promedio de AT fue de 137,6 mg equivalentes de delfinidina 3glucósido/100 g de fruta fresca. El interés por el calafate, de manera similar al maqui, se ha centrado principalmente en sus contenidos de antocianos. No se han descrito los antocianos de calafate de manera pormenorizada,  pero existen antecedentes de la evolución del contenido de AT durante el crecimiento y desarrollo del fruto (Arena y Curvetto, 2008). En este estudio se determinó que la máxima concentración de AT (761,30 mg equivalentes de cianidina 3glucósido/100 g de fruta fresca) coincidió con la mayor de sólidos solubles (24,88 °Brix) aconcentración los 126 días después de plena floración. La determinación de los sólidos solubles mediante

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refractometría es un análisis simple que se realiza en terreno, que permitiría cosechar esta fruta en el momento de máxima acumulación de AT. Los polifenoles en la murtilla han sido  principalmente estudiados en sus hojas, donde se han descrito ácidos fenólicos, taninos hidrolizables, flavanoles (epicatequina) y flavonoles (miricetina,

HPLC-ESI-MS. La utilización combinada de LC DAD/ESI-MS ha sido descrita como un método excelente y exacto para el análisis de polifenoles en frutillas (Seeram et al., 2006; Aaby et al., 2007; Lopes da Silva et al., 2007). De acuerdo a ese estudio, los componentes fenólicos de las tres especies corresponden principalmente a

quercetina) Rubilar los et compuestos al., 2006). Peña-Neira et(Avello, al. (2007)2000; determinaron fenólicos de bajo peso molecular de frutos de murtilla de diferentes ecotipos mediante HPLC-DAD. Si bien los perfiles cromatográficos variaron de acuerdo a los ecotipos analizados, los principales polifenoles identificados fueron elagitaninos y derivados de flavonoles (quercetina). Cheel et al.  (2005) aislaron tres glicósidos de ácido  E -cinámico, -cinámico, triptófano y cianidina-3-O-β-dglucopiranósido de frutos maduros de frutilla chilena (fma. chiloensis). Los extractos de las diferentes  partes del fruto (aquenios y tálamo), analizados mediante HPLC, indicaron que los aquenios

 proantocianidinas  proantocianidinas, , taninos glucósidos de flavonol. En hidrolizables, ambas frutillasantocianos chilenas ely  principal glucósido de flavonol fue la quercetina 3-Oglucurónido y los antocianos identificados en menores concentraciones la cianidina-malonilglucósido y pelargonidina-malonil-glucósido. La frutilla comercial presentó el mayor contenido de AT (27,90 mg/100 g de fruta fresca), mientras que la fma. chiloensis presentó el contenido más bajo (2,20 mg/100 g de fruta fresca). La fma. patagonica  presentó un contenido intermedio (22,53 mg/100 g de fruta fresca). El ácido elágico fue el principal  polifenol encontrado en la frutilla chilena blanca. Este estudio permitió una clara diferenciación entre

β-dcontienen ácido elágico glucopiranósido, mientraslibre que yelcianidina-3-Otálamo contiene derivados del ácido E -cinámico -cinámico y triptófano. Simirgiotis et al. (2009) compararon la composición fenólica de extractos de frutilla chilena (fma. chiloensis y fma. patagonica) con la frutilla comercial (cv. Chandler) mediante HPLC-DAD y

los compuestos químicos de la frutilla comercial y de la frutilla chilena. La Tabla 1 resume los principales grupos de  polifenoles identificados en BNCh, donde se destaca la presencia de flavonoles (quercetina) y antocianidinas (cianidina).

Tabla 1. Principales 1. Principales polifenoles descritos en BNCh. Especie

Parte de la planta

No flavonoides

Flavonoides

Maqui

Baya

---

Antocianidinas (delfinidina, cianidina)

Calafate

Baya

---

Antocianidinas (ni),

Murtilla

Hoja

Acidos fenólicos (ni)

Flavanoles (epicatequina), (miricetina, quercetina) flavonoles

Fruto

---

Flavonoles (quercetina)

Fruto

---

Flavonoles (quercetina), antocianidinas (cianidina, pelargonidina)

Tálamo

Ácido E- cinámico

---

Aquenios

Ácidos hidroxibenzoicos (ácido elágico)

Antocianidinas (cianidina)

Frutilla chilena

Adaptado de: Avello (2000), Cheel et al . (2005), Escribano-Bailón et al. (2006), Rubilar et al. (2006), Peña-Neira et al. (2007), Arena y Curvetto ( 2008), Simirgiotis et al. (2009). ni: compuestos químicos no identificados.

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Capacidad antioxidante y biodisponibilidad de BNCh La determinación de la CA de BNCh se ha realizado mediante diferentes métodos: FRAP (ferric reducing activity power), TRAP (total radicaltrapping parameter), TAR (total antioxidant antioxidant reactivity), TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), radical DPPH• (2,2-difenil-1 picrilhidracil), ORAC (oxygen radical absorbance capacity). El método FRAP mide la reducción del ión férrico (Fe+3) a ferroso (Fe+2) en la presencia de AOX, mientras que los métodos TRAP, TAR, TBARS, radical DPPH• y ORAC miden la capacidad de los AOX de atrapar diferentes tipos de radicales libres (Araya, 2002; Céspedes et al., 2008; Miranda-Rottmann et al., 2002). Miranda-Rottmann et al.  (2002) compararon los contenidos de PT y CA (métodos TRAP y TAR) de diferentes jugos concentrados (arándano, frambuesa, frutilla, cranberry, mora y maqui) y vino tinto. Las CAs fueron directamente proporcionales a los contenidos de PT, destacándose el jugo de maqui significativamente sobre el resto de los jugos concentrados y el vino tinto. Araya et al. (2006) determinaron la CA (método FRAP) de una serie de frutas y verduras consumidas en Chile. El maqui destacó significativamente sobre el resto de las especies analizadas. Los valores de frutas estuvieron comprendidos entre 0,02 mM Fe/100 g para el pepino hasta 12,32 mM Fe/100 g  para el maqui, destacando el valor alto de otros  berries como la frutilla y zarzamora (3,10 y 3,55 mM Fe/100 g). En la zona intermedia se ubicaron frutos como el limón y el membrillo con (0,25 y 0,23 mM Fe/100 g) y los valores más bajos correspondieron a manzana (var. Fuji) y duraznos. Frente a estos resultados, el maqui sobresale por su CA determinada in vitro.  Céspedes et al. (2008) determinaron que el extracto metanólico de frutos de maqui presentó actividad antioxidante y cardioprotectora sobre la isquemia/reperfusión aguda de corazón de ratas in vivo. Por otra parte, este extracto fue capaz de  prevenir estos eventos nocivos en el corazón del animal, por la disminución de la oxidación de lípidos y la reducción de la concentración de TBARS. Además, estos autores determinaron la CA del extracto metanólico de maqui mediante DPPH· (IC50), ORAC, FRAP y TBARS. El extracto www.blacpma.org

metanólico presentó un IC50  de 1,62 µg/mL y para TBARS un valor de 2,51 µg/mL, en comparación con el jugo de maqui que presentó un IC50 de 12,1 µg/mL y para TBARS un valor de 9,58 µg/mL. La CA del extracto metanólico de maqui estuvo fuertemente correlacionada con el contenido de PT (12,97 µM ECat/g), que se observó por los mayores valores de ORAC (29,69 µM ET/g) y FRAP (25frutos µM ECat/g). Estos resultados demostraron que estos podrían ser útiles como fuentes de AOX, cardioprotectores y nutracéuticos. Avello et al. (2008) evaluaron la CA (método TBARS) plasmática antes y después de la ingesta de infusiones de hojas de maqui (1%). El contenido de fenoles totales en la infusión fue de 0,074 mM equivalentes de ácido gálico. En este estudio, voluntarios sanos no fumadores y con índice de masa corporal dentro del rango normal para cada uno,  bebieron esta infusión dos veces al día durante tres días (dosis descrita por la etnomedicina para el tratamiento de distintos cuadros). Los resultaron indicaron de la CA observadoun poraumento medio depromedio TBARS (30,27 %).a las 24 h Rubilar et al. (2006) determinaron la CA (radical DPPH·y TBARS) de diferentes tipos de extractos de hojas de murtilla. Los solventes utilizados fueron etanol, metanol y agua. El mayor contenido de PT (2,6% de equivalentes de ácido gálico) fue obtenido con metanol, mientras que la mayor CA (IC50) fue obtenida con el extracto etanólico (0,12 M ácido gálico/M DPPH·). El agua como solvente presentó el mejor resultado de CA por el método TBARS. Avello y Pastene (2005) evaluaron la CA (método ORAC) plasmática antes y después de la ingesta de infusiones de hojas de murtilla (1%).  En este estudio, voluntarios sanos (normolipédicos y no diabéticos),  bebieron esta infusión dos veces al día durante tres días. Los resultados indicaron un aumento significativo (de 2.258 a 3.108 µM ET/L), en la CA del plasma de los voluntarios. Estos antecedentes serían un aporte valioso en la validación de los usos tradicionales de las hojas de esta especie. Cheel et al. (2007) determinaron la CA (radical DPPH·) de la frutilla chilena (fma. patagonica y fma. chiloensis), frutilla comercial (var. Chandler) y de la frutilla silvestre europea. Los resultados de este análisis fueron expresados como porcentaje de decoloración del radical DPPH, el grado de decoloración indicó la eficiencia de las especies de atrapar radicales libres. La variedad Chandler  presentó la mayor CA (86%), mientras que la fma.

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 patagonica presentó la menor CA (43%). En este estudio, la frutilla silvestre europea presentó una CA menor que la frutilla cultivada, siendo estos resultados diferentes a los obtenidos por Halvorsen et al. (2002), lo que se podría deber a que ambos métodos de CA (radical DPPH· y FRAP) se basan en  principios diferentes. diferentes.

utilización de un mismo método, los resultados están expresados en diferentes unidades. Además, existen estudios de CA para jugos y extractos (con diferentes tipos de solventes) para los que los contenidos de PT y la CA pueden variar significativamente.

Simirgiotis (2009) metanólicos determinaron CA (radical DPPH·)etdeal.extractos de la frutilla chilena (fma. chiloensis), de sus fracciones y compuestos purificados. Las fracciones etanólicas (B y E) presentaron CAs destacables que fluctuaron entre 20,3 y 41,4 µg/mL. Los principales compuestos químicos presentes en estas fracciones fueron  pelargonidina-malonil-glucósido,  pelargonidina-malon il-glucósido, elagitaninos, quercetina glucorónido y canferol cumaril-hexósido (en fracción B) y ácido elágico pentósido y ramnósido, ácido elágico y quercetina glucorónido (en fracción E). La Tabla 2 resume los principales métodos de CA descritos en las publicaciones de BNCh. Es difícil

COMENTARIOS Y DESAFÍOS Los antecedentes científicos de las propiedades AOX de BNCH publicados a la fecha presentan diferentes estados de avance; siendo los frutos de maqui los mayormente estudiados. De acuerdo a estas  publicaciones, esta especie se destaca tanto por sus contenidos de PT y AT como por su CA in vitro e in vivo. Sin embargo, no existen estudios de  biodisponibilidad  biodisponibi lidad de los polifenoles de maqui, calafate, murtilla y frutilla chilena. Para infusiones de hojas de maqui y murtilla existen resultados derivados de pequeñas intervenciones en voluntarios sanos pero, no se sabe qué compuestos o metabolitos dan cuenta de la actividad antioxidante y si alcanzan concentraciones plasmáticas relevantes.

establecer entreya que los losresultados obtenidos decomparaciones estas publicaciones, métodos utilizados se basan en principios diferentes y bajo la

Tabla 2. Métodos 2. Métodos descritos para la determinación de CA de BNCh. Método

Expresión de resultados

Referencia

FRAP

mM Fe/100 g µM ECat/g

Araya, 2006 Céspedes et al., 2008

TRAP

µM ET/L

Miranda-Rottmann et al., 2002

TAR

µM E T/L

Miranda-Rottmann et al., 2002

TBARS

µg EMDA/mL

Céspedes et al., 2008 Rubilar et al., 2006

Radical DPPH·

µg/mL   M ácido gálico/M DPPH· % decoloración DPPH· µg/mL

Céspedes et al., 2008 Rubilar et al., 2006 Cheel et al., 2007 Simirgiotis et al. 2009

ORAC

µM ET/L  µM ET/g

Avello y Pastene, 2005 Céspedes et al., 2008

ECat: equivalentes catequina. ET: equivalentes Trolox. EMDA: equivalentes malondialdehído % decoloración DPPH· = absorbancia del blanco

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absorbancia del compuesto [o extracto] x 100

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Este tipo de evidencia es crucial para el desarrollo de alimentos saludables (funcionales). De acuerdo al Food and Drug Administration (www.cfsan.fda.gov/~dms/hpotguid.html), un mensaje que ddescribe escribe el nivel de nut nutrientes rientes A AOX OX  presentes en un alimento es un mensaje de contenido de nutrientes, y un mensaje del contenido de nutrientes sóloque se esté puede hacer para compuestosAOX para los establecida unaaquellos ingesta diaria de referencia (IDR). Para esto, los compuestos (o en este caso, los polifenoles) deben tener una actividad antioxidante reconocida, es decir, debe existir evidencia científica consistente que señale que el compuesto participa en procesos fisiológicos,  bioquímicos o celulares que inactivan los radicales libres o previenen las reacciones químicas iniciadas  por los radicales libres después después de haber sido ingerido y absorbido en el tracto gastrointestinal. El uso de los BNCh como materias primas para el desarrollo de colorantes naturales sería otra alternativa de I+D interesante. La utilización de antocianos el desarrollo deindustria colorantes naturales está siendo para reconsiderada por la alimenticia, debido a la mayor demanda de los consumidores por  productos más naturales (Nachay, 2009). Esta tendencia se podría deber al cuestionamiento de la seguridad de los colorantes artificiales alimenticios y a estudios que los asocian con problemas de hiperactividad en niños entre 3 y 8-9 años (McCann et al., 2007). Frente a esto, el maqui, el calafate y la murtilla representan fuentes alternativas de antocianos. En Chile, existen pocos antecedentes de cultivo comercial de BNCh. Cabe señalar los aportes que ha realizado el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) en el estudio de la murtilla (http://www.murtillachile.cl/cultivo.asp) y diversas iniciativas locales para la frutilla chilena (fma. chiloensis) en la ciudad de Contulmo. Paralelamente a la generación de nuevas investigaciones en torno a las propiedades saludables de estas especies, sería necesario avanzar en el desarrollo de manejos agronómicos que faciliten sus cultivos, no sólo con el objeto de generar una oferta de materia prima que permita el escalamiento de  productos a nivel industrial, sino para garantizar el uso sustentable de estos recursos nativos de Chile a mediano plazo. Finalmente, los BNCh podrían constituirse en materias primas únicas para el desarrollo de nuevos  productos, debido a la tendencia mundial hacia www.blacpma.org

alimentos de carácter “natural” y con propiedades  beneficiosas para la salud. Ante lo cual, las  potencialidades de uso para los BNCh serían muy diversas y de grandes proyecciones. AGRADECIMIENTOS Beca CONICYT para realizar estudios de Doctorado en Chile. A los profesores Paz Robert (Dra. Química de la Facultad de Química y Farmacia, Universidad de Chile) y Miguel Gómez (Botánico de la Facultad de Agronomía, Pontificia Universidad Católica) por sus aportes valiosos a la redacción de este artículo. REFERENCIAS Aaby K, Ekeberg D, Skrede G. 2007. Characterization of  phenolic compounds in strawberry (Fragaria  x ananassa) fruits by different HPLC detectors and contribution of individual compounds to total antioxidant capacity. J Agr Food Chem 55(11):4395–  4406. Araya H, Clavijo C, Herrera C. 2006. Capacidad antioxidante de frutas y verduras cultivadas en Chile. Arch Latinoam Nutr 56(4):361-365. Arena M, Curvetto N. 2008.  Berberis buxifolia  fruiting: Kinetic growth behavior and evolution of chemical  properties during the fruiting period and different growing seasons. Sci Hortic 118:120–127. Avello M. 2000. Estudio fitoquímicos de las hojas de Ugni molinae  Turcz (“Murtilla”) y evaluación de las  propiedades antioxidantes de sus componentes. Tesis  pregrado, Universidad de Concepción, Concepción, Chile. Avello M, Pastene E. 2005. Actividad antioxidante de infusos de Ugni molinae  Turcz (“Murtilla”). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 4(2):33-39. Avello M, Valladares R, Ordóñez JL. 2008. Capacidad antioxidante de  Aristotelia chilensis  (Molina) Stuntz. Rev Cubana Plant Med. 13(4). [citado 2009-06-19]. Disponible en: http://scielo.s http://scielo.sld.cu/scielo.php?s ld.cu/scielo.php?script=sci_artte cript=sci_arttext&pid= xt&pid= S1028-47962008000400002&lng=es&nrm=iso   S1028-47962008000400002&lng=es&nrm=iso Bowling BL. 2000. The berry grower´s companion. Timber Press, Inc. Portland, Oregon, USA. 284 p. Céspedes CL, Hafidi M, Pavon N, Alarcón J. 2008. Antioxidant and cardioprotective activities of phenolic extracts from fruits of Chilean blackberry  Aristotelia chilensis  ( Elaeocarpaceae  Elaeocarpaceae), Maqui. Food Chem 107:820–829. Cheel J, Theoduloz C, Rodríguez J, Saud G, Caligari PDS, Schmeda-Hirschmann G. 2005.  E -cinnamic -cinnamic acid derivatives and chiloensis phenolics ssp. from chilean Jstrawberry fruits, Fragaria chiloensis. Agr Food Chem 53(22):8512–8518.

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Fredes

Antioxidantes en berries nativos chilenos

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© 2009 The Authors © 2009 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 8 (6), 479 - 486 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artículo Original | Original Article

 

chilensis y Ugni Extractos antioxidantes y antimicrobianos de Aristotelia chilensis  molinae y sus aplicaciones como preservantes preservantes en productos productos cosméticos [Antioxidants and antimicrobial extracts of  Aristotelia  Aristotelia chilensis and Ugni molinae and its applications as  preservatives in cosmetic cosmetic products] Marcia AVELLO1*, Rogelio VALDIVIA1, Ruth SANZANA1, María Angélica MONDACA2, Sigrid MENNICKENT1, Valeska AESCHLIMANN1, Magalis BITTNER3, José BECERRA3 1

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Facultad de Farmacia; Facultad de Ciencias Biológicas; Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

Abstract The global market for cosmetics preservatives and antioxidants has experienced a significant shift towards natural products, as it has been called into question the safety of preservatives used in industry. The aim of this study was to evaluate the potential of  Aristotelia chilensis  and Ugni molinae  leaf extracts, for their use as natural antioxidants and preservatives in cosmetics. This study was motivated by background information on the presence of antimicrobial and antioxidant compounds in both species. Extracts from leaf of  Aristotelia chilensis and Ugni molinae were evaluated by determination of their antimicrobial and antioxidant capacity. The extraction was developed in Soxhlet apparatus, the antioxidant capacity was tested through the stabilization of the radical free 1-1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH) and the antimicrobial was evaluated through inhibition activity on Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes,

and Candida albicans, in addition the extracts were standardized in gallic acid equivalents (EAG) through the Folin-Ciocalteu method, which is a form of standardized extracts in a chemical marker. The best extracts were selected in terms of antimicrobial and antioxidant capacity to conduct trials of application in cosmetics. In these formulations, physicochem physicochemical, ical, sensorial and microbial stabilities over time and in different storage conditions were determined. None of this products developed bacterial or fungal grow, and all of them maintained the physicochemical and sensorial features.

Keywords: Aristotelia chilensis; chilensis; Ugni mol molinae inae; Preservatives; Antioxidants; Cosmetics.

Resumen El mercado mundial de los preservantes y antioxidantes cosméticos ha experimentado un importante vuelco hacia los productos naturales, puesto que se ha puesto en entredicho la seguridad de los preservantes más utilizados en la industria. Este estudio tiene como objetivo evaluar el potencial de extractos de hojas de  Aristotelia chilensis  y Ugni molinae, para su uso como preservantes y antioxidantes naturales en productos cosméticos. Este estudio ha sido motivado por antecedentes acerca de la capacidad antimicrobiana y antioxidante de los compuestos presentes en ambas especies. A partir de hojas de antioxidante y antimicrobi antimicrobiana ana de éstos. La extracción se desarrolló  Aristotelia chilensis y Ugni molinae se elaboraron extractos, determinando la capacidad antioxidante en aparato Soxhlet, la capacidad antioxidante se realizó a través de la estabilización del radical libre 1-1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) y la actividad antimicrobiana se analizó frente a Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, y Candida albicans, además los extractos se estandarizaron en Equivalentes de ácido gálico (EAG) a través del método Folin-Ciocalteu, que es una forma de uniformar extractos en un marcador químico. Se seleccionaron los mejores extractos en cuanto a capacidad antioxidante y antimicrobiana para realizar ensayos de aplicación en productos cosméticos. En éstos se determinó la estabilidad fisicoquímica, sensorialniy fúngico, microbiana función del las tiempo, en diferentes condicionesy de almacenamiento. De los productos elaborados, en ninguno se observófisicoquími desarrolloca, bacteriano y seenmantuvieron características físicoquímicas sensoriales.

Palabras Clave: Aristotelia chilensis; chilensis; Ugni mol molinae inae; Preservantes; Antioxidantes; Cosméticos. Recibido | Received: January 14, 2009.  Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version:  August 4, 2009.  Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009   Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests.  Financiación | Funding: This work was financed by Proyecto Interno DIUC 207.074.038 and Proyecto Anillo PBCT ADI-38, from Universidad de Concepción.. This article must be cited as: Marcia Avello, Rogelio Valdivia, Ruth Sanzana, María Angélica Mondaca, Sigrid Mennickent, Valeska Aeschlimann, Magalis Bittner, José Becerra. 2009. Extractos antioxidantes y antimicrobianos de  Aristotel  Aristotelia ia chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosméticos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):479 – 486. {EPub November 30, 2009}.

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Avello et al.

Extractos de A. chilensis chilensis y U. molinae como preservantes en productos cosméticos

Los productos denominados “cosméticos” cumplen muy diversas funciones, incluyendo no sólo los productos de belleza, sino también los productos  para el cuidado personal, la higiene y el bienestar

Consumidor (SCCP) de la Unión Europea ha adoptado un postura moderada indicando que la evidencia científica es insuficiente para aseverar que los parabenos producen cáncer, el mercado consumidor empezó inmediatamente a ejercer una  presión sobre los productores, demandando nuevas alternativas (Terasaka et al., 2006). La percepción

(Schrickel 2001). Aunquey Bittner, los representantes de la industria cosmética mundial declaran que todos los componentes utilizados en sus productos están sujetos a rigurosas pruebas de seguridad para garantizar la protección tanto de los usuarios como de sus trabajadores, lo cierto es que muchos componentes que alguna vez fueron considerados seguros han sido prohibidos, después de décadas de uso intensivo, por los organismos competentes, ante nuevas evidencias respecto de su falta de seguridad (Darbre, 2006). Debido a lo anteriormente expuesto, los consumidores perciben el segmento de los  productos naturales como más seguro para su salud y

 positiva acerca denaturales, la seguridadhae inocuidadde los deconsumidores los ingredientes estimulado la aparición de nuevos sistemas  preservantes de origen natural junto a sus homólogos sintéticos; las mezclas de aceites esenciales tienen  buena acción antimicrobiana pero, en general, pobre acción antioxidante. Además, su potente aroma las hace poco aptas en un amplio rango de aplicaciones (Fundación para la Innovación Agraria, 2003). Los extractos de las especies chilenas  Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz  Elaeocarpaceae (Maqui) y Ugni molinae  Turcz.  Myrtaceae (Murtilla), han mostrado interesantes resultados tanto por su acción antioxidante, así como su capacidad antibacteriana,

el ambiente, cual crea para los creciente ingredientes origen naturallo una oportunidad en de el mercado de los cosméticos. A la vez, el reemplazo de ingredientes sintéticos por otros naturales de igual eficacia o desempeño constituye un importante desafío científico y tecnológico. Los preservantes ayudan a mantener la estabilidad de un producto creando un ambiente inhóspito para el crecimiento antimicrobiano. Además, los productos deben poseer un efecto antioxidante que les permita evitar la rancidez por oxidación de los componentes lipídicos de una formulación o aquellos que sean susceptibles de degradación oxidativa. Muchas moléculas naturales cumplen, en general, una función

debido aet laal.,composición fenólica sus Estas hojas (Rubilar 2006; Suwalsky et al.,de2008). especies chilenas revisten gran importancia en el marco de la creación de valor a partir de productos forestales no madereros mediante tecnologías sustentables (Ministerio de Agricultura, Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), 2006). El principal uso comercial de  Aristotelia chilensis  se concentra en extractos del fruto como colorante. En los últimos años, las investigaciones acerca de los extractos de  Aristotelia chilensis se han volcado a la determinación de propiedades terapéuticas más allá de estudios farmacológicos, utilizando modelos in vitro, basados en la premisa de que las capacidades antioxidantes específicas de  Aristotelia chilensis  tendrían un efecto en eventos aterogénicos tempranos (Avello et al., 2008). Por su parte, Ugni molinae  ha recibido gran atención en los últimos años, debido al impulso que le ha dado el Instituto de Investigaciones Agropecuarias del Ministerio de Agricultura de Chile (INIA) al promocionarlo como el primer berrie nativo que representa una real alternativa de cultivo para la zona sur (Ministerio de Agricultura, Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), 2006) del país. La composición química de extractos de Ugni molinae, su contenido de polifenoles y sus capacidades antiinflamatoria y antioxidante han sido estudiados  por investigadores de distintas universidades, y se encuentran detalladas en publicaciones de distinto

INTRODUCCIÓN

o la otra, pero no ambas en la misma aplicación. Entre los preservantes más utilizados en cosmética está el grupo de los parabenos, los cuales se han utilizado por más de 20 años tanto en alimentos como en cosméticos, y se encuentran presentes en más del 50% de los productos cosméticos actualmente en estanterías (Soni et al., 2005) Los parabenos han sido el centro de una gran controversia desde que en el 2004 fue publicado un artículo que daba cuenta de la  presencia de parabenos en el tejido canceroso de los tumores de mamas de varias mujeres (Darbre   et al., 2004). Esta investigación, aunque en forma equívoca, ligó la presencia de parabenos con el riesgo de cáncer de mama, y desencadenó un importante debate entre las empresas y los investigadores involucrados. Aunque la Comisión Científica para Productos al www.blacpma.org

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Avello et al.

Extractos de A. chilensis chilensis y U. molinae como preservantes en productos cosméticos

nivel de impacto (Avello y Pastene, 2005; Suwalsky et al., 2006; 2006a). Ciertamente existe una creciente oportunidad de mercado para nuevos extractos naturales como  preservantes para productos cosméticos, ya sea por sí solos si sus propiedades lo ameritan, o en mezclas, con otros productos naturales, y también con  productos sintéticos. sintéticos. El objetivo del siguiente estudio fue evaluar el  potencial preservante y antioxidante de extractos de hojas de  Aristotelia chilensis y Ugni molinae para su uso en productos cosméticos. No existen estudios  preliminares de este tipo, radicando la originalidad de éste en la incorporación de extractos biológicamente activos para conservar productos comerciales.

MATERIALES Y MÉTODOS Material Vegetal Se colectaron hojas de  Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz (Elaeocarpaceae)  (Maqui) y Ugni molinae  Turcz. (Myrtaceae)  (Murtilla), en los meses de diciembre del 2005 y marzo del 2006 en campos de la VIII de Chile. El material vegetal fue identificado en el Departamento de Botánica, Facultad de Ciencias  Naturales y Oceanográficas de la Universidad de Concepción (CONC Nº 153285 y CONC Nº 146511, respectivamente). Las hojas cosechadas se deshidrataron a la sombra, y se procesaron deshidratadas. De cada muestra se tomaron 2000 gramos de material vegetal deshidratado, el cual se redujo de tamaño hasta un tamaño de partícula de 0,5 cm. Extracción La extracción se realizó con 50 gramos de muestra molida tanto de hojas de  Aristotelia chilensis  como de Ugni molinae en aparato Soxhlet. En cada caso, se ensayaron los siguientes solventes: H2O100%, mezcla EtOH-H2O (40%-60% / 60%-40%), EtOH 100%, mezclas MeOH- H2O (40%-60% / 60%-40%) y MeOH 100%. La relación masa-solvente fue de 6:1. Cada extracción se llevó a cabo hasta agotar el material vegetal, lo cual se determinó mediante la medición del contenido de sólidos en el extracto. Cada extracto se concentró en rotavapor y se llevó a sequedad en liofilizador. Para cada extracto se determinó el rendimiento total en base seca. Los extractos se guardaron en lugar seco y protegido de la luz hasta el momento de su utilización. www.blacpma.org

Determinación de Fenoles Totales Cada extracto se estandarizó por su contenido fenólico en moles/L de Equivalentes de Ácido Gálico (M EAG), que es una forma de uniformar extractos en un marcador químico (Singleton y Rossi, 1965), medido por el método de Folin-Ciocalteu (Velioglu et al., 1998), el protocolo fue el siguiente, a 0,5 mL de extractos al 1% preparados en agua, se le adicionó 25 mL H2O destilada, 2,5 mL Reactivo Folin-Ciocalteu (Merck, Germany) y 10 mL Carbonato de Sodio 20%, en el mismo orden. Luego se enrasó a 50 mL con H2O destilada. Se agitó, para homogeneizar y se dejó reposar por 30 minutos. Paralelamente se  preparó un blanco analítico con agua destilada. La absorbancia de la muestra fue medida a una longitud de onda de 765 nm en espectrofotómetro (Shimadzu UV-VIS 1601) y las absorbancias de las muestras fueron interpoladas en una curva de calibración  preparada con ácido gálico (Merck, Germany) en las condiciones antes descritas. La determinación de fenoles totales se realizó por triplicado para cada extracto. Capacidad Antioxidante A cada extracto se le realizó análisis de capacidad antioxidante de manera preliminar, con el fin de seleccionar aquéllos que presentan una mayor capacidad, para su incorporación en una fórmula cosmética. Se empleó el modelo de decoloración del radical libre DPPH  (Joyeux et al., 1995). Se mezclaron 750 μL de los extractos preparados en etanol a 6,0 y 0,6 μM EAG con 1,5 mL de la solución etanólica (20 mg/mL) del radical libre DPPH (Merck, Germany). La absorbancia (Shimadzu se determinó a 1601) 517 nm en espectrofotómetro UV-VIS después de 5 minutos de reposo. Como estándar se utilizó ácido gálico (Merck, Germany) y como blanco etanol. La capacidad antioxidante se expresó en  porcentaje de estabilización del radical. La capacidad antioxidante se realizó por triplicado para cada extracto.

Capacidad Antimicrobiana A cada extracto se le realizó análisis de capacidad antimicrobiana de manera preliminar cualitativa por inhibición del crecimiento bacteriano, en triplicado  para cada extracto, con el fin de seleccionar aquéllos que presentanen una una fórmula mayor cosmética. capacidad, para su incorporación

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La actividad antimicrobiana se determinó por el método de difusión en agar tripticasa para bacterias y agar Sabouraud para hongos,  utilizando Staphylococcus aureus (ATTC 6538P) ,  , Pseudomonas aeruginosa (ATTC 27653),  Enterobacter aerogenes (UC-1) y Candida albicans (UC-A) , , correspondientes a una concentración de 106 ufc/mL. En orificios de 7 μL de los mm de diámetro depositaron 100 fisiológico. extractos a ensayar se (4 mg/mL) en suero Las placas se incubaron a 37°C durante 24 h y se realizaron lecturas del diámetro del halo de inhibición del crecimiento microbiano utilizando un pie de metro que da una precision de ± 1 mm. El parámetro de selección fue un diámetro del halo de inhibición superior a 15 mm frente a los microorganismos. Se utilizaron como controles Amoxicilina (25 µg/mL) (Lab. Chile) y Caspofungina (5 µg/mL), (Lab. NeoSensitabs).

Parámetros de Selección de Extractos Se seleccionaron los mejores extractos con respecto a capacidad antioxidante y antimicrobiana  para incorporarlos en formulaciones cosméticas y estudiar su estabilidad en la formulación y capacidad de protección en los productos terminados. Los  parámetros fueron los siguientes:  100% de capacidad antioxidante frente a DPPH de extractos (6,0-0,6 μM) EAG que corresponden a concentraciones similares a antioxidantes sintéticos utilizados en formulaciones cosméticas, y un diámetro de halo de inhibición igual o superior a 15 mm frente a Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes  y Candida albicans de los extractos en una concentración de 4mg/L, que corresponde a la concentración máxima de parabenos permitida por la legislación chilena en productos cosméticos.  Forma Cosmética y Ensayos de Estabilidad Cuadro 1. Composicion de la Crema de limpieza O/W (Aceite/Agua) Ingredientes: Aceite Mineral 65/67 Cera de abeja Tween 40 Atlas G 1726 Extractos Agua destilada

Cantidad 50 g 7 g 2 g 8 g 4 g c.s.p 100 g

Aceite Mineral 65/67, es una mezcla de aceites minerales de baja viscosidad y media viscosidad. Atlas G 1726, corresponde a

Como controles se utilizó la misma fórmula sin  preservantes ni antioxidantes sintéticos sintéticos ni extractos, y otra utilizando metil y propil parabenos (0,015 g) y BHT (0,02 g).

Estabilidad de la Formulación en el Tiempo Se estudió la estabilidad desde el punto de vista físicoquímico, sensorial, rancidez y microbiológico  por un período de 6 meses. Paralelamente se estudiaron controles; formulaciones conteniendo  parabenos y antioxidantes sintéticos en las condiciones que a continuación se detallan y también formulaciones sin extractos, preservantes ni antioxidantes sintéticos. Estabilidad Físicoquímica y Sensorial Los productos se almacenaron por 6 meses en las siguientes condiciones:  Normales (N); luz natural, temperatura ambiente,  Luz (λ); exposición a la luz natural 5h/día, Oscuridad (O); estante cerrado, Frío (F); 4 ºC. En forma bisemanal se monitorearon las siguientes características físicoquímicas y sensoriales: color, textura, olor, pH, separación de fases y formación de precipitado. Rancidez (Índice de Peróxido) En matraz Erlenmeyer se agregó 500 mg de muestra y 160 μL de mezcla ácido acéticocloroformo (6+4) y se agitó hasta disolver la formulación, se agregó 50 μL de solución saturada de KI al 5% en metanol, dejando reposar por 10 min en lugar oscuro. Se agregó 5 mL de agua y 50 μL de almidón. El desarrollo de un color azul indica reacción positiva y la intensidad del mismo denota mayor o menor concentración peróxidos (Rondon et al., 2004). Esta reacción se de llevó acabo en forma  bisemanal por 6 meses.

Estabilidad Microbiológica En forma bisemanal y por 6 meses las cremas se inocularon en caldo de cultivo nutritivo, se incubaron a 37 ºC por 48 h y se observó si existía turbidez. En caso de observarse turbidez los productos se sembraron en agar tripticasa para el estudio de  bacterias y agar Sabouraud para el estudio de hongos. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h y se realizaron lecturas del diámetro del halo de inhibición del crecimiento microbiano.

PEG-20 Sorbitan Beeswax.

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Avello et al.

Extractos de A. chilensis chilensis y U. molinae como preservantes en productos cosméticos

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Este trabajo reporta en el potencial uso de extractos vegetales con alta capacidad antioxidante (100% de inhibición en DPPH a 6,0-0,6 μM EAG), y antimicrobiana (diámetro de halo de inhibición igual o superior a 15 mm con extractos a 4mg/L), como conservantes en productos cosméticos. Los extractos seleccionados e incorporados a los  productos cosméticos fueron lo siguientes: 1.Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con MeOH 100%, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII región de Chile, 2.-Extracto de hojas de  Aristotelia chilensis, obtenido con 60% EtOH-40% H2O, colectadas en marzo, 2006 en la VIII región de Chile, 3.-Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con 40% MeOH-60% H2O, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII región de Chile y 4.- Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con H2O 100%, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII región de Chile (Tabla 1). El contenido de fenoles totales de los extractos seleccionados se observa en la Tabla 1. Se observó un alto contenido de fenoles totales en el extracto hidroalcohólico de  Aristotelia chilensis, y fue aún mayor en el extracto hidroalcohólico de Ugni molinae, esto indica la naturaleza química de las moléculas fenólicas que contienen las hojas de estas especies. Este resultado no tiene relación con el

rendimiento de los extractos, que fue mayor en el extracto metanólico de Ugni molinae, simplemente los fenoles totales indican los compuestos fenólicos solubles en los solventes de extracción y no tiene relación con el rendimiento. Tampoco se observó variación en la capacidad antioxidante, puesto que todos los extractos desarrollaron un 100% de capacidad antioxidante en las concentraciones estudiadas (6,0-0,6 μM) EAG. Si hubo diferencia con respecto al diámetro del halo de inhibición de crecimiento bacteriano, por lo tanto este fue el  parámetro que condicionó la selección. El extracto de las hojas de la especie Ugni molinae colectadas en la VIII región en diciembre del 2005, fue el que obtuvo la mejor actividad antimicrobiana. De los productos elaborados, en ninguno se observó desarrollo bacteriano ni fúngico, y el índice de peróxido fue negativo, los productos mantuvieron sus propiedades físicoquímicas y sensoriales durante los 6 meses de observación en las condiciones ensayadas. En los controles que contenían parabenos y antioxidantes sintéticos, no se observaron cambios significativos en las propiedades estudiadas, durante los 6 meses. En los controles que no contenían extractos, parabenos ni antioxidantes sintéticos se observaron cambios en el color, olor y se desarrollaron bacterias ambientales (Tabla 2).

Tabla 1. Extractos seleccionados; características de extracción, contenido en fenoles totales, capacidad antioxidante y antimicrobiana.

Especie

Muestra  Especie (Mes Colecta / Región) 

Solvente extracción

U. molinae

MeOH 100%

6/1

(Dic / VIII)

MeOH 60%H2O 40% H2O 100% EtOH 60%H2O 40%

 A. chilensis

(Mar / VIII)

Fenoles Totales (M EAG) 

Halo de Inhibición (Ø 1 mm)

37,9

0,031

25 21 23 25

6/1

16,3

0,035

25 21 21 20

6/1 6/1

11,4 5,9

0,032 0,040

28 25 20 25 24 26 19 20

m/s

Rendimiento (%) 

Ps. Enter. St. Can 

m/s: relación masa-solvente; Fenoles totales (M EAG): Fenoles totales en concentración Molar equivalentes a ácido gálico; Bacterias: Ps.: Pseudomona aeruginosa. Enter.: Enterobacter aerogenes. St.: Staphylococcus aureus. Hongos: Can: Candida albicans; Rendimiento (%) Gramos de extracto por 100 g de planta seca

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La eficacia como preservantes y antioxidantes de los extractos seleccionados abre una nueva  perspectiva no sólo a la industria cosmética, sino a toda aquella que requiera de preservantes y antioxidantes de origen vegetal. La coloración característica de cada extracto seleccionado, en un futuro puede ser modificada, sin alterar sus

un requisito para la venta al público de una formulación cosmética es ausencia absoluta de  patógenos. La actividad microbiológica observada es determinante, puesto que los agentes microbiológicos expuestos a los extractos son altamente patógenos, sobre todo Pseudomona aeruginosa, que es un microorganismo que crece en condiciones adversas,

 propiedadesen desarrollar antioxidantes y antimicrobianas,  pensando materias primas que no afecten la fórmula final. La capacidad antioxidante no fue determinante en la selección de extractos a incorporarlos en las formulaciones, puesto que, todos los extractos mostraron una capacidad del 100%, por lo tanto, la selección se basó en los estudios microbiológicos. Los microorganismos fueron seleccionados debido a la resistencia antibiótica que han desarrollado a través del tiempo y a las infecciones intrahospitalarias que causan, pero sobre todo porque

siendo difícil el inhibir su desarrollo. Los extractosmuy seleccionados mostraron una actividad antimicrobiana equivalente a un halo de inhibición superior a 20 mm. La actividad de los extractos seleccionados frente a Candida albicans, muestran una potente actividad antifúngica, resultado que enriquece las posibilidades de los extractos seleccionados como antimicrobianos. Estas propiedades biológicas se deben  principalmente a la composición fenólica de los extractos estudiados (Avello et al., 2008; 2008a).

Tabla 2. Estabilidad sensorial, físicoquímica físicoquímica y microbiológica de productos cosméticos, durante el período de estudio (6 meses, Jun a Dic). Producto

Condiciones Almacenamiento

Crema O/W Control Parabenos Antioxidante Sintético

 Normales Luz Oscuridad Frío  Normales Luz Oscuridad Frío  Normales Luz Oscuridad Frío  Normales Luz Oscuridad Frío  Normales Luz Oscuridad Frío  Normales Luz Oscuridad Frío

Crema O/W Control sin Parabenos ni Antioxidantes Sintéticos Crema O/W Extracto U. molinae  MeOH 100% Crema O/W Extracto U. molinae  MeOH 60%-H2O 40% Crema O/W Extracto U. molinae  H2O 100% Crema O/W Extracto A. chilensis chilensis  EtOH 60%H2O 40%

Parámetros Fisicoquímicos

Rancidez

Microbiológico

Negativo

Negativo

Estables Estables Estables Estables Estables

 Negativo

Contaminación Ambiental

Negativo

Negativo

Estables

Negativo

Negativo

Estables

Negativo

Negativo

Estables

Negativo

Negativo

c o t pH sf sf pp pp Estables

Δ  Δ  Δ  Δ 

Δ  Δ  Δ  Δ 

Parámetros Físicoquímicos: Δ: cambios; c : Color ; o: Olor; t : Textura; sf : Separación de Fases ; pp: Formación de Precipitado Precipitado

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La importante actividad antimicrobiana se  proyecta también a la industria farmacéutica, puesto que los antibacterianos convencionales presentan efectos adversos considerables, además la eficiente actividad frente a Pseudomona aeruginosa  es de especial interés, porque muchos enfermos crónicos (diabéticos) y otros afectados (quemados) desarrollan

REFERENCIAS Avello M, Pastene E. 2005. Actividad antioxidante de infusos de Ugni molinae  Turcz. (murtilla). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 4(2):33–39. Avello M, Valladares R, Ordóñez JL. 2008. Capacidad Capacidad

infecciones recurrentes con sintéticos. esta bacteria que es multiresistente a estos agentes Los extractos, según nuestro estudio, pueden clasificarse como antibacterianos de amplio espectro,  puesto que hipotéticamente, si se tuvieran que controlar estas bacterias en su conjunto, se deben combinar antibacterianos sintéticos o hemisintéticos específicos. En el caso de los extractos seleccionados evitarían el desarrollo y consecuencias de las cepas estudiadas. La fórmula escogida, es rica en materia lipídica, y agua, medios de cultivo para microorganismos y muy susceptibles a la oxidación. El estudio de estabilidad mostró la capacidad de los extractos para conservar la

chilensis (Molina) Stuntz. antioxidante de  Aristotelia Rev Cubana Plant Med 13(4).  Avello M, Valdivia R, Mondaca MA, Ordóñez JL, Bittner M, Becerra J. 2008a. Actividad de Ugni molinae  Turcz. frente a microorganismos de importancia clínica. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):141-144. Darbre PD, Aljarrah A, Miller WR, Coldham NG, Sauer MJ, Pope GS. 2004. Concentrations of paraben in human breast tumors. J Appl Toxicol T oxicol 24:5-13. Darbre PD. 2006. Environmental oestrogens, cosmetics and breast cancer. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 20(1):121-143. Fundación para la Innovación Agraria (FIA) Ministerio de Agricultura, Gobierno de Chile. 2003. Plantas

fórmula en diversas condiciones, siendo el extracto más potente el obtenido con 100% H 2O. Esto considera, también, aspectos ambientales, como por ejemplo, minimizar el uso de solventes. Los preservantes utilizados en formulaciones cosméticas, tomando como referencia los más cuestionados (parabenos), son de amplio espectro y su actividad antimicrobiana frente a estos agentes es comparable a la de los extractos seleccionados. Por lo tanto, los extractos de las especies en estudio son comparables a productos preservantes y antioxidantes comerciales para formulaciones cosméticas.

medicinales y aromáticas Santiago-Chile, pp. 13-38. evaluadas en Chile. FIA. Joyeux M, Mobstein A, Anton R, Mortier F. 1995. Comparative antilipoperoxidant antinecrotic and scavenging properties of terpenes and biflavones from ginkgo and some flavonoids. Planta Med 61:126-129. Ministerio de Agricultura, Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) Región del Bío-Bío. 2006. Avances en la multiplicación y caracterización de algunas plantas medicinales nativas. SAG. Santiago-Chile, pp. 79-87. Rondon E, Pacheco E, Ortega F. 2004. Estimación de la vida útil de un análogo comercial de mayonesa utilizando el factor de aceleración Q10.   Rev Fac Agron 21(1):68-83. Rubilar M, Pinelo M, Ihl M, Scheuermann E, Sineiro J,  Nuñez MJ. 2006. Murta leaves ( Ugni molinae Turcz.) as a source of antioxidant phenols. J Agr Food Chem 54:59-64. Schrickel S, Bittner M. 2001. La salud en nuestras manos.  plantas medicinales en chile, riqueza natural y científica. Editora y Gráfica Lamas, ConcepciónChile, pp. vii-viii. Singleton VL, Rossi JA. 1965. Colorimetry of total  phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. AJEV. 16: 144-158. Soni M, Carabin I, Burdock G. 2005. Safety assessment of esters of p-hydroxybenzoic acid (parabens). Food ChemToxicol 43:985-1015. Suwalsky M, Orellana P, Avello M, Villena F, Sotomayor C. 2006. Human erythrocytes are affected in vitro  by extracts of Ugni molinae  leaves. Food ChemToxicol 44:1393–1398. Suwalsky M, Orellana P, Avello M, Villena F. 2006a. Protective effect of Ugni molinae  Turcz against

CONCLUSIONES La Los extractos de hojas de Ugni molinae (obtenidos con MeOH 100%, 60%, y H 2O 100%) y de  Aristotelia chilensis  (obtenido con 60% EtOH) agregados como preservantes y antioxidantes mantuvieron las características sensoriales y fisicoquímicas de una formulación cosmética altamente lipídica demostrando su potencial como aditivos naturales de aplicación cosmética. AGRADECIMIENTOS Se agradece el financiamiento a la Dirección de Investigación (Proyecto Interno DIUC 207.074.038), a la Dirección de Post grado y al Proyecto a Anillo PBCT ADI-38, de la Universidad de Concepción. www.blacpma.org

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Avello et al.

Extractos de A. chilensis chilensis y U. molinae como preservantes en productos cosméticos

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© 2009 The Authors © 2009 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 8 (6), 487 - 497 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artículo Original | Original Article

 

Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation officinalis y sus efectos sobre la biotransformación de xenobióticos] [Propiedades antioxidantes de Rosmarinus officinalis

María E. LETELIER, Araceli TERÁN, Marcela A. BARRA, Paula ARACENA-PARKS    Laboratory of Pharma Pharmacology, cology, D Departmen epartmentt of Pharmacologic Pharmacological al and To Toxicologic xicological al Chemis Chemistry, try, Chemical Chemical and Pharmaceut Pharmaceutical ical Sciences Sciences School, School, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

Abstract  Rosmarinus officinalis (rosemary) extracts display antioxidant properties mainly due to the presence of polyphenols. These properties have yet to be systematically studied in biological systems. In this study, we used rat liver microsomes to evaluate the antioxidant capacity of a dry extract from rosemary leaves. Noteworthy, compounds occurring in herbal extracts are xenobiotics to animals, thus mainly biotransformed in the hepatic endoplasmic reticulum. Thus, we also studied the ability of this extract to inhibit different xenobiotics biotransformation pathways. The rosemary extract prevented all tested oxidative processes that were evaluated in rat liver microsomes. It also inhibited the activities of: 1) UDP-glucuronyltransferase; 2) microsomal GSHtransferase; and 3) cytochrome P450 system (N-demethylating activity). Our results indicate that herbal extracts, in addition to act as antioxidants, display a significant interaction with the metabolism of xenobiotics and/or endogenous compounds. Considerations about such interaction are discussed.

Keywords:  Rosmarinus officinalis; Rosemary; Herbal antioxidant; Cu2+/ascorbate; Oxidative stress; Cytochrome P450 system; UDP-glucuronyltransferase; GSH-transferase.

Resumen Extractos de  Rosmarinus officinalis  (romero) presentan propiedades antioxidantes debido, principalmente, a la presencia de polifenoles. Dichas  propiedades no han sido sistemáticamente estudiadas e studiadas en sistemas biológicos. En el presente estudio, utilizamos microsomas de hígado de rata para evaluar la actividad antioxidante de un extracto seco de hojas de romero. Cabe destacar que los compuestos presentes en preparados herbales son xenobióticos para los animales, por lo que son biotransformados principalmente en el retículo endoplásmico hepático. Por ello, también estudiamos la capacidad de este extracto  para inhibir diferentes vías de biotransformación de xenobióticos. El extracto de romero protegió todos los procesos oxidativos que fueron evaluados en microsomas hepáticos de rata. Éste también inhibió las actividades de: 1) UDP-glucuroniltransferasa; 2) GSH-transferasa microsómica; y 3) el sistema citocromo P450 (actividad N-desmetilante). Nuestros resultados indican que los extractos herbales, además de comportarse como antioxidantes, pueden interaccionar significativamente con el metabolismo de xenobióticos y/o compuestos endógenos. Consideraciones acerca de dicha interacción son sometidas a discusión. Palabras Clave:  Rosmarinus GSH-transferasa.

officinalis;  Romero;

Antioxidantes; Cu 2+/ascorbato; Estrés oxidativo; Sistema citocromo P450; UDP-glucuroniltransferasa;

ABBREVIATIONS: ABTS, 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzo 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate); thiazoline-6-sulfonate);   CYP450, cytochrome P450; DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; G-6-P, glucose—phosphate; GST, glutathione S-transferase; ROS, reactive oxygen species; UDPGT, UDP-glucuronyltransferase. Recibido  | Received: March 2, 2009.  Recibido 2009.  Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: May Version:  May 12, 2009.  Publicado en Línea | Published Online: Online: November  November 30, 2009.  2009.   Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. interests.   Financiación | Funding: This work was not financially supported This article must be cited as: María E. Letelier, Araceli Terán, Marcela A. Barra, Paula Aracena-Parks. 2009. Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation. Bol Latinoam Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):487 – 497. {EPub November 30, 2009}. 

*Contactos | Contacts: María Eugenia Letelier, M.Sc., Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, School of Chemical and Pharmaceutical Sciences, Universidad de Chile. Olivos 1007, Independencia, Santiago, Chile. Phone: 56-2-9782885. Fax: 56-2-9782912. 56-2-9782912. E-mail address: [email protected]

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Letelier et al.

Antioxidant properties and xenobiotic biotransformation of Rosmarinus officinalis officinalis 

INTRODUCTION All aerobic organisms generate reactive oxygen species (ROS) as part of highly regulated enzymes and as a by-product of oxygen metabolism. ROS, which include superoxide anion, hydroxyl radical, and hydrogen peroxide, are highly reactive such species capable to oxidize biological molecules, as lipids, proteins, and nucleic acids (Droge, 2002). Thus, several antioxidant mechanisms have evolved to prevent oxidative damage to cells. This antioxidant capacity includes non-enzymatic and enzymatic mechanisms (Benzie, 2000). GSH and vitamin E are classical examples of the non-enzymatic antioxidant mechanism, as these molecules act as free radical scavengers (Evstigneeva et al.,, 1998; Elias et al., 2008). The enzymatic antioxidant system of cells includes enzymes that catalyze the reduction of ROS, and include superoxide dismutase and catalase (Elias et al., 2008). GSH also plays a role in this system, as a cofactor of the GSH-peroxidase. When ROS generation overwhelms cell’s antioxidant capacity, oxidative stress is ensued. Oxidative stress can lead to cell damage and ultimately cell death (Halliwell and Gutteridge, 1988). During oxidative stress, some enzymes that are involved in drug metabolism, such as GSH-transferases (GSTs), can also act as antioxidants, through the metabolism of highly electrophilic and lipophilic compounds (van der Aar et al., 1996). In addition, some GSTs occurring in the endoplasmic reticulum also display peroxidase activity (Mosialou and Morgenstern, 1989). An increase in the expression of such enzymes has been also described during oxidative stress (Pinkus et al., 1996; Mari and Cederbaum, 2001). Increasing evidence has demonstrated that compounds occurring in plants have antioxidant capacity, mainly in virtue of their ability to scavenge free radicals (Masella et al., 2005). Systematic studies on the antioxidant capacity of total herbal extracts are missing. This is mainly due to the  purification of specific compounds from extracts and assessment of their free radical scavenging properties using synthetic radicals such as 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl (DPPH) y 2,2'-azinobis-(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) (Antolovich et al., 2002). Isolation of compounds from herbal extracts allows the study and understanding of the antioxidant properties of these specific substances. Such studies, however, may www.blacpma.org

overlook the potential synergy and/or additive antioxidant effects that the various molecules occurring in the whole extract exert through different mechanisms. On the other hand, synthetic free radicals are useful for the rapid screening of the antioxidant capacities of herbal extracts or isolated compounds. These free radicals display redox mechanisms are verywhich different of oxygen free that radicals, are from the those oxidants occurring in biological systems. Therefore, the use of such technique may not reflect a true biological antioxidant capacity of herbal compounds (Letelier et al., 2008). By definition, all herbal antioxidant substances are xenobiotics for mammals. Therefore, they are metabolized through the drug-metabolizing  pathways, occurring mainly in the endoplasmic reticulum of liver cells. The enzymatic systems of such pathways include the cytochrome P450 (CYP450) system (Kramer and Tracy, 2008), UDPglucuronyltransferase (UDPGT) (Tephly and Burchell, 1990), and microsomal GST (Rinaldi et al., 2002). Thus, all herbal antioxidant substances, depending on their physicochemical properties, are likely to behave as competitive inhibitors of these enzymatic systems with respect to their activity towards endogenous compounds and drugs.  Noteworthy, CYP450 is the main contributor of oxidative stress in the endoplasmic reticulum,  because it catalyzes the generation of highly electrophilic metabolites and also directly releases ROS when uncoupled (James et al., 2003; Shimada, 2006). Thus, herbal compounds may display and additional antioxidant mechanism by inhibiting CYP450 (Johnson, 2008).  Rosmarinus officinalis (rosemary) belongs to the  Lamiaceae  family, constituted by numerous medicinal plant species. Rosemary can be found in the Mediterranean basin of south Europe, north of Africa and southwest Asia. This plant is produced mainly in Spain, Tunisia, Morocco, and to a lesser extent, Portugal, Turkey and India. Rosemary can also be found in Chile, between the V and IX regions. Although mainly used as a condiment, several therapeutic actions are attributed to rosemary, including antimicrobial, antispasmodic, hypertensive and sedative activities (Simon et al., 1984). Antioxidant properties of plants are thought to be mainly due to polyphenols occurring in all herbal extracts (i.e.  flavonoids, flavones, flavonols, anthocyanines, etc.) that are scavengers of ROS

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Letelier et al.

Antioxidant properties and xenobiotic biotransformation of Rosmarinus officinalis officinalis 

(Middleton et al., 2000). Alcoholic extracts from rosemary leaves, stems and flowers display antioxidant properties (Pathak et al., 1991; Cañigueral et al., 1998). These extracts are enriched in polyphenols, such as carnosol, rosmanol, carnosic acid, and rosmarinic acid (del Bano et al, 2003; Moreno et al, 2006). In the present study, first evaluated the antioxidant properties of a we dry extract of rosemary leaves, in terms of protecting rat liver microsomes lipids, thiol-containing proteins, and UDPGT activity from damage induced by Cu2+/ascorbate, a ROS generating system. We compared the biological antioxidant activity of this extract with its free radical scavenging activity using DPPH. In addition, we evaluated the potential inhibitory effect of this extract on the activities of the CYP450 system, UDPGT, and microsomal GST. When evaluated separately, the rosemary extract behaved as an antioxidant and as an inhibitor of the tested enzymatic activities. When evaluated simultaneously, however, we found that the extract displayed a lower inhibitory effect, giving  precedence to its antioxidant activity. The significance of these results on the potential toxicity of herbal extracts through the inhibition they exert on drug-metabolizing enzymes is discussed.

Animals Adult male Sprague Dawley rats (200-250 g), maintained at the vivarium of the School of Chemical and Pharmaceutical Sciences (Universidad de Chile, Santiago, Chile) were used. Rats were allowed free access to pelleted food, maintained with controlled temperature (22ºC) and photoperiod (lights on from 07:00 to 19:00 h). All procedures were performed using protocols approved by the Institutional Ethical Committee of the School of Chemical and Pharmaceutical Sciences, Universidad de Chile, and according to the guidelines of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NRC, USA).

Chemicals 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), GSH,  p-Nitrophenol (PNP), UDP-glucuronic acid (UDPGA),  p- Nitroanisole  Nitroanisole (PNA), Aminopyrine,  NADP, glucose-6-phosph glucose-6-phosphate ate (G-6-P), glucose-6-

Isolation of rat liver microsomes Microsomal fraction was prepared according to Letelier et al. (2005). Rats were fasted for 15 h with water ad libitum, and sacrificed by decapitation. Livers were perfused in situ with 4 volumes of 25 ml 0.9 % W/V NaCl, excised, and placed on ice. All homogenization and fractionation procedures were  performed at 4ºC and all centrifugations were  performed using either a Suprafuge 22 Heraeus centrifuge or an XL-90 Beckmann ultracentrifuge. Liver tissue (9 -11 g wet weight), devoid of connective and vascular tissue, was homogenized with five volumes of 0.154 M KCl, with eight strokes in a Dounce Wheaton B homogenizer. Homogenates were centrifuged at 9,000xg for 15 min and sediments were discarded. Supernatants were then centrifuged at 105,000xg for 60 min. Pellets (microsomes) were stored at -80ºC until use. Protein determinations were performed according to Lowry et al. (1951).

 phosphate dehydrogenase, albumin (Fraction IV) were Tris-HCl, purchased and from bovine Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Trichloroacetic acid (TCA), thiobarbituric acid (TBA), sodium ascorbate, FeCl3, CuSO4, MgCl2, and FolinCiocalteu’s reagent were purchased from Merck Co. Chile. 1-chloro-2,4-dinitrobenzene was purchased from ACROS Organics (New Jersey, NJ, USA). Other chemicals were of analytical grade. Dry extract of Rosmarinus officinalis officinalis leaves (vegetable drug) was graciously provided by Laboratorios Ximena Polanco (Santiago, Chile), along with proprietary information regarding yield. Stocks of this dry extract (0.2 to 1 mg/mL) were prepared in a mixture of water: ethanol

Determination of polyphenols Polyphenols were determined by the method described by Letelier et al. (2008). Fifty μL herbal extract were mixed with 250 μL Folin Ciocalteau reagent, 750 μL 20% w/v sodium carbonate and distilled water to a final volume of 5 mL. Blanks contained all reagents other than herbal extract. Reaction mixtures were then incubated for 2 h  protected from light. Afterwards, the absorbance of the samples was determined at 760 nm in a UV3 Unicam UV–VIS spectrophotometer, using their respective blanks as reference. Catechin, a  polyphenol compound, was used as a reference

MATERIAL AND METHODS

(1:1) the same day of the experiments. www.blacpma.org

μ standard. rosemary Results extract. were expressed as nmol catechin/ g

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Letelier et al.

Antioxidant properties and xenobiotic biotransformation of Rosmarinus officinalis officinalis 

Determination of DPPH bleaching activity This assay was determined according to Letelier et al. (2008). In a final volume of 1 mL, increasing concentrations  of rosemary extract were mixed with 20 μg/mL of DPPH. Fresh DPPH stock solutions were prepared in ethanol. Blanks contained herbal extract and vehicle. DPPH bleaching activity of all mixtures was recorded continuously at 37 ºC for 20 min at 517 nm in a UV3 Unicam UV-VIS Spectrophotometer. Reaction rates were determined in conditions where product formation was linearly dependent with time. Microsomal lipid peroxidation assay The extent of lipid peroxidation following pretreatment of microsomes with Cu2+/ascorbate was estimated assaying thiobarbituric acid reactive species (TBARS), according to Letelier et al. (2005). Mixtures (1 mL final volume) contained 1 mg/mL microsomal protein, 25 nM CuSO4, 1 mM sodium ascorbate inall50the mMreagents phosphate pH 7.4.protein. Blanks contained butbuffer, microsomal Blanks and samples were incubated for 20 min at 37°C with constant agitation. TBARS were calculated using the ε532=156/mM/cm and expressed as Data are presented as nmol TBARS/min/mg  protein. Determination of microsomal thiol content Thiol groups were titrated with DTNB as described by Letelier et al. (2005). Microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with 25 ηM CuSO4, 1 mM sodium ascorbate in 50 mM phosphate buffer,  pH 7.4. Blanks contained all reagents but microsomal  protein. Blanks and samples incubated for 30 min at 37 °C with constant were agitation. Afterwards, microsomal thiol content was titrated with 0.6 mM DTNB. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate prior determination of the microsomal thiol content. Thiol concentration was estimated on the basis of the equimolar apparition of 5-thio-2-nitrobenzoic acid (ε410=13,600/M/cm) and is  presented as nmol thiols/min/mg thiols/min/mg protein. Assay of UDPGT activity  p-nitrophenol conjugation with UDPGA, reaction catalyzed by UDPGT was assayed according to Letelier et al. (2007). Activity was assayed by www.blacpma.org

determining the remaining  p-nitrophenol after 15 min incubation of microsomes (2 mg protein/mL) in the following conditions: 0.5 mM  p-nitrophenol, 2 mM UDPGA, 4 mM MgCl2, in 100 mM Tris-HCl buffer,  pH 8.5. Blanks were assayed in the absence of UDPGA. Reactions were stopped by addition of TCA to 5% (W/V) final concentration; samples were then g centrifuged at 10,000 10 min in awere Suprafuge 22 Heraeus centrifuge and for supernatants collected.  NaOH was added to the supernatants to final 0.5 M. Reaction rates were determined in conditions where  product formation was linearly-dependent linearly-dependent to time and  protein concentration. To calculate UDPGT activity, a standard curve of  p-nitrophenol was generated. To evaluate the antioxidant effect of herbal extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated 5 min with this extract and then 20 min with Cu 2+/ascorbate  before determining UDPGT activity. Data are  presented as nmol conjugate/min/mg conjugate/min/mg protein.

Assay of GST activity Conjugation of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, reaction catalyzed by GST, was assayed according Letelier et al.(2006). The reaction mixture contained 0.1 mg/mL microsomal protein, 1 mM 1-chloro-2,4dinitrobenzene, and 4 mM GSH in 100 mM  phosphate buffer, pH 6.5. Blanks were assayed in the absence of GSH. Apparition of the conjugated  product was continuously recorded for 3 min at 25ºC, at 340 nm in a UV3 Unicam UV-VIS spectrophotometer. To calculate GST activity, the ε340=9.6 mM/cm of the conjugate was used. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate before determining GST activity. Data are presented as µmol µ mol conjugate/min/mg prot protein. ein. Assay of the CYP450 system activity Activity of the CYP450 system was assayed as the  N -demethylating -demethylating activity on Aminopyrine, according to Letelier et al. (1985). The reaction mixture contained microsomes (1 mg protein/mL), 5 mM aminopyrine, 3.5 mM MgCl2, 0.1 M G-6-P, 10 mM  NADP, 5 Units/mL G-6-P dehydrogenase, in 35 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0. Blank contained all reagents  but G-6-P dehydrogenase. All mixtures were incubated for 15 min at 37 ºC. Reactions were stopped by addition TCA then to 5%centrifuged (W/V) final concentration; samplesof were at 10,000g  for 10 min in a Suprafuge 22 Heraeus

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centrifuge and supernatants were collected. To develop the colorimetric reaction, 0.5 mL of a mixture of 0.1 mL of 2,4-pentanodione and 25 mL of 4 M ammonium acetate was added to 1 mL of supernatant and mixtures were incubated for 2 h  protected from light. Absorbance of samples was then determined at 400 nm in a UV3 Unicam UV–  VIS spectrophotometer, using their blanks  N-demethylating as reference. To calculate the respective activity of the CYP450 system, a standard curve of formaldehyde was generated. Reaction rates were determined in conditions where product formation was linearly-dependent to time and protein concentration. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate before determining this activity. Generation of the CYP450 monooxygenase spectrum CYP450 monooxygenase spectrum was obtained according to Omura and Sato (Omura and Sato, 1964). This method uses the ability of the carbon monoxide to coordinate with the heme group of the monooxygenase; the resulting conjugate has a peak of maximum absorbance at 450 nm ( ε=91/mM/cm. The reaction mixture (blank and sample) contained 1 mg/mL microsomal protein, 5 mM sodium dithionite and 50 mM phosphate buffer, pH 7.4. The spectrum was generated following addition of carbon monoxide to the sample in a UV3 Unicam UV–VIS spectrophotometer. To assess the possible interaction of compounds occurring in the rosemary extract with the CYP450 monooxygenase, 28 µg of extract were added to microsomes prior or after the addition of sodium dithionite. A decrease in the absorbance at 450 nm of the CYP450 monooxygenase when incubated with the rosemary extract was interpreted as an interaction. Statistical analysis Data presented correspond to the mean of at least 4 independent experiments ± SEM. Statistical significance (ANOVA) and regression analyses were  performed using Graph Pad Prism 5.0. Differences were considered as significant when p4) of DPPH in ΔAbs517/20min in a semi-logarithmic scale against the extract concentration. The IC50 value was calculated from the dose-response inhibition regression using the log [extract] (r=0.983).

As expected, the rosemary extract used in our study displayed antioxidant capacity as measured by the DPPH method. In our experience, this antioxidant capacity must be validated systems to allow conclusion regardingwith thebiological overall antioxidant  properties of any herbal extract (Letelier et al., 2008).

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For this purpose, we used rat liver microsomes as a  biological system and Cu2+/ascorbate as a ROS generating system. We tested the antioxidant capacity of the rosemary extract, as its ability to prevent several oxidative consequences of ROS generation by the Cu2+/ascorbate system: 1) lipid and thiol oxidation, 2) oxidative activation of UDPGT activity,

reflected in functional changes. Thus, titration of thiol groups in biological samples can be used as a marker for oxidative damage in proteins. Incubation of microsomes with Cu2+/ascorbate decreased the microsomal thiol content from 28.4 ± 0.12 to 19.4 ± 0.23 nmol thiol/mg protein (about 30%, n=4). As shown in Fig. 3, pre-incubation with the rosemary

and 3) oxidative changes on the CYP450 monooxygenase.

extract thiolanloss a linear-dependent manner prevented (r=0.994),thewith IC50in  value of 13.05 µg extract/mg protein.

 Effect of rosemary extract on microsomal lipid  peroxidation 

Incubation of rat liver microsomes with 2+ Cu /ascorbate led to the generation of 2.36 ± 0.018 nmol TBARS/min/mg protein (n=4). As depicted in Fig. 2, pre-incubation of microsomes with rosemary extract prevented this lipoperoxidative effect in a linear-dependent manner (r=0.999), with an IC50  value of 5.63 μg extract/mg protein.

Figure 3. Effect of the rosemary extract on the microsomal thiol content loss elicited by Cu2+/ascorbate.

Figure 2. Effect of the rosemary extract on microsomal lipid  peroxidation elicited by Cu2+/ascorbate.

Microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; thiol groups were titrated with DTNB according to Material and Methods. Data are presented as % residual thiols using untreated microsomes as control (28.4 ± 0.12 nmol thiol/mg protein, n=4) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. The IC50 value was obtained from the linear regression of the data (r=0.994).

 Effect of rosemary extract on the oxidative  damage of CYP450 CYP450 monooxygenase 

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; lipid peroxidation was assayed as TBARS generation, as described in Materials and Methods. Data are presented as % lipid peroxidation using untreated microsomes as control (2.36 ± 0.018 nmol TBARS/min/mg protein, n=4) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. The IC50 value was obtained from the linear regression of the data (r=0.999).  Effect of rosemary extract on microsomal thiol  oxidation 

Thiol groups occurring in the lateral chain of  proteins are reactive to oxidation by ROS, likely leading to structural changes in proteins that are www.blacpma.org

The Cu2+/ascorbate system causes conformational changes on the CYP450 monooxygenase, which are reflected as a loss in the characteristic absorbance at 450 nm of the protein conjugate with carbon monoxide (see Materials and Methods). As shown in Fig. 4, Cu2+/ascorbate led to a progressive loss of this absorbance in time, effect that was completely abolished when pre-incubating microsomes with the rosemary extract.

 Effect of rosemary extract on the oxidative  activation of the UDPGT UDPGT activity 

UDPGT is a microsomal enzyme that becomes activated by the Cu2+/ascorbate system (Letelier et al., 2007). Indeed, incubation of microsomes with

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this system elicited the increase in the UDPGT activity, in terms of  p-Nitrophenol conjugation, from 12.57 ± 0.30 to 26.6 ± 0.16 nmol conjugate/min/mg  protein (~2-fold, n=4). As depicted in Fig. 5, preincubation of microsomes with low concentrations of rosemary extract (up to 28 µg extract/mg protein)  prevented the UDPGT activation in a concentrationdependent higher concentrations manner. of rosemary Remarkably, extract (56 and 112 µg extract/mg protein) elicited inhibition of the UDPGT activity compared with the untreated control without Cu2+/ascorbate. This is suggestive of additional nonoxidative mechanisms taking place under the conditions tested. It is possible that the polyphenols occurring in the rosemary extract may be inhibiting this enzymatic activity by competing with its substrate  p-nitrophenol. In agreement to this  postulate, pre-incubation of microsomes with increasing concentrations of rosemary extract, in the absence of Cu2+/ascorbate, inhibited the conjugation of  p-nitrophenol in a linear-dependent manner (r=0.999), as shown in Fig. 6. Figure 4. Effect of the rosemary extract on the changes of UDPGT activity elicited by Cu2+/ascorbate.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; UDPGT activity was assayed using p-Nitrophenol as substrate and UDPGA, as detailed in Materials and Methods. Data are presented as fold UDPGT activity change in a semi-logarithmic plot, using untreated microsomes as control (12.57 ± 0.30 nmol conjugate/min/mg  protein, n=4, dotted line) and represent the mean ± SEM SEM of at least 4 independent experiments. The solid line depicts the doseresponse inhibition regression using the log [extract] (r=0.998).

Figure 5. Effect of the rosemary extract on the CYP450 monooxygenase content loss elicited by Cu 2+/ascorbate.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; CYP450 monooxygenase content was assayed as described in Materials and Methods. Data are  presented as a time plot of the % residual CYP450 monooxygenase content using the initial Abs450 as 100%, and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. Closed circles: control (without incubation with rosemary extract) and closed squares: microsomes pre-incubated with rosemary extract. Figure 6. Effect 6. Effect of the rosemary extract on UDPGT activity.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract and UDPGT activity was assayed using p-Nitrophenol as substrate and UDPGA, according to Materials and Methods. Data are presented as % residual UDPGT activity using untreated microsomes as control (12.57 ± 0.30 nmol conjugate/min/mg protein, n=4) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. The solid line depicts the linear regression of the data (r=0.999).

Effects of  Rosmarinus officinalis  on the drugmetabolism pathway The inhibition of UDPGT activity when microsomes are pre-incubated with rosemary extract www.blacpma.org

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in the absence of Cu 2+/ascorbate (Fig. 6) is in agreement with the idea that polyphenols from this extract may behave as xenobiotic compounds. As such, they would be a substrate of drug-metabolizing enzymes occurring in rat liver microsomes, including UDPGT, explaining the inhibitory effect on the conjugation of  p-nitrophenol. If this postulate is

Figure 7. Effect of the rosemary extract on microsomal GST activity.

correct, then rosemary should also behave as an inhibitor of other extract drug-metabolizing enzymes, decreasing the activities of GST and/or the CYP450 system. Therefore, we studied the effect of the rosemary extract on: 1) the conjugation of 1-chloro2,4-dinitrobenzene with GSH, reaction catalyzed by GST, and 2)  N -demethylation -demethylation of aminopyrine reaction catalyzed by the CYP450 system.  Effect of rosemary extract extract on GST activity 

GST isoenzymes, along with UDPGT, catalyze reactions of conjugation of xenobiotics (Phase II). GSTs catalyze the conjugation of lipophilic and highly electrophilic compounds with GSH. We assayed the microsomal GST activity using 1-chloro2,4-dinitrobenzene as a substrate, with a control value of 1.12 ± 0.003 µmol conjugate/min/mg protein (n=4). As shown in Fig. 7, re-incubation of microsomes with increasing concentrations of rosemary extract led to inhibition of microsomal GST activity, in a concentration-dependent manner. These data are in agreement with the rosemary extract  potentially behaving as a competitor of the conjugation of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene with GSH  by microsomal GST.  Effect of the rosemary extract on the N demethylation of Aminopyrine by the CYP450  system

The CYP450 system catalyzes the oxidation of lipophilic compounds (Phase I). We assayed the  Ndemethylation activity of the CYP450 on Aminopyrine, and obtained a control value of 39.02 ± 0.53 nmol product/min/mg protein (n=8). As depicted in Fig. 8, pre-incubation of microsomes with rosemary extract slightly inhibited this activity. As observed with GST, these data are in agreement with the idea that the rosemary extract may act as a competitor of the CYP450 system metabolism.

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Rat liver microsomes (0.1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract and GST activity was assayed using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene as substrate and GSH, according to Materials and Methods. Data are  presentedand as represent residual GST activity (in µmol  protein) the mean ± SEM of at atconjugate/min/mg least 4 independent experiments. * p