Quintero 1981

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Prefacio

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Ca Primera edición, 1981 Primera reimpresión, 1987 ©

EDITORIAL ALHAMBRA MEXICANA. S.A. de C.V. Amores 2027 03100 México, D.F.

CNIEM 1031 Reservados todos los derechos. Ni la totalidad, ni parte de esta publicación pueden reproducirse, registrarse o transmirtirse, por un sistema de recuperación de información, en ninguna forma ni por ningún medio, sea electrónico., mecánico, fotoquímico, magnético o electroóptico. por fotocopia, grabación o cualquier otro, sin permiso previo por escrito del editor

ISBN 968 444 017 0 ESPAÑA: 28001 Madrid. Claudio Coello. 76

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Representantes:

33006 Oviedo. Librería Lord Book Baldomero Fernández. 7

07010 Palma de Mallorca. D. Francisco Molina Francisco Suau, 14 Composición tipográfica y formación: Redacta. S.A. Cubierta: DiseftoiFlora Asúnsolo Dibujo: Laura Almeida

impreso en México

— Printed in Mexico

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La creciente demanda de alimentos, medicinas y otros bienes de consumo ha dado origen a nuevas áreas de investigación y docencia, que por su carácter multidisciplinario plantean la necesidad de nuevos enfoques y criterios y, por consiguiente, la preparación de textos y material basados en la síntesis de diver¬ sas disciplinas. De manera especial, la producción de alimentos y la utilización de los recursos naturales renovables han adquirido gran importancia tanto en el campo de la ciencia como económica y socialmente, ya que los logros y avances en estas áreas tienen un efecto directo y en ocasiones inmediato en los diferentes grupos de la población. Desde un punto de vista tecnológico, para un país con las condiciones socio¬ económicas de México (abundancia de mano de obra y recursos limitados de capital), el problema de producción de alimentos y de utilización de recursos naturales renovables puede ser atacado empleando técnicas y métodos microbiológicos. Sin embargo, para realizar lo anterior es necesario preparar al grupo científico y técnico que los pueda desarrollar, y en esa preparación la ingeniería bioquímica es un elemento importante que debe difundirse más y más en los ámbitos académico y científico. El presente estudio está basado en las conferencias y notas del curso "Bio¬ tecnología industrial", que se impartió en agosto de 1974 en el Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIB), de la Universidad Nacional Autónoma de México, y constituye un panorama general del campo de actividades y de las aplicaciones de la ingeniería bioquímica, también denominada biotecnología. Por ser ésta una disciplina de reciente formación, producto de la fusión de la bioquímica, la genética, la ingeniería química y la microbiología aplicadas a la producción y utilización de los microorganismos y de sus productos, no pre¬ tende abarcar todos y cada uno de los aspectos importantes de su estudio. En el mencionado curso se cubrieron los aspectos básicos de genética, inge-

m

G0374

1 niería y microbiología, haciendo especial hincapié en su aplicación a la fermen¬ tación industrial. En los capítulos que siguen se analizan en particular los ele¬ mentos que deben intervenir, cualitativa y cuantitativamente, para que los resul¬ tados de las fermentaciones sean óptimos y se señalan los problemas prácticos y teóricos que hoy en día requieren de investigación y desarrollo tecnológico. Aun cuando el enfoque es general, se pone énfasis en lo referente a la ingeniería, por lo que, en los casos adecuados, se desarrollan las correlaciones empíricas o los modelos matemáticos que describen los sistemas biológicos y los fenómenos asociados. Se cubren, además, aspectos teóricos, prácticos y económicos sobre formulación de medios de cultivo, esterilización, diseño de reactores, escala¬ miento de fermentaciones, procesos de separación, etc. De manera particular, se revisan los procesos de producción de proteína microbiana y la tecnología enzimática. El material y el método de interpretación presentados serán de utilidad para aquellos que están directamente involucrados en la investigación bioquímica y microbiológica, y para quienes realizan la explotación comercial de los pro¬ cesos de fermentación. El conocimiento adecuado de las características y posi¬ bilidades de los sistemas biológicos que nos brinda la ingeniería bioquímica, ayudará a resolver de una manera más racional y menos violenta los problemas primarios que aquejan a nuestra sociedad. La realización de este estudio fue posible gracias a la cooperación de varias personas e instituciones. Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología la ayuda económica que proporcionó, tanto para el desarrollo del curso, como para la realización de mis estudios de posgrado en el área de fermentación, y al 1IB por su amplia colaboración para que el curso se llevara a cabo, y por su decidido apoyo para integrar un grupo de investigación en biotecnología. Especial mención merece la Organización de los Estados Americanos, a través de cuyo Departamento de Asuntos Científicos se obtuvo el financiamiento para la elaboración de este trabajo. Gracias al M. en C. Luis Cabello, de la Universidad de Manchester, quien cooperó desinteresadamente en el desarrollo de los pro¬ gramas de computadoras utilizados, y cuyas atinadas sugerencias fueron de gran valor. Finalmente, mi agradecimiento a la Ing. Bioquím. Hermelinda Carbajal, por su extraordinaria labor en la revisión técnica de la obra, durante todo el proceso de edición.

R.Q.R.

Indice general BIBLIOTECA

7

Prefacio

15 15 17

1 Introducción Desarrollo histórico Proceso de la fermentación Microorganismos en la fermentación Productos de la fermentación Literatura sobre fermentación

19 21 22 26

Referencias 2 Crecimiento microbiano Medio de cultivo Metabolismo microbiano Fases del crecimiento Ecuación de Monod

27 27 28 29 30 31

Concentración celular Nomenclatura Referencias

37 37

3 Cinética de fermentaciones Cinética de diversos tipos de fermentaciones Modelos cinéticos de crecimiento celular Modelos para formación de producto

Nomenclatura Referencias

39 39

43 50

ÿ3

54

4 Cultivo continuo

Clasificación de los sistemas de cultivo continuo

m

57 58

10

Indice general

Indice general

Prerrequisitos de operación y técnicas Teoría del quimiostato Velocidad específica de crecimiento Productividad Comparación de productividades entre los sistemas batch y continuo Limitaciones de la teoría del quimiostato Variación del rendimiento y energía de mantenimiento Efecto de la temperatura en cultivo continuo Diferentes expresiones para /x Limitación por oxígeno Usos del cultivo continuo Quimiostatos en serie

Nomenclatura Referencias

5 Transferencia de oxígeno y diseño de fermentadores Teorías de la transferencia de masa Correlaciones para estimar kLa Diseño de fermentadores Mezclado y patrones de flujo Tipo de reactor

Configuración geométrica Transferencia de calor en un fermentador Transferencia de oxígeno y consumo de energía Nuevos diseños Nomenclatura Referencias

59

60 61 64

!

65 67 68

72 72

72 74 75

77 78

81 84

85 87 87

88 89 90 91 93 95

95

97 98 99

6 Escalamiento de fermentaciones Control ambiental Criterios de escalamiento Desarrollo histórico Uso del kLa como criterio de escalamiento Otros problemas de escalamiento Método de traslación de operación a la misma escala Ejemplos detallados de escalamiento A. Escalamiento de un tanque agitado B. Escalamiento de la fermentación de ácido glutámico C. Escalamiento de biomasa producida a partir de H-parafinas Nomenclatura Referencias

111 113 113

7 Métodos de esterilización del medio de cultivo y del aire Esterilización del medio Mortalidad térmica de los microorganismos Ley logarítmica de mortalidad Expresiones para la tasa de esterilización

115 115 116 116 117

103 105

106 106 109 110 111

«

Efecto de la temperatura en la constante de velocidad de esterilización, k Diseño de esterilizadores batch o de lote Diseño de esterilizadores continuos Efecto combinado de calor y álcali Limpieza y esterilización del aire Tipos de filtros Mecanismos de filtración Métodos de diseño Nomenclatura Referencias 8 Procesos de separación y purificación Separación mecánica de las células e insolubles del caldo de fermentación Ruptura de las células

. Extracción Procedimientos de fraccionamiento preliminar Etapas de alta resolución Utilización de membranas

Intercambio iónico Cromatografía Secuencia de operaciones Teoría y diseño de los principales procesos de separación y purificación Centrifugación Filtración

Precipitación con sulfato de amonio Ultrafiltración Cromatografía de filtración por gel Interacción de los procesos de fermentación y de separación Nomenclatura Referencias 9 Proteína unicelular Aspectos generales Microorganismos utilizados Contenido proteico de las células Perfil de aminoácidos (aminograma) Velocidad de crecimiento para un sustrato determinado

Toxicidad Valor calorífico Eficiencia de conversión del sustrato Digestibilidad Seguridad del producto Sustratos empleados

Precio

11

118 120

121 122 123 125

125 128 130 131 133 134 135 136 136 137 137 138 139 139 139 139

142 145 147 147 148 149

150 153 153

156 156 157

157 157 157 157 158 158

159 1 60

12

Disponibilidad y abundancia Toxicidad Eficiencia de conversión Pretratamiento del sustrato Condiciones de fermentación

160 160 161 161 161 162 162 163 163 167 171 172 173

..... ;

Temperatura pH Productividad Procesos de producción de proteína unicelular Análisis económico Desarrollo futuro Nomenclatura Referencias

10 Producción de proteína microbiana a partir de la caña de azúcar y sus subproductos Azúcar Mieles Bagazo Hidrólisis ácida Hidrólisis enzimática Fermentación directa Análisis económico Nomenclatura

Referencias 11 Tecnología enzimática Enzimas inmovilizadas Métodos de inmovilización Nomenclatura Referencias

223

223 224 224 225 227 227 227 228 230 231

Método B Nomenclatura Referencias B Cinética enzimática Introducción Efecto del tiempo en la actividad enzimática

.*

247

C

195 195 196 218 220

Balance de materia y energía en fermentación

236 236 240 246 246 246

Nomenclatura Referencias Tratamiento de aguas por métodos biológicos Parámetros de medición Tratamiento preliminar Tratamiento primario Tratamiento secundario Lagunas de oxidación Filtros biológicos Lodos activados Tratamiento terciario Características generales de la oxidación biológica Modelos matemáticos y sistema de diseño Otros usos de los lodos activados Tanques y equipo utilizados en lodos activados Avances tecnológicos en el tratamiento secundario Nomenclatura Referencias D Consumo de energía por agitación y aeración en sistemas de fermentación Consideraciones teóricas Potencia absorbida en fluidos sin aeración Potencia absorbida en fluidos con aeración Potencia necesaria para agitar líquidos no newtonianos Energía transmitida de la fase gaseosa al líquido . , Nomenclatura Referencias E

233 233 233

Referencias

J.

248 250 250 250 251 251 252 252 252 253 261 263 264 266 267

.... .

Determinación experimental de la transferencia de oxígeno en una fermentación Medición indirecta Oxidación de sulfito Técnica de eliminación de gas Medición directa Balance de oxígeno en el sistema Técnica dinámica (régimen no estacionario) Tiempo de respuesta Nomenclatura

J

234 234 234

Inhibición Otros factores que afectan la actividad enzimática

1 75 176 176 179 181 186 190 190 192 192

Rendimiento del sustrato (Ys) Fuente de carbono Fuente de nitrógeno Fuente de otros nutrientes Rendimiento de oxígeno (Y0) Rendimiento calorífico (Ykcaj) Método A

Efecto de la temperatura en la actividad enzimática y en la actividad inicial Efecto de la temperatura en la estabilidad de las enzimas Efecto del pH en la actividad enzimática Efecto de la concentración del sustrato en la actividad enzimática Modelo sin inhibición

11

Apéndices A

'

Indice generoI

Indico genero!

269 270

272 274 276 277 279

279 281 282 283 283 284 284 286 288

292

Indice general

14

F

Métodos de inmovilización enzimática Vía grupo dia/.onio de grupos amino aromáticos Vía grupo isotiocianato por tratamiento de grupos con tiofosgeno Vía grupo acil-azida por tratamiento de hidrazina con ácido nitroso Vía grupo imido carbonato por reacción con bromuro de cianógeno con grupos hidroxilo Vía grupo cloruro activo Vía grupo ácido carboxílico activado con N,N,diciclo

hexilcarbodimida

293 294 295 296

...... ...... 297 298

Vía grupo ácido carboxílico activado con el reactivo K de

Woodward

.

ÿ

299 299 300 300

Vía copolímero de etileno y anhídrido maleico Activación de soportes por la reacción de Ugi Activación de soportes por sales de metales de transición Vía grupo carbonatos cíclicos introducidos por la reacción de cloroformato de etilo con grupos hidroxilo .\ Vía floruro de arilo Vía grupo bromuro de alquiló >,• Vía grupo ácido carboxílico activado con sulfonato de 1-ciclohexil 3-(2-morfolinoetil)-carboimida meto-p-tolueno Referencias

......

301 302

mm E. S. € Q.

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ÿ

302 302

305 305 305 306 307 309 310 311

Problemas Introducción Crecimiento microbiano Cinética de fermentaciones Cultivo continuo Transferencia de masa Escalamiento de fermentaciones Métodos de esterilización del medio de cultivo y del aire Procesos de separación y purificación Proteína unicelular. Aspectos generales Proteína microbiana a partir de la caña de azúcar y sus subproductos Tecnología enzimática Balance de materia y energía en fermentación Cinética enzimática Tratamiento de aguas por métodos biológicos Consumo de energía por agitación y aeración en sistemas de fermentación Determinación experimental de la transferencia de oxígeno en

¿iÉ!]

Introducción

301

-

G

i

297

313 314 315

317 318

..

319 320

323

una fermentación Métodos de inmovilización enzimática

324

Indice analítico

327

326

El cultivo de microorganismos, tanto en el laboratorio como en la industria, ha sido tratado más como un arte que como una ciencia, y a menudo empleando la intuición en lugar de la lógica. Este estudio tiene como fin fundamental presentar los principios de operación y control de la fermenta¬ ción, con objeto de que investigadores y estudiantes del campo tengan un marco común, necesario para unificar y facilitar el avance científico y tecnológico del cultivo microbiano y de sus aplicaciones. La ingeniería bioquímica ha surgido como resultado de la interacción de la bioquímica, la genética, la microbiología y la ingeniería química, y es a ella a quien concierne el estudio y la utilización de los microorganismos y sus productos. A Aiba et al. 1 se debe una definición aceptada de esta disciplina: "Ingeniería bioquímica es la actividad que se ocupa del procesamiento económico de materiales de carácter u origen biológico con propósitos útiles. La función del ingeniero bioquímico es aplicar en la práctica los conocimien¬ tos del microbiólogo y del bioquímico. Para llevar a cabo esta tarea, el ingeniero bioquímico debe no solamente tener bases sólidas en los principios básicos de ingeniería, sino conocer las ciencias biológicas." Sin embargo, esta definición o cualquier otra de las que se han dado, indica únicamente el contexto general de la ingeniería bioquímica, porque sólo a través de su estudio se logra conocer sus alcances e importancia. A continuación se presentan algunos aspectos generales de la fermentación, que consideramos necesario mencionar. DESARROLLO HISTORICO

Desde hace miles de años el hombre ha utilizado los métodos biológicos para producir y conservar sus alimentos y también para obtener productos que le han ayudado a mejorar su salud (por ejemplo, antibióticos y vitaminas) o le

1151

16

Introducción

lian procurado algún gusto (entre otros, saborizantes y bebidas alcohólicas). Se recomienda revisar los tratados generales de microbiología y fermenta¬ ción1-5 a todos aquellos que estén interesados en ese desarrollo histórico. Los principios de la microbiología industrial fueron establecidos cuando Pasteur, a mediados del siglo pasado, demostró indiscutiblemente que la fermentación alcohólica era producida por levaduras. Desde ese momento hasta la segunda guerra mundial se desarrollaron muchos procesos industriales de fermentación, fundamentalmente las diferentes fermentaciones alcohólicas y la producción de ácidos acético, láctico y cítrico, así como la de glicerol, acetona y butanol. Los procesos típicos utilizados durante ese período fueron: el cultivo sumergido anaeróbico y el cultivo en superficie aeróbico. Sin embargo, debido a la necesidad apremiante de producir antibióticos durante la guerra,6 hubo que utilizar un proceso industrial más rápido y eficiente que los comúnmente utilizados; éste fue el cultivo sumergido aeróbico en tanques agitados. No cabe duda de que lo anterior produjo el estímulo necesario para que surgiera la ingeniería bioquímica, pues se hizo evidente la necesidad y las posibilidades de aplicar los principios tecnológicos de ingeniería a la fermenta¬ ción, y de combinarlos con el conocimiento biológico. Entré los decenios cuarenta y cincuenta se lograron grandes avances tecnológicos en el cultivo microbiano, y se desarrolló el fermentador agitado con controles automáticos para preservar las condiciones adecuadas de la fermentación. La mayoría de los procesos utilizados en esa época son aeróbicos y operan de manera discontinua (en forma de lote, o proceso batch). El último decenio ha visto el desarrollo y establecimiento de los procesos aeróbicos continuos. Dos han sido las áreas que en estos años han tenido avances importantes: la producción de proteína microbiana* y la tecnología enzimática. La primera surgió como respuesta a la gran demanda y necesidad de producir alimentos baratos y a gran escala, y al encontrarse que las características microbianas (corto tiempo de duplicación, alto contenido proteico y no dependencia de las- condiciones climatológicas), presentan grandes ventajas respecto a otras fuentes de proteína. La tecnología enzimática ha recibido un gran impulso debido a que sus posibilidades de aplicación en el área médica y de alimentos son muy prometedoras. En ambas áreas se han registrado importantes avances debido al gran número de investigadores que han dedicado su esfuerzo a resolver los problemas interdisciplinarios surgidos durante su desarrollo, haciendo de ellas campos interesantes e intelectualmente atractivas. Pero la ingeniería bioquímica no sólo ha avanzado y tenido éxito en procesos industriales, sino que ha contribuido al mejor entendimiento del metabolismo microbiano al utilizar la técnica de cultivo continuo que somete a un microorganismo a diferentes condiciones ambientales constantes por largos periodos y estudia los cambios que a nivel celular ocurren cuando el medio ambiente varía. Los aspectos cinéticos han adquirido importancia y, en

* Se denomina indistintamente proteína microbiana, proteína unicelular o biomasa al producto que se obtiene del crecimiento de microorganismos (y que son ellos mismos). Pueden ser bacterias, levaduras u hongos que utilizan para crecer diversos sustratos en un cultivo aeróbico, con fines de alimentación.

Proceso de la fermentación

17

particular la cinética enzimática, que considera los efectos de difusión y de diseño de reactores, ha permitido un conocimiento más extenso y profundo del problema general de la catálisis. Estos son sólo dos ejemplos de los logros científicos alcanzados; la mejor muestra de la importancia presente y futura que tiene la fermentación es la proliferación de la literatura relacionada y el establecimiento de grupos de investigación científica e industrial dedicados a trabajar en el área. Es muy difícil indicar qué áreas se seguirán desarrollando o surgirán en los próximos años, pero entre las que parecen más probables están: la aplicación de la técnica de cultivo continuo a diferentes tipos de fermenta¬ ciones, el diseño de mejores procesos de separación y purificación (utilización de la proteína unicelular por humanos), la fermentación anaeróbica (principal¬ mente producción de metano), el desarrollo del cultivo de tejido celular animal y vegetal (hormonas) a nivel industrial, la aplicación en la práctica de la ingeniería genética, la utilización de desperdicios agrícolas e industriales como sustratos de fermentación, y la disminución y control de la contaminación ambiental.

m

PROCESO DE LA FERMENTACION

Las industrias de procesos bioquímicos se encargan del aprovechamiento, bajo condiciones controladas, de materiales biológicos tales como microorganismos, tejido celular animal, productos microbianos y enzimas. Los procesos asocia¬ dos con la producción de microorganismos y de algunos productos específicos son importantes comercialmente. Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y segregan algunos compuestos bioquímicos de importancia para el hombre. Estas son las características en que se ha basado la utilización de los microorganismos como productores de fermentación, la que de una manera esquemática se puede representar así: CONDICIONES MICROORGANISMOS r bacterias

levaduras,

hongos, tejido celular,

L-etc.

ELEMENTOS NUTRIENTES

C, H, O, N, S, P, metales,

vitaminas, etc.

Fermentación* Microorganismos + CO,

*

AMBIENTALES ADECUADAS pH, temperatura,

viscosidad,

oxígeno disuelto, etc.

+ Productos (intra y extracelulares)

* Cuando se provee de oxígeno molecular al sistema, la fermentación se denomina aeróbica y hay desprendimiento de C03 ; cuando el oxígeno molecular está ausente, se deno¬ mina anaeróbica. Es decir, que para que una fermentación se realice son necesarios los siguientes requisitos: tener un microorganismo de características idóneas para el proceso y/o producto particular, proveer un medio de cultivo adecuado (que contenga todos los nutrientes esenciales en las proporciones y cantidades óptimas de producción) y, finalmente, establecer y controlar las condiciones

18

Introducción

fisicoquímicas necesarias para el desarrollo de la fermentación. Como resultado se obtendrá una cantidad de microorganismos mayor que la inicial y diversos productos (antibióticos, esteroides, enzimas, ácidos orgánicos, etc.). Todas estas variables son las que interaccionan y deben optimizarse para lograr un

proceso adecuado. En el caso de la proteína microbiana, por ejemplo, lo que pretende es obtener la cantidad máxima de células y minimizar la producción de C02 o de cualquier otro producto extracelular; en la produc¬ ción de antibióticos, por el contrario, se trata de obtener el máximo de productos específicos extracelulares. No debe olvidarse, sin embargo, que un proceso de fermentación compren¬ de, en un sentido más amplio, no sólo las reacciones bioquímicas efectuadas por microorganismos y/o por enzimas sino que además considera las caracterís¬ ticas físicas y de operación del recipiente en donde se lleva a cabo -el fermentador— y las operaciones que se efectúan antes y después de la fermentación. La figura 1.1 presenta el diagrama de flujo de una fermentación típica. Se pueden distinguir tres áreas principales: laboratorio, fermentación y extracción. Cada una de estas áreas será explicada detalladamente en los siguientes capítulos, pero debe hacerse hincapié en que todas ellas funcionan se

Microorganismos on lo formtn tmUón

19

como un todo y aunque para su estudio se dividan, al evaluarse una fermentación siempre deberá tenerse en mente la totalidad del proceso. Los capítulos de este estudio han sido preparados de acuerdo con las necesidades y los problemas que se presentan en el desarrollo de una fermentación a escala de laboratorio e industrial. El capítulo dos se refiere a la preparación del medio de cultivo y a las condiciones fisicoquímicas necesarias para obtener un producto deseado con un rendimiento elevado. Los capítulos tres y cuatro analizan la cinética de la fermentación y de sus productos en sus formas de operación más comunes: batch y continua. Los capítulos cinco y seis presentan el problema de diseño de fermentado res, de transferencia de masa y cómo se emplean los resultados de laboratorio cuando se pasa a escala industrial. El capítulo siete trata del problema de la esterilidad del medio de cultivo y del aire, la cinética de ésta y sus efectos en la fermentación. En el capítulo ocho se estudia la separación y extracción de productos y se indican los diferentes métodos empleados y cuál es el criterio de selección. En los capítulos nueve y diez se analiza el problema de la proteína unicelular y sus diversas soluciones posibles: bacterias, levaduras, hongos, etc., así como los diferentes sustratos utilizados: n-parafinas, metanol, melazas, celulosa, etc. Finalmente, el capítulo once constituye una introducción a la tecnología enzimática en sus diversos aspectos. Debido al enfoque de este trabajo no se hace especial referencia a tres aspectos importantes de la fermentación que han sido ampliamente tratados en otras publicaciones:7-11 microorganismos utilizados, productos obtenidos y literatura especializada en fermentación

~

1

2

MICROORGANISMOS EN LA FERMENTACION

3

laboratorio

C +~ (300-3 000 gal) (10,000-

Planta de fermentación.

Planta de extracción

-

'

50,000 gal)

Los microorganismos utilizados en la fermentación son generalmente bacterias, levaduras, hongos, algas y tejido celular animal y vegetal. La figura 1.2 indica la clasificación general y la subdivisión de los protistas; debido a sus caracterís¬ ticas particulares, los virus no entran en esta clasificación. Entre los protistas

superiores los hongos tienen una importancia industrial mayor. Organismos pluricelulares

-(a) A Entrada de aire estéril

B C D E

Salida de aire Entrada agua de enfriamiento Salida de agua Adición de ácido, álcali y antiespumante

F Biomasa (micelio) G Destilación H Solvente I Solución

-[jó]

i

metazoarios

i

metafitas

Organismos unicelulares

ÿ protistas

1 Cepa productora congelada

2 Crecimiento slant 3 Matraz agitado de cultivo 4 Fermentador de semilla 5 Fermentador principal 6 Filtro rotatorio (vacío) 7 Centrífuga de extracción 8 Cristalizador 9 Secador 10 Empaque de producto

Figura 1.1. Diagrama de flujo de un proceso típico de fermentación.

protistas superiores (eucariotes)

f

protozoarios

i 1algas (eucariotes)

hongos

protistas inferiores (procariotes)

f

cianofíceas

Figura 1.2. Clasificación general y subdivisión de los protistas. 12

1

bacterias

20

Introducción

El nombre y la vuricdud de los hongos {Fungi) hace que su clasificación sea difícil. La figura 1.3 sitúa las principales especies que se utilizan en la industria bioquímica; los hongos imperfectos (Fungi imperfecti) son utilizados en la transformación de esteroides y en la producción de ciertos antibióticos. Debe indicarse que en la gran mayoría de las fermentaciones se emplean cultivos puros (o sea el uso de una cepa de una especie dada de microorganis¬ mos y se evita la contaminación microbiana proveniente de fuentes externas) y sólo en casos muy particulares se usan dos o más especies (denominado cultivo mixto) y en condiciones sépticas; tal es el caso del tratamiento de aguas por procedimientos biológicos (véase apéndice C). En varios países existen amplias colecciones de microorganismos, que pueden obtenerse generalmente en forma gratuita y rápida. Se pueden emplear cuando se desea partir de un microorganismo cuyas características y condicio¬ nes son conocidas, para efectuar, por ejemplo, estudios de utilización de diversos tipos de sustrato o para hacer experimentos cinéticos. La tabla 1.1 presenta las principales colecciones microbianas; Hesseltine y Haynes13 dan la lista completa de las colecciones mundiales. Cabe señalar que en la mayoría de los estudios experimentales se emplean microorganismos de alguna de las colecciones indicadas, pero no debe olvidarse que en la naturaleza existen miles de especies que aún no han sido exploradas ni en cultivo puro ni mixto, y es muy probable que, por ser resultado de la selección natural, tenga características genéticas superiores a algunas de las especies utilizadas o produzcan compuestos bioquímicos de valor e importan¬ cia superiores. Los microorganismos utilizados en procesos industriales se han obtenido generalmente, aislándolos del medio ambiente mediante diferentes técnicas. La técnica de aislamiento por cultivo de enriquecimiento (se inicia la fermenta¬ ción con un cultivo mixto en un medio especial en el cual sólo sobreviven los microorganismos que se adaptan mejor; con los sobrevivientes se inicia otra Hongos [Fungí )

-

*

Hongos verdaderos (eumicctos)

Ficomicetos

\

Mucorales

Ascomicelos

i Discomicetos

*

Basidiomicetos

Fungí imperfecti

l'irenomicelos

liotry tu

Plectomicelos

Ctotriehum

Mucor CunninghumeHa

Zygorhymhus

Sacaromícelales

I

Saccharomyces: hansenula ctrtvltiat fragilis ¡aclis

Candóla milis Candida tmpicalís Rliodulonilü

T Aspergióles

ÿ Aspergillus.

Nturospora Trichoderma

1

Trichothtcium

Esferales

ÿ Cephalosporium

ntger

terreus

flatus oryzoc Feniallium , clirysagenun

ÿ

notation

grfteofiilvum

Figura 1.3. Clasificación de los hongos (Ffcngí).l 2

TABLA l.l

Principales colecciones microbianas 14 Tipo de microorganismos

Dirección

Nombre

American Type Culture Collection (ATCC)

Maryland 20852

Rockville

EUA

Bacterias, actinomicetos, hongos, algas, protozoarios

Central Bureau voor

Baarn

Holanda

Hongos y actinomicetos

Kew

Inglaterra

Hongos

Peoria

EUA

Schimmelculture (CBS) Commonwealth gical Institute

Mycolo-

Agricultural Research Ser¬ vice Culture Collection

Illinois 61604

Bacterias, actinomicetos hongos

(NRRL)

National Collection of In¬ dustrial bacteria (NCIB)

Aberdeen

Escocia

Bacterias

Centre de collection des types microbiens

Lausana

Suiza

Bacterias

Culture Collection

Universidad de Cambridge

Inglaterra

Algas y protozoarios

National Collection of Type Culture (NCTC)

Londres

Inglaterra

Bacterias, actinomicetos y hongos

Culture Collection of India¬ na University

Bloomington Indiana 47405

EUA

Algas

fermentación en el mismo medio y así se continúa hasta que se obtiene o un cultivo puro o un cultivo mixto capaz de crecer óptimamente en las condiciones especificadas) variando temperatura, pH, concentración de diferen¬ tes sustratos, etc., ha rendido resultados satisfactorios en muchos casos.15"17 Una vez aislado, el microorganismo es sometido a procedimientos de mejora¬ miento y selección genética hasta obtenerse una cepa altamente productora, estable y cuyos requerimientos nutricionales son conocidos.18 A través de los ejemplos y de la literatura citada se espera que el lector adquiera una visión de cuáles son los microorganismos que se usan en diferentes áreas de la fermentación.

Cladosporium Currularia Fusarium

Rhtzapus Absidta Hlakeslea Choanophora

ÿ

Alternaría

21

Productos do la fermentación

Agaricales

Uredinales

Ustilaginales

PRODUCTOS DE LA FERMENTACION

Tratar de enumerar y analizar todos y cada uno de los productos de la fermentación es una tarea que varios autores han intentado, y a ellos conviene recufrir para un estudio detallado.19"25 La tabla 1.2 indica los principales productos de la fermentación industrial; la agrupación presentada se basa en la estructura química de los productos y, fundamentalmente, en el uso práctico. Como se puede apreciar, los .productos de la fermentación se relacionan directamente con las áreas siguientes: a) Alimentaria (proteína, saborizantes, aminoácidos, etc.)

22

Introducción

23

Literatura sobre fermentación

ÿé§

TABLA 1.2

si

Principales productos obtenidos por fermentación

St c u

Acidos orgánicos

A minoácidos

Alcoholes y solventes

A. acético A. cítrico A. fumárico A. glucónico A. itacónico A. láctico

Glutamato de sodio L-lisina

O-rt

L-triptoCano

Acetona Butanol 2,3 Butanodiol Etanol

L-valina

Glicerol

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A ntibióticos

Esteroides

Proteina unicelular

Bacitracina estreptomicina Neomicina Penicilina Tctraciclina

Cortisona Hidrocortisona

Alga

Testosterona Triamcinolona

Vitaminas

Otros

Acido ascórbico Cianocobalamina

Alcaloides

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DL-metionina

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l¡- caroteno

Riboflavina

Prednisolona

Enzimas

Insecticidas biológicos Metano

Nucleótidos (saborizantes) Polisacáridos

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J.IÍ Whltaker, "l-'ood Related Fnzymes", Adv. Client. Series, 1 36, American Chemical Society, Washington, D.C., 1974.

El estudio del crecimiento y desarrollo microbianos comprende varias discipli¬ nas pues, a pesar de ser un fenómeno natural, su descripción en términos cualitativos y cuantitativos es compleja. Para poder tener crecimiento microbiano, desde el punto de vista de la fermentación, es necesario que se cumplan varios requisitos tanto de tipo biológico como fisicoquímico. En primer lugar es necesario tener un cultivo en condiciones adecuadas, es decir, células en estado vegetativo o esporas suscepti¬ bles de reproducirse. Para ello es menester conservar adecuadamente las cepas en el laboratorio y es recomendable que cada 3 o 4 meses las cepas almacenadas sean transferidas a nuevos medios. MEDIO DE CULTIVO

El microorganismo requiere para su crecimiento de una fuente de energía y de fuentes de materia. En la mayoría de las fermentaciones industriales la fuente de energía -y la de materia son la misma (i>. gr. azúcar), pero es necesario quÿ "la fuente de materia contenga todos los elementos constitutivos de la masa celular en las proporciones requeridas por la composición interna del organis¬ mo. En la tabla 2.1 se presentan los compuestos orgánicos de los principales elementos de la masa celular y su porcentaje en peso seco; las cifras son de carácter general, pero se considera que son representativas de la composición microbiana. La formulación del medio de cultivo debe considerar todos los elementos de la tabla 2.1, así como otros necesarios para la producción de metabolitos especiales.2-3 Un problema práctico que se presenta con el uso de medios que no están definidos químicamente, por ejemplo melazas, es que la composición varía con el tiempo, el lugar y la forma de almacenamiento. Para la formulación del medio se deben emplear composiciones similares a las

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