Quimiolitotrofia-ENCB

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS LABORATORIO DE FISIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA MICROBIANA

Práctica 5: OXIDACIÓN DE AZUFRE POR BACTERIAS QUIMIOLITOTRÓFICAS “

”

HIPÓTESIS Si Thiobacillus thiooxidans   es un microorganismo quimiolitotrofo capaz de oxidar el azufre en condiciones aerobias1, entonces la cantidad de azufre residual en los matraces deberá ser menor en comparación a la cantidad de azufre inicial debido al crecimiento del microorganismo. •Si Thiobacillus thioparus  es un microorganismo capaz de obtener energía a partir de fuentes con iones tiosulfato en condiciones aerobias 2, entonces la cantidad de iones t iosulfato inicial en el medio “B” debe ser menor a la inicial debido al crecimiento del microorganismo. •Si la oxidación biótica del azufre y tiosulfatos acidifican el medio 1, entonces el pH de los medios de cultivo al final del periodo de incubación se verá reducido, siendo indicador dicha disminución del pH de crecimiento positivo. •

OBJETIVOS Objetivo general: Determinar mediante la estimación de sustratos residuales o de los productos oxidados, el crecimiento de los microorganismos quimiolitótrofos bajo 2 condiciones de incubación: estacionario y en agitación constante. Objetivos específicos ♦Cuantificar el azufre oxidado después del periodo de incubación en condiciones de cultivo en agitación y estacionario cuando el microorganismo T. thiooxidans es inoculado en el medio “A” y

cuando está ausente. ♦Cuantificar el H 2SO4 formado después del periodo de incubación en condiciones de cultivo en agitación y estacionario cuando los microorganismos T. thiooxidans y T. thioparus son inoculado en el medio “A” y “B” (respectivamente) y cuando están ausentes. ♦Cuantificar el S 2O3 oxidado después del periodo de incubación en condiciones de cultivo en agitación y estacionario cuando el microorganismo T. thioparus es inoculado en el medio “B” y cuando está ausente. ♦Observar los cambios de pH al final del periodo de incubación en las distintas condiciones.

ANÁLISIS DE RESULTADOS Tabla 1. Resultados de las diferentes determinaciones realizadas en los medios A y B Resultados obtenidos

Cultivos

Agitados Estacionarios Cultivo de T. thiooxidans  en azufre elemental (Medio A) 1.- azufre utilizado (mg) 86.2 16.8 2.- H2SO4 formado (mg) 146.8 63.8 3.- S de SO4 formado 46.7 29.03 (mg) 4.- pH 0.4 4.5 0.9 4.5 Cultivo de T. thioparus  en tiosulfato (Medio B) 1.- Tiosulfato oxidado 153.7 118.8 (mg) 2.- H2SO4 formado (mg) 124.3 81.1 3.- pH 1.4 6.5 1.5 6.5

En el medio A la cantidad de azufre utilizado, ácido sulfúrico y azufre de sulfatos formado fue mayor en los cultivos agitados. El pH del medio disminuyó de 3 a 4 unidades cuando fue inoculado con el consorcio microbiano que contenía a T. thiooxidans . De la misma manera en el medio B la cantidad de tiosulfato oxidado, ácido sulfúrico formado fue mayor en los cultivos agitados y el pH del medio disminuyó 5 unidades cuando fue inoculado con el consorcio microbiano que contenía a T. thioparus . En las determinaciones de azufre utilizado y tiosulfato oxidado se restaron los valores obtenidos en las determinaciones de los matraces no inoculados para descartar la oxidación abiótica del azufre y tiosulfato.

DISCUSIÓN MEDIO A Azufre residual: Como es posible observar en la Tabla 1, la cantidad de azufre utilizado por T. thiooxidans  es mayor cuando éste se incuba en condiciones de agitación constante (5.13 veces mayor). Esto ocurre porque la oxidación del azufre se favorece en condiciones aerobias, pues es mayor la oxigenación. Además, los mg de ácido sulfúrico formado y azufre de sulfato formado fueron mayores también cuando el medio estaba en agitación. La enzima que cataliza la conversión de Azufre elemental a sulfito es la enzima sulfito citocromo reductasa (SCR por sus siglas en inglés) 10. A pesar de que la cadena de transporte de electrones no se conoce a detalle, se especula que al ser una cadena para oxidación aerobia su aceptor final de electrones es el oxígeno, siendo ésta la razón por la cual hay una diferencia significativa entre el medio que estuvo en agitación contra el estacionario, ya que en el primero se promueve una mayor oxigenación al medio y por consiguiente más oxidación del azufre elemental. Existen ciertas dudas de acerca de los mecanismos que este microorganismo utiliza para poder incorporar el azufre elemental dentro de la célula debido a que este es un elemento insoluble por lo que se han propuesto 2 mecanismos de entrada 9: 1. El organismo reduce el azufre elemental a ácido sulfhídrico, el cual entra en la célula y la re-oxida a ácido sulfúrico. 2. El azufre se hidrata a azufre soluble hidratado que puede posteriormente entrar a la célula. Si bien es cierto que los resultados obtenidos nos demuestran lo teóricamente esperado, se debe considerar que al menos una pequeña cantidad de azufre residual determinada no es totalmente debida a la oxidación biótica del sustrato, ya que en las partículas de azufre se pueden formar esferas de solvatación y por lo tanto pueden dar un poco de peso extra y además la estructura de la “flor de azufre” se puede form ar en medios acuosos, dando también una mínima cantidad de peso extra. Si bien la cantidad de peso extra que se puede generar debido a lo anteriormente explicado es muy mínima, es importante tenerlo en consideración.

H2SO4: De acuerdo con los resultados obtenidos, se observó que como productos formados tenemos la presencia de ácido sulfúrico, el cual reduce el pH inicial del medio de 4.5, a 0.4 en el caso del medio en condiciones de agitación y pH de 0.9 estacionario. Esta disminución demuestra que efectivamente hubo crecimiento del microorganismo. Éste utiliza al azufre elemental presente en el medio como un donador de electrones, oxidándolo hasta sulfatos y éstos al ionizarse se transforman en ácido sulfúrico.

S de SO4 formado:Como puede observarse en la tabla 1 la cantidad de productos oxidados y que pueden ser precipitados como el S de SO 4=  fue mayor en condiciones de agitación. Esto puedo deberse a que la agitación favorece una mayor interacción del Thiobacillus thiooxidans  con el azufre elemental con el que se inoculó el medio A además de que permite incorporar más oxígeno, el cual, es necesario para la oxidación del azufre elemental 1. S0+ O2+ H2O

 H2SO3

H2SO3 + ½ O2  H2SO4

Reacciones de oxidación del azufre elemental a ácido súlfurico por T.thiooxidans 1. Por otra parte, la cuantificación de S de SO 4, H2SO4 y azufre utilizado demuestran el metabolismo quimiolitotrófo de T. thiooxidans ya que obtiene energía, necesaria para su crecimiento, de la oxidación del azufre y utiliza el CO 2 como única fuente de carbono 3. Así mismo las determinaciones anteriormente mencionadas permiten comprobar que la oxidación del azufre está ocurriendo de manera total y no parcial.

pH: La acidificación del medio debido a la producción de H 2SO4 5 fue mayor en los cultivos agitados, ya que como se mencionó anteriormente la agitación favorece una mayor oxidación del azufre. Es importante mencionar que el pH inicial de medio fue de 4.5 lo cual favoreció tanto la oxidación del azufre como el crecimiento ya que aunque T. thiooxidans puede oxidar el azufre en un rango de pH de 0.9 a 7, la fijación de CO 2 y la síntesis de ATP disminuyen cuando el pH aumenta y cuando se encuentra por arriba de 4. 3 4 . MEDIO B T. thioparus es capaz de oxidar tiosulfato a sulfato, utilizado el tiosulfato como fuente de energía

como fuente de energía, se lleva a cabo la siguiente reacción 6: S2O32- + H2O + 2O2 → 2SO42- + 2H2O

 ΔG0’ = -818.3 kJ/reacción

Reacción de oxidación del tiosulfato por T. thioparus Tiosulfato oxidado: Al validar el tiosulfato oxidado, mediante yodometría, el tiosulfato residual reacciona con el triyoduro para formar tetrationato y yodo elemental. Observando los resultados de la tabla 1 se obtuvo que al comparar entre los dos cultivos, en el cultivo la oxidación se ve favorecida,es decir, cantidad de tiosulfato oxidado es mayor. Esto debido ya que se necesita tener al oxígeno como aceptor final de electrones y a agitación favorece la oxigenación del cultivo aumentando así la probabilidad de oxidación. H2SO4 formado: Al igual que con el tiosulfato oxidado, la cantidad de H 2SO4 formado fue mayor en el cultivo en agitación sin embargo se esperaba que la cantidad de tiosulfato oxidado obtenido fuera similar a la cantidad de H 2SO4 producido, ya que es un producto de esta oxidación sin embargo esto no ocurrey se observa una cantidad menor obtenida. Esto puede deberse a que durante la oxidación del tiosulfato, se producen de intermediarios como el tetrationato y el tritionato 7 que podrían interferir con la cantidad de H 2 SO4  producida.La formación de dichos intermediarios se muestra en las siguientes reacciones:

Reacciones de la oxidación de tiosulfato por Thiobacillus thioparus Otro factor importante sería que la oxidación de tiosulfato a ácido sulfúrico es parcial

8

pH: Debido a la producción de H 2SO4, se explica la disminución del pH en cada cultivo indicando que T.thioparus creció. CONCLUSIONES 

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

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Thiobacillus thiooxidans  es capaz de oxidar el azufre a sulfatos, los cuales pasan hasta ácido

sulfúrico, siempre y cuando en el medio esté presente alguna fuente de azufre así como en condiciones de agitación constante para un mayor crecimiento del microorganismo. La oxidación del azufre por Thiobacillus thiooxidans  disminuyó el pH del medio inicial hasta 0.4 en condiciones de agitación y a 0.9 en condiciones de cultivo estacionario, siendo dicha disminución del pH un indicador de crecimiento del microorganismo. La cantidad de tiosulfato que es oxidado es mayor cuando a éste se le pone en contacto con un consorcio microbiano que contiene a T. thioparus en condiciones de agitación en comparación de condiciones de cultivo estacionario, indicando también crecimiento del microorganismo. La oxidación del tiosulfato por T. thioparus disminuyó el pH inicial del medio hasta 1.4 en condiciones de agitación y a 1.5 en condiciones de cultivo estacionario, indicando dicha disminución crecimiento del microorganismo. La cantidad de productos oxidados y metabolitos solubles en el medio, generados a partir del metabolismo de los organismos quimiolitótrofos son directamente proporcionales al crecimiento de dichos microorganismos (biomasa).





Thiobacillus thioparus es capaz de oxidar completamente el tiosulfato a sulfato y parcialmente

a ácido sulfúrico Es probable que a formación de intermediarios como el tetraionato y tritionato disminuya la cantidad de H2SO4 producido

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA 1.ISAMU SUZUKI, C. W. CHAN, T. L. TAKEUCHIO. (1992) Oxidation of Elemental Sulfur to Sulfite by Thiobacillus thiooxidans Cells . APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY. 58(11):3767-3769 2. Vishniac W. (1952) THE METABOLISM OF THIOBACILLUS THIOPARUS I. : The Oxidation of Thiosulfate. Journal of Bacteriology . 64(3):363-373. 3. Vogler, K. (1942). Studies on the metabolism of autotrophic bacteria: I. The respiration of Thiobacillus thiooxidans on

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