UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESIANA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y AMBIENTALES PROGRAMA DE TECNOLOGÍA EN PROCESAMIENTO DE RECURSOS BIOLÓGICOS AMAZÓNICOS CARRERA DE BIOTECNOLOGIA CENTRO DE INVESTIGACION Y VALORACION DE LA BIODIVERSIDAD
“ELABORACION DE BIOFERTILIZANTE BIOFERTILIZANTE A BASE DE MICROORGANISMOS EFICIENTES AMAZONICAS (MEA), CAPTURADOS DE CUATRO ESPECIES DE FABACEAE, MACUMA, CANTON TAISHA, PROVINCIA MORONA SANTIAGO.”
AUTOR: Tlgo. Lee Mayacu T.
Macuma, Enero 2009.
Contenido RESUMEN........................................... .................................................................. .............................................. ................................... ............ 4 1.INTRODUCCIÓN. .............................................. ...................................................................... ....................................... ............... 5 2.PLANTEAMIENTO DEL TEMA ........................... .................................................. ................................... ............ 6 2.1.Contexto ............................................. .................................................................... .............................................. ........................... .... 6 2.2.Problema................................................................ ....................................................................................... ............................... ........ 6 2.3.Justificación............................................ ................................................................... .............................................. ....................... 6 3.OBJETIVOS ............................................. .................................................................... .............................................. ........................... .... 7 3.1.General ........................................... .................................................................. .............................................. ............................... ........ 7 3.2.Especifico ........................................... .................................................................. .............................................. ........................... .... 7 4.MARCO TEORICO. ................................. ........................................................ .............................................. ........................... .... 8 4.1.Las bacterias Nitrificantes. ............................................ ................................................................... ....................... 8 4.2.La Nitrificación: ............................................ ................................................................... ....................................... ................ 9 4.3.Bacterias responsables de la nitrificación......................................... nitrificación............................................. 10 4.4.Microorganismos 4.4.Microorganismos Fijadores Fij adores de Nitrógeno: Familia Famili a Rhizobiaceae ..... 11 4.4.1.Descripción 4.4.1.Descripción general de la simbiosis de Rhizobium ..................... 13 4.4.2.La simbiosis ............................................................ ................................................................................. ..................... 13 4.5.Nodulación en leguminosas........................................... ................................................................ ..................... 14 4.5.1.Reconocimiento 4.5.1.Reconocimiento entre planta y Rhizobium.................................. .................................. 15 4.5.2.Invasión........................................................... .................................................................................. ............................. ...... 15 4.5.3.Nitrogenasa ............................................. .................................................................... ..................................... .............. 16 4.6.Hongo formador de nódulos. ............................................. .............................................................. ................. 16 4.6.1.Micorrizas ............................................ ................................................................... ........................................ ................. 16 5.LOS BIOFERTILIZANTES ............................................ ................................................................... ........................... 17 6.MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS BIOFERTILIZANTES ............ 18
6.1.Fijación de nitrógeno atmosférico ............................................ ...................................................... .......... 18 6.2.Bacterias solubilizadoras de de fósforo del suelo ................................. ................................. 18 6.3.Microorganismos 6.3.Microorganismos que transforman el azufre ...................................... ...................................... 18 6.4.Microorganismos 6.4.Microorganismos que movilizan potasio ........................................ ........................................ 19 7.CARACTERÍSTICAS, FUNCIONES Y RECOMENDACIONES DEL BIOFERTILIZANTE ELABORADO A BASE DE DIFERENTES BACTERIAS. .............................................. ..................................................................... .............................................. ........................... 19 8.LAS BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO............................... ............................... 20 9.METODOLOGIA. ............................................ ................................................................... ........................................ ................. 21 9.1.FASE DE CAMPO................................................ ...................................................................... ............................. ...... 21 9.1.1.Preparación de medios (trampas) para atrapar bacterias del campo. 21 9.1.2.Recolección 9.1.2.Recolección de nódulos de las leguminosas. ............................... ............................... 23 9.2.FASE DE LABORATORIO. ................................................ ............................................................. ............. 24 9.2.1.Aislamiento de las bacterias de las trampas y de los Nódulos..... 24 9.3.RESULTADOS 9.3.RESULTADOS .............................................. ..................................................................... .................................... ............. 25 10.CONCLUSIONES .............................................. ..................................................................... .................................... ............. 26 11.BIBLIOGRAFIA. ............................................... ...................................................................... .................................... ............. 26
UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESIANA SEDE QUITO FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y AMBIENTALES INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGIA
“ELABORACION DE DE BIOFERTILIZANTE BIOFERTILIZANTE A BASE DE MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS EFICIENTES AMAZONICAS (MEA), CAPTURADOS DE CUATRO ESPECIES DE FABACEAE; MACUMA, CANTON TAISHA, PROVINCIA MORONA SANTIAGO” Autor: Tlgo. Lee Mayacu. Fecha: Enero, 2009. RESUMEN
Descriptores:
1. INTRODUCCIÓN. Los biofertilizantes son sustancias o mezclas químicas naturales o sintéticas utilizadas para enriquecer el suelo y favorecer la estimulación del crecimiento vegetal por la inducción de las hormonas que estas contienen. Las plantas no necesitan compuestos compuestos complejos, del tipo t ipo de las vitaminas o los aminoácidos, esenciales en la nutrición humana, pues sintetizan todos los que precisan. Sólo exigen una docena de elementos químicos, que deben presentarse en una forma que la planta pueda absorber. Dentro de esta limitación, el nitrógeno, por ejemplo, puede administrarse con igual eficacia en forma de urea, nitratos, compuestos de amonio o amoníaco puro, y las plantas tienen la capacidad de fijar y sintetizar los compuestos que el suelo necesita y la planta también lo requiere.(Encarta estudiantil, 2009). Por tal razón se vio la necesidad de hacer una captura y ensayo con los microorganismos que se encuentran en simbiosis con las plantas, que se pueden encontrar en distintas leguminosas que en la amazonia son abundantes y no son aprovechadas de ninguna manera estos microorganismos que se encuentran junto con ellos y documentar la nueva metodología de experimentación y aprovechamiento de las cepas de dichos microorganismos que las las plantas generan generan en sus raíces y así aportar aportar a los agricultores de la zona a fertilizar sus suelos y cultivos orgánicamente.
2. PLANTEAMIENTO DEL TEMA 2.1. Contexto El presente trabajo de investigación se realizo en el laboratorio de Microbiología de la Universidad Politécnica Salesiana, ubicada en Sevilla Don Bosco,
que está ubicado a
20km del rio upano y 1 hora aproximadamente al pie del del bosque protector Kutukú Kutukú de la parroquia Sevilla, dentro del marco de selección del área de estudio se hizo por la cercanía del bosque primario disponible y por la gran necesidad de los agricultores de la provincia en aportar a sus cultivos de sus fincas, dependiendo estrictamente estrictamente con el uso y manejo que ellos dan a los suelos de la provincia; provincia; ésta investigación tuvo tres fases de trabajo, lo que uno consto de campo, la segunda de laboratorio y la tercera de experimentación. Este trabajo tuvo una duración duración de 5 meses meses dividido en 2 meses de campo campo para la captura microorganismos y 4 meses para el aislamiento y ensayo de los Microorganismos eficientes amazónicos (MEAs) obtenidos del campo y la preparación del informe final. Para esta investigación se usará los siguientes métodos y técnicas: Técnica de captura con tarrinas, Técnica de obtención de cultivos axenicos de bacterias, y Ensayo de biorreactores para confirmar su efectividad efectividad de acción acción en el suelo y los cultivos hortícolas.
2.2.
Problema
Dentro de la provincia no se han hecho estudios de este tipo, por lo tanto los agricultores de todas las zonas de la provincia sienten la necesidad de fertilizar sus suelos con el propósito de sacar buenos productos dentro del mercado local y nacional, y no hay ni un organismo que se preocupe de la agricultura local y así apoye a estos productores. Por lo tanto el propósito de esta investigación ha sido de enfrentar tal problema con la elaboración de un biofertilizante de microorganismos que están presentes en nuestros bosques y aplicar a dichos cultivos de los l os productores para así mejorar el rendimiento de los suelos de la provincia.
2.3.
Justificación
El bosque primario maduro alberga cientos y millones de microorganismos que ayudan en la descomposición de los restos vegetales y animales en nutrientes esenciales para las plantas que frecuentemente el hombre cultiva para el sustento diario y para las plantas que crecen libremente en el bosque. Como nos damos de en cuenta que por el esfuerzo que los
agricultores lo hacen al suelo por cultivar sus productos, los suelos actuales y especialmente amazónicos pierden con facilidad su capa de materia orgánica y se han vuelto infértiles. Por lo tanto es verdad que nos urge investigar y documentar esa información que guarda el bosque en interacción con los microorganismos y elaborar un producto a base de ellos que el resultado seria el biofertilizante que esta cargado de cientos de aquellos microorganismos que día a día se matan con la agricultura sedentaria que es la quema del bosque cortado y la agricultura actual que es la aplicación de pesticidas, herbicidas y abonos químicos que sustituyen a aquellas que son naturales que en este caso son los microorganismos microorganismos que activan y mantienen en equilibrio a las plantas y el suelo. Con este proyecto se pretende apoyar a los agricultores de la provincia a enfrentar los problemas de la infertilidad del suelo amazónico y enseñar a utilizar los medios alternativos de agricultura sostenible y sustentable.
3. OBJETIVOS 3.1.
General
Elaborar un biofertilizante a base de microorganismos obtenidos del bosque, para así apoyar a los agricultores de la provincia a enfrentar los problemas de la infertilidad del suelo amazónico.
3.2.
Especifico
Capturar los microorganismos que están en simbiosis con las leguminosas y los suelos amazónicos.
Identificar qué tipo de microorganismos actúan en simbiosis con las leguminosas amazónicas y el suelo.
Aprender cómo se realiza la fijación biológica del nitrógeno a través de la simbiosis Microorganismos- leguminosas.
Conocer a obtener cultivos puros de cada especie por la morfología de crecimiento y color de las bacterias en el laboratorio.
Elaborar un biofertilizante orgánico fitoestimulante del follaje de las plantas y reactor de los suelos infértiles de la provincia y dar a conocer de los beneficios
que brinda este producto elaborado con microorganismos obtenidos de los bosques y leguminosas amazónicas. amazónicas.
Conocer la importancia ecológica del uso de este producto orgánico.
4. MARCO TEORICO. 4.1.
Las bacterias Nitrificantes.
Son las bacterias bacterias benéficas en el acuario acuario y el suelo, llamadas Nitrosomas y Nitrobacter encargadas de transformar el nitrógeno atmosférico y el amonio en nitritos y nitratos. Son los autótrofos que realizan cambios importantes en los suelos al fijar en ellos el nitrógeno atmosférico.
En general: Las bacterias del hidrógeno son: Pseudomonas, Paracoccus, Alcaligenes, etc. Muchas son quimiolitótrofos facultativos. Pueden crecer también como quimiorganótrofos usando compuestos orgánicos. Todas las bacterias poseen una enzima clave ligada a membrana que es la Hidrogenasa, escinde el H 2 y cede a la cadena de transporte de e - los electrones. Se crea el gradiente de H+ para formar ATP. Están asociados a la membrana plasmática y componentes de la cadena de transporte de electrones. Las bacterias nitrificantes (BN) o bien realizan la oxidación de amoniaco a nitrito (NH3 a NO2-) como el Geobacter nitrosomonas; o bien la oxidación de nitrito a nitrato (NO2- a NO3-)
como
el
Geobacter
nitrobacter.(monografías.com/trabajos nitrobacter.(monografías.com/trabajos
10/clorofa/clorofa.schtml) Cuadro 1.1. Bacterias oxidadoras de amoniaco y nitritos .
4.2.
La Nitrificación:
Proceso ampliamente distribuido en la naturaleza y supone la acción secuencial de estos dos tipos de bacterias. En el caso de las bacterias que utilizan la oxidación de NH3 a NO2- : Se produce mediante un paso intermedio en que el NH3 pasa a hidroxilamina (NH2O), el enzima que interviene es una monooxigenasa que produce la oxidación del NH3. En el segundo paso la NH2O es oxidada a NO2- mediante una hidroxilamina-óxidoreductasa.
La primera es una enzima constitutiva ligada a la membrana celular, la segunda actúa a nivel del periplasma. La e- necesaria para que el NH3 se reduzca proceden de la cesión directa de la hidroxilamina-óxidoreductasa al citocromo "c" por la cadena transportadora de e- hasta el oxígeno generando una fuerza motriz de protones que generará ATP. En bacterias en que realiza la oxidación del NO2- a NO3- : Se realiza por una enzima nitrooxidasa, en este caso los e- se incorporan sobre los citocromos, la cadena es muy corta y el rendimiento de generación de ATP no es muy alto. El metabolismo es típicamente quimiolitótrofo, viven en aerobiosis. En ocasiones el NH3 se puede oxidar en anoxia por acción del nitrato, aceptor de e-, para la formación del H2. Reacción muy exotérmica con alta liberación de energía. En BN se emplea el ciclo de Calvin para fijar CO2, algunas utilizan compuestos orgánicos porque en la fijación fijación del CO2 se utilizan mucha mucha energía.
4.3.
Bacterias responsables de la nitrificación
4.4.
Microorganismos Microorganismos Fijadores de Nitrógeno: Familia Rhizobiaceae
La revolución verde de los años sesenta trajo un notable incremento de la producción agrícola, gracias, sobre todo, al empleo generalizado de abonos químicos y semillas mejoradas. Pero el fertilizante nitrogenado, el más utilizado en agricultura, se lleva buena parte de la inversión en el campo. Para la fabricación de fertilizantes nitrogenados se requiere en general energía derivada del petróleo. Por otro lado, su uso indiscriminado ha ocasionado graves problemas de contaminación, contaminación, ya que no todo el fertilizante fertili zante que se aplica lo aprovecha la planta; en una cuantía importante acaba en lagos y lagunas. (Ministerio del ambiente,
2005)
La fijación biológica de nitrógeno es la opción alternativa y natural de la fertilización química. De todos los seres vivos, sólo un centenar de géneros de bacterias están capacitados para fijar nitrógeno del aire, donde este elemento constituye alrededor del 70%, y convertirlo en compuestos asimilables por todos los organismos. Entre las especies fijadoras de nitrógeno hay cianobacterias (Anabena y Nostoc, arqueobacterias (Methanococcus), bacterias grampositivas (Frankia y Clostridium), enterobacterias (Klebsiella) y otras proteobacterias (Rhizobium, Azospirillum y Acetobacter,
entre
varias).
En la fijación biológica de nitrógeno el mundo orgánico halla su fuente principal de abastecimiento en dicho elemento. Si se suspendiera el proceso de fijación, todo el nitrógeno retenido en la biomasa regresaría a la atmósfera en 100 años. De poder fijar nitrógeno, el hombre no necesitaría ingerir proteínas. Pero la ambición de los científicos no es que el hombre fije nitrógeno, sino que los cultivos altamente extractivos de nutrientes del suelo puedan prescindir del uso de fertilizantes mediante la fijación biológica de nitrógeno.
En la naturaleza ya existen plantas que aprovechan la fijación de nitrógeno realizada por bacterias que se asocian con los vegetales. Ocho familias de plantas emparentadas entre sí gozan de la capacidad para asociarse en simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno. Las
plantas en cuestión alojan a las bacterias en estructuras especiales que se forman en sus raíces; en los nódulos, nombre de esas estructuras, las bacterias fijan el nitrógeno.
Individuos de los géneros Rhizobium. Bradyrhizobium y Azorhizobium penetran en las raíces y a veces en los tallos de las leguminosas, mientras que Frankia y otros actinomicetos son las responsables de la fijación de nitrógeno en Casuarina y otras especies. Las leguminosas se cuentan entre las familias más numerosas, con unas 19.000 especies distribuidas por ambientes muy dispares. Se admite que deben tamaño éxito adaptativo a su capacidad para fijar nitrógeno, lo que les permite colonizar suelos pobres en nutrientes. Pero no todas las especies están capacitadas para formar nódulos; tampoco se sabe cuántas establecen simbiosis. Las más conocidas son las que tienen valor comercial y alimentario para el ser humano humano o para el ganado, ganado, como el fríjol, la soja, la arveja, arveja, la lenteja, el haba y la alfalfa. Todas ellas fijan nitrógeno atmosférico al establecer simbiosis con Rhizobium y otros géneros emparentados.
En comparación con el gran número de leguminosas, sólo se han identificado unas 15 especies de Rhizobium, tres de Bradyrhizobium y una de Azorhizobium, Por eso se sospecha que debe de haber una cifra elevada de especies de estas bacterias por describir. Los individuos de los géneros citados moran en el suelo y habitan en las zonas geográficas donde existe la planta con la que establecen simbiosis. Actualmente se ha hallado Rhizobium effl en las semillas de fríjol, lo que induce a suponer la existencia de un posible mecanismo de dispersión geográfica del Rhizobium conjuntamente con fríjol en tiempos históricos. Dentro de una misma especie de Rhizobium observamos un grado de diversidad amplísimo. Proporcionalmente, la disparidad entre bacterias pudiera compararse con la distancia
que
separa
al
hombre
de
la
gallina.
Gracias a la diversidad intraespecífica que ofrecen Rhizobium y Bradyrhizobium se ha
dispuesto de un acervo valioso para seleccionar las mejores cepas. Se han logrado así linajes óptimos para la fijación fi jación del nitrógeno, en cuanto han colonizado campos de cultivo.
4.4.1. Descripción general de la simbiosis de Rhizobium Los Rhizobium son bacterias Gram negativas y aerobias obligadas que pertenecen a la
familia Rhizobiaceae . Entre ellos se encuentran los géneros Rhizobium, Bradyrhizbium y Azorhizobium.
Estos microorganismos del suelo forman una asociación simbiótica con
distintas especies de plantas y durante la simbiosis son capaces de llevar a cabo la fijación de nitrógeno molecular. En la simbiosis las bacterias se encuentran en las raíces de las plantas dentro de estructuras llamadas nódulos. Ni la plantas ni estas bacterias aisladamente fijan el nitrógeno diatomico (N2) para convertirlo en amonio. La simbiosis es inhibida si existe un exceso de nitrato o amonio en el suelo. Dentro de los nódulos las bacterias se convierten en bacteroides que son células más grandes que los Rhizobium
que se encuentran en el suelo y que llevan a cabo la fijación de nitrógeno
porque son capaces de formar la enzima nitrogenasa nit rogenasa que es responsable de la conversión del nitrógeno molecular en amonio. Debido a esta simbiosis, la planta recibe nitrógeno que puede utilizar para sí misma, mientras que las bacterias utilizan moléculas que les proporciona la planta. planta.
4.4.2. La simbiosis Solamente las leguminosas son capaces de utilizar el nitrógeno en forma de nitrato o amonio para la síntesis de compuestos nitrogenados como los aminoácidos. En la simbiosis con los Rhizobium se forman nódulos rizoidales, en los cuales las bacterias simbióticas fijan el nitrógeno atmosférico que proporcionan a la planta. Por eso, en presencia de estas bacterias simbióticas las leguminosas pueden crecer en suelos que no tienen suficiente nitrato o amonio para un desarrollo normal de la planta. Por esta razón los Rhizobium pueden ser utilizados como inoculantes para mejorar el crecimiento de leguminosas en lugar de abonos. Por otro lado, las bacterias utiliza moléculas de la planta y de esta forma, ambos "socios" tienen una ventaja de la simbiosis.
4.5.
Nodulación en leguminosas
Todos los organismos vivos necesitan de una fuente nitrogenada para poder crecer, dado que muchos de los principales compuestos celulares, como las proteínas y ácidos nucleicos, contienen en su estructura nitrógeno. Dada la gran variedad de seres vivos que existen en la naturaleza, existen diferentes compuestos nitrogenados que los diferentes organismos son capaces de asimilar, para el caso de las plantas la fuente de nitrógeno que pueden utilizar es el amonio (NH4+) y el nitrato (NO3-), o sea compuestos nitrogenados inorgánicos. Para el caso de los animales superiores además de requerir amonio, requieren de compuestos nitrogenados orgánicos, como aminoácidos o bases nitrogenadas. Es importante decir que todos los compuestos nitrogenados provienen del nitrógeno molecular (N2), que representa el 80% de los l os gases que forman la atmósfera terrestre. Solo existen unos organismos capaces de asimilar el N2, estos organismos son bacterias que se conocen con el nombre de bacterias nitrificantes o fijadoras de nitrógeno. Los demás organismos de la naturaleza no pueden asimilar el N2 de la atmósfera y por lo tanto para adquirir el nitrógeno que necesitan dependen del metabolismo de las bacterias nitrificantes para tener una fuente nitrogenada. Las plantas y demás organismos son incapaces de asimilar el nitrógeno en forma molecular, excepto por las bacterias nitrificantes que por medio de su metabolismo toman el N2 de la atmósfera y lo convierten en amonio por medio de la enzima nitrogenasa y la hidrolizas del ATP. Ya estando en forma de amonio o nitrato el nitrógeno puede ser utilizado por las plantas. Las bacterias nitrificantes o fijadoras de nitrógeno se acoplan con un número significativo de especies vegetales en una relación que llaman simbiosis (relación entre dos especies donde ambas reciben un beneficio, pero no es absolutamente indispensable para la sobrevivencia de alguna de las especies), o sea que algunas especies de plantas se asocian en relación simbiótica con las bacterias nitrificantes. Las plantas que se asocian con las bacterias nitrificantes nit rificantes son las llamadas leguminosas y las l as bacterias fijadoras de nitrógeno son del genero Rhizobium. Las bacterias del genero Rhizobium son habitantes naturales del suelo que infectan las raíces de ciertas leguminosas. Al Llevar a cabo esta infección, se desarrollan unas estructuras en el sistema radicular de las plantas llamadas nódulos, donde viven las bacterias y fijan fij an nitrógeno.
La especie a la que pertenece un cierto ci erto Rhizobium se define por la especie de la planta que nodula y en la que es capaz de fijar nitrógeno. El nódulo es una estructura situada en el sistema radicular de la planta, formada por tejido de la planta. Algunas de las l as células que lo constituyen contiene bacterias englobadas en membranas dentro de su citoplasma, estas bacterias atraviesan un proceso de diferenciación y es precisamente pr ecisamente la forma diferenciada (bacteroide) la que fija nitrógeno. El bacteroide es mayor que la bacteria, posee una forma irregular y se muestra más sensible a cambios de presión osmótica. El nódulo viene a ser un órgano de la leguminosa encargado de fijar y asimilar nitrógeno para la planta, y la planta le proporciona al nódulo (al nódulo y a las bacterias que están en su interior) carbohidratos producto de la fotosíntesis. A cada especie de leguminosa le corresponde un Rhizobium especifico, Por ejemplo al trébol lo nodula el Rhizobium trifolii. La especificidad del Rhizobium que nodula una leguminosa esta determinado en el código genético y se dice que por la presencia de un plasmidio en el ADN, plasmidio que se trasmite a la bacteria o por conjugación del Rhizobium especifico. En resumen se puede decir que el Rhizobium promueve la realización de la simbiosis con la planta, pegándose a su sistema radicular con el objeto de conseguir energía para metabolizar, pero se encuentra con que la planta hospedera le da la contra orden al Rhizobium de que si este me da nitrógeno en forma de amonio yo le dono su energía para metabolizar.
4.5.1. Reconocimiento entre planta y Rhizobium Las raíces de plantas forman exudados que inducen la expresión de genes rhizobiales que son característicos para el comienzo de la simbiosis. Uno de esos factores son flavonoides que producen una interacción con la proteína codificada por el gen nodD. La proteína NodD y las substancias flavonoides forman parte del reconocimiento hospedadorhospedadorespecífico debido a que no todos los flavonoides pueden interactuar con una NodD de una especie bacteriana dada.
4.5.2. Invasión La invasión de las plantas se lleva a cabo por los pelos radiculares. Las bacterias inducen una curvación de esos pelos mediante el contacto con la planta y la producción de metabolitos nod. Las bacterias invaden las plantas mediante el desarrollo de canales de
infección, por lo que se forman túneles transcelulares. Durante la penetración, y la simbiosis, las bacterias no quedan alojadas directamente dentro del citoplasma de las células de la planta hospedadora, sino que permanecen alojadas en "vesículas" rodeadas por una membrana membrana derivada de la membrana citoplasmática citoplasmática de la célula de la planta.
4.5.3. Nitrogenasa La nitrogenasa es el enzima responsable de la reducción de nitrógeno atmosférico a amonio en la simbiosis entre Rhizobium y leguminosa. Se compone de las proteínas NifH, NifD y NifK. La nitrogenasa contiene dos proteínas NifD y dos proteínas NifK. Esas cuatro proteínas forman la dinitrogenasa. Además, la nitrogenasa contiene dos proteinas NifH. Esas sirven como reductasa de la dinitrogenasa. La mayoría de las nitrogenasas contienen un cofactor con Fe y Mo. Sin embargo, hay también nitrogenasas que carecen de Mo y contienen Fe o V por ejemplo. Para la reducción del nitrógeno, se transportan electrones de la reductasa de la dinitrogenasa a la dinitrogenasa y finalmente al nitrógeno. El amonio formado durante la fijación del nitrógeno es proporcionado a la planta en forma de aminoácidos.
4.6.
Hongo formador de nódulos.
4.6.1. Micorrizas Son las asociaciones, que los hongos del suelo establecen con las raíces o rizoides de plantas terrestres. t errestres. El término fue introducido en 1885 por A. B. Frank y significa hongoraíz. Hoy en día, se sabe que forman parte de casi todas las plantas terrestres y aparecen sobre Briofitos(los musgos), muchos Pteridofitos (Helechos), en todos los grupos de Gimnospermas (coníferas) y la mayoría de Angiospermas (plantas con flor que son más evolucionadas que las anteriores). Solo algunas familias como Ciperáceas, Juncáceas, Cariofiláceas o Crucíferas han desarrollado mecanismos de resistencia frente a la colonización por por hongos micorrícicos. micorrícicos. Los taxones taxones fúngicos que que establecen micorrizas incluyen hongos Zygomicetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes. Este hecho sugiere que la evolución de las asociaciones micorrícicas, podría haber sido decisiva en la colonización vegetal de la tierra firme, lo que indicaría que el micotrofismo (este tipo de asociación nutricional entre un hongo y una planta) fue decisivo en la evolución de las plantas y su adaptación al medio terrestre. De hecho, las micorrizas son una de las
asociaciones asociaciones más frecuentes en la Biosfera y se s e ha demostrado sobradamente que las raíces con micorrizas son más eficaces como órganos absorbentes de agua y nutrientes, que las raíces de plantas no afectadas; en consecuencia, las plantas micorrizadas tienen más posibilidades
4.6.2.¿Cómo
de
colonizar
se
produce
suelos
más
la
pobres.
infección?
La infección fúngica se establece en periodos de crecimiento activo de la raíz, tras la penetración de las hifas del hongo, del micelio externo, en las raíces secundarias de la planta, (las hifas del hongo, digamos para entendernos, que son como las raíces del hongo, y ese conjunto de hifas del hongo recibe el nombre de micelio), cambia la anatomía de la raíz de la planta y forma una estructura nueva: la micorriza. Las hifas del hongo son atraídas por exudados de la raíz (las plantas no solo absorben nutrientes a través de las raíces, sino que también excretan ciertos productos que sirven de alimento y contribuyen a formar la microbiota radicular o el conjunto de microorganismos que viven asociados a las raíces de nuestras plantas). En el proceso de infección el hongo solo invade la epidermis de la raíz y el córtex radicular, sin entrar nunca en el cilindro vascular (la parte de la raíz comunicada con el sistema vascular de la planta, con el fin de repartir a todas las células de la planta los nutrientes absorbidos por la raíz)ni en el tejido meristemático( el tejido que tiene el potencial de formar nuevas raíces), ambos protegidos por una capa que se llama cofia.
5. LOS BIOFERTILIZANTES BIOFERTILIZANTES. Son todos los preparados preparados que contienen células células vivas o latentes de cepas cepas microbianas con con capacidad para fijar nitrógeno, solubilizar fósforo, transformar el azufre, movilizar el potasio, potencializar diferentes nutrimentos o producir sustancias bioactivas (vitaminas, aminoácidos, fitohormonas). Los Biofertilizantes se utilizan para aplicar a las semillas o inocular en el suelo con el propósito de mejorar la producción de cultivos . (Huayamis J, 2007)
6. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS BIOFERTILIZANTES BIOFERTILIZANTES 6.1. Fijación de nitrógeno atmosférico La fijación biológica de Nitrógeno Nit rógeno puede ser realizada por distintos organismos: •
“Fijadores de vida libre”, (asimbióticos) que son capaces de fijar nitrógeno sin la cooperación de otras formas vivas, ejemplo: las bacterias pertenecientes a la familia Azotobacteriaceae, muchos de los Clostridea anaerobios
y varias especies de algas
Verdi azules. •
Otros grupos se convierten en fijadores cuando viven en asociaciones simbióticas con formas superiores o inferiores de vida. El ejemplo más corriente son las bacterias del género género Rhizobium que viven en simbiosis con las l as leguminosas.
•
Los organismos pertenecientes a la familia Actinomycetaceae que viven en los nódulos radicales de varias especies de plantas no leguminosas y las asociaciones formadoras de nódulos en las hojas, establecidas entre bacterias y algunas especies tropicales de las plantas pertenecientes a los géneros: Ardisis, Pavetta y Psichotria.
6.2. •
Bacterias solubilizadoras de fósforo del suelo
Estas bacterias se conocen también como fosforinas y su uso aún no muy extendido, se presenta como promisorio en la solubilización de formas insolubles de fósforo tanto orgánico como inorgánico. i norgánico.
•
La solubilización por vía biológica de los fosfatos minerales de calcio, hierro y aluminio es una tecnología que ya se encuentra disponible en biopreparados a base de bacterias ( Pseudomonas, Bacillus, Penicillum, Aspergillus, etc.) a partir de las cuales se preparan inóculos con los que se bacterizan las semillas o el suelo
6.3. •
Microorganismos Microorganismos que transforman el azufre
El azufre es un elemento esencial en la nutrición de las plantas pues participa en la formación de aminoácidos y vitaminas.
•
Las bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas spp, Arthrobacter spp. Convierten el azufre azufre elemental y el tiosulfato a sulfato. Los hongos del género género Aspergillus oxidan el azufre en polvo.
6.4. •
Microorganismos Microorganismos que movilizan potasio
Bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Clostridium y hongos como Aspergillus, Penicillum y Mucor ,
solubilizan el potasio mediante la liberación de
ácidos orgánicos e inorgánicos que reaccionan con los minerales.
7. CARACTERÍSTICAS, FUNCIONES Y RECOMENDACIONES DEL BIOFERTILIZANTE
ELABORADO
A
BASE
DE
DIFERENTES
BACTERIAS. MICROORGANISMOS CARACTERÍSTICAS FUNCIONES RECOMEDACIONES Rhizobium sp.
Bacteria fijadora de Sustituye N2
en
Aplicar
en
fréjol,
forma entre el 75 y maní, haba, lenteja y
simbiótica, con las 80 % de la abonos verdes. raíces
de
leguminosas.
las fertilización nitrogenada
Inoculación
de
semillas. Dosis: 2-3 g/ litro de agua, cada 15 días
Azotobacter sp.
Bacteria fijadora de Produce
Aplicar en cereales,
N2
banano, caña caña de
en
forma sustancias
asimbiótica. Aeróbica una y
Dosis: 2-3 g/ litro de
gran vitaminas del agua, cada 15 días B,
ciertos ácidos:
polisacáridos y ácidos indolacético y orgánicos
hortalizas
frutales y tubérculos
crecimiento:
cantidad de fuentes de grupo Carbono
azúcar,
gram de-
negativa Utiliza
promotoras
giberélico. Control biológico por supresión
poblacional de
algunos
agentes patógenos (Fusarium y Aspergillus) Azoospirillum sp.
Bacteria fijadora de Tiene
Aplicar en cereales,
N2
banano, caña caña de
en
forma ingerencia
asimbiótica.
sobre
Aeróbica
azúcar,
gram incrementos
frutales, tubérculos
negativa
en la solución y
(microaeróbica)
del
Como Carbono
fuentes
especies
suelo, ornamentales, y como
de desarrollo de Inoculante
utiliza: las
hortalizas
de
raíces, leguminosas.
ácidos orgánicos
crecimiento
DOSIS: Dosis: 2-3 g/
y ciertos polisacáridos
vegetativo y litro de agua, aumento de la cada 15 días productividad (15-30 %)
8. LAS BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO En forma asociativa (Azotobacter y Azoospirillum) y las solubilizadoras de fósforo sintetizan sustancias biológicamente activas (hormonas, aminoácidos, vitaminas) que son tomadas por las plantas y actúan en determinados estadios de su desarrollo. Pueden estimular la floración o reducir el aborto floral, adelantar la fructificación y la maduración, incrementar el vigor de las plantas y lograr productos con mayor tamaño y peso. Las cepas de Azotobacter son capaces de producir: •
13 aminoácidos
•
6 citoquininas
•
Mayores concentraciones de auxinas y Giberelinas.
Lo que va a producir mayores rendimientos en los cultivos Clasificación de microorganismos fijadores de nitrógeno de interés agrícola y forestal (municipio Morona, 2007) El autor acierta que la fijación biológica del nitrógeno es una biotecnología agrícola respetuosa con el medio ambiente y representa una alternativa a la fertilización nitrogenada, evitando la contaminación de suelos y aguas por nitratos químicos que se producen hoy en día en el mercado mercado mundial y nacional. nacional.
9. METODOLOGIA. 9.1.
FASE DE CAMPO.
Preparación de medios (trampas) para atrapar bacterias del campo. 9.1.1. Preparación MATERIALES: •
1 tarro de plástico (tarina)
•
1 pedazo de tela nylon (media de mujer)
•
1 liga
•
4 onzas de arroz cocinado con sal (sin manteca)
•
2 cucharadas de melaza o miel de panela
•
2 cucharadas de harina de pescado o caldo de carne.
PROCEDIMIENTO: 1. Poner 4 onzas de arroz cocinado con sal. 2. Agregue 2 cucharadas cucharadas de melaza. 3. Agregue 2 cucharadas de harina de pescado o caldo de carne. 4. Tapar la boca del tarro con un pedazo de tela nylon y asegurarlo bien Se recomienda preparar entre 20 capturadores o más a fin de asegurar una elevada diversidad microorgánica.
PROCEDIMIENTO DE CAMPO: 5. Se eligió los sitios donde realizar las capturas: a. Parque botánico del del instituto: Un lugar húmedo y cubierto de vegetación, vegetación, b. Un sector próximo a la laguna del instituto c. Arboles y arbustos sanos y robustos del parque. 6. Se procedió a enterrar los tarros o tarrinas en las áreas áreas elegidas, dejando el borde de las mismas a 10 centímetros de profundidad. 7. Se colocó materia orgánica en proceso de descomposición recogida en los sectores circundantes, sobre el nylon que tapa la boca del tarro. 8. Se identifico el sitio donde enterró las tarrinas t arrinas colocando una baliza.
COSECHA DE LOS MICROORGANISMOS a. Después Después de 2 semanas se procedió a desenterrar las las tarrinas y se saco el arroz que fue impregnado de Microorganismos (MEAs). b. Luego de la cosecha se procedió a mezclar en un balde el arroz de todas las tarrinas cosechadas. OBTENCIÓN DE LA SOLUCIÓN SOLUCIÓN MADRE MADRE a. Se agrego 1 litro de agua limpia cocinada pero fresca a la cosecha de arroz con microorganismos. b. Se agrego 1 litro de melaza o miel de panela y se procedió a batir o licuar la mezcla por el espacio de 5 a 10 minutos. c. Se dejo fermentar la mezcla durante 30 días.
9.1.2. Recolección de nódulos de las leguminosas. MATERIALES: •
Fundas ziploc.
•
Guantes de caucho.
•
Papel aluminio.
•
Tijera de podar.
PROCEDIMIENTO: 1. Se eligió cuatro leguminosas: a. Kanumar(Mimosa púdica) b. Shuké(Erithrina poeppigiana) c. Leguminosa de flores amarillas. d. Sampi (Inga sp.) 2. Con la ayuda de los guantes de saco las plantas del suelo 3. Se recogieron los nódulos de las raíces de las 4 plantas. 4. Se coloco en las fundas ziploc envueltas en papel aluminio( se hace con el objetivo de que no se contaminen con otros microorganismos del ambiente) 5. Se procedió a refrigerar con el objeto de que no se mueran los microorganismos que se encuentran en los nódulos.
9.2.
FASE DE LABORATORIO.
9.2.1. Aislamiento de las bacterias de las trampas y de los Nódulos. MATERIALES: •
Tubos de ensayo de 10mL.
•
Solución madre de Microorganismos(2 galones)
•
Esterilizador
•
Asas
•
Nódulos de las plantas.
•
Cajas petri
•
500 mL Caldo peptonado
•
Cámara de flujo laminar.
•
Bisturí.
•
Papel aluminio.
•
Cámara de incubación
PROCEDIMIENTO.
Obtención de Bacterias: 1. Se procedió a desinfectar los nódulos con una solución de cloro al 1%. 2. S e cortó en pedazos pequeños los nódulos de cada especie de planta (separar en papel aluminio) y guardar guardar en el refrigerador por 30 min. 3. Se preparo 500ml de caldo peptonado, con los siguientes cálculos: 12.75g en 500ml de agua destilada. 4. Se disolvió bien y calentó en el microondas por 5 min.
5. Se dejó en el esterilizador por 30 min y se procedió a dejar enfriar por 20 min, 6. Una vez frio se coloco 10 ml de caldo peptonado en los tubos de ensayo y se etiquetó los tubos según la especie de la planta 7. Luego se procedió a colocar los nódulos con la espátula en los tubos respectivos y se dejó incubar por 24 horas a 35ºc, en la cámara de incubación. i ncubación.
Obtención de cultivo puro (Axenicos): 1. Se procedió a preparar el medio de cultivo (Agar) con tres repeticiones de cada uno de los nódulos de las plantas y de los dos envases de plástico (microorganismos (mi croorganismos del campo) con un total de 450 ml para 18 cajas petri (con 25 ml de Agar cada una). 2. Se esterilizo por 30min junto con los materiales a utilizar, se repartieron en las 18 cajas y se dejo enfriar en la cámara de flujo laminar. 3. Una vez gelificadas los medios con la ayuda del asa se procedió a picar las muestras y a estriarlas en las cajas con los medios. 4. Luego se coloco en la cámara de incubación por 24horas a 35ºc. 5. Luego de las 24 horas se sacaron las cajas y se obtuvieron las cepas según la forma y el color en otras 14 cajas con Agar. 6. Después de las 24 horas se obtuvieron solo las bacterias de una sola forma, un solo color y forma de crecimiento. 7. Estas bacterias axenicos (puro) se estrió de nuevo en los viales de 20ml para conservar como muestras para estudios posteriores mas profundos de cada especie de bacterias que albergan cada especie de leguminosas amazónicas.
9.3.
RESULTADOS.
De las 18 cepas que se listaron al inicio, 15 cepas mejores se escogieron por su rapidez en crecimiento y resistencia a las condiciones de manejo de cada una de ellas. Se llego a obtener 14 bacterias bacterias nitrificantes y 1 levadura levadura que transforman los azucares azucares en aminoácidos que estimulan en diversos procesos de desarrollo de las plantas.
10. CONCLUSIONES Se determinó que las bacterias que forman nódulos con las leguminosas : •
fijan nitrógeno atmosférico en nitrógeno aprovechable para las plantas.
•
Los nódulos son estructuras que se forman en las raíces de las leguminosas, alojan a las bacterias en su interior. En estas estructuras las bacterias se trasforman en bacteroides, que que son los encargados encargados de fijar el nitrógeno nitrógeno atmosférico.
•
Además los bacteroides llevan a cabo la fijación de nitrógeno porque son capaces de formar la enzima nitrogenasa que es responsable de la conversión del nitrógeno molecular en amonio.
•
No todas las especies especies de leguminosas leguminosas forman simbiosis simbiosis con un solo tipo de de bacteria, hongo o levadura. Las más conocidas son las que tienen valor comercial y alimentario para el ser humano o para el ganado, como el fríjol, la soja, la l a arveja, la lenteja, el haba y la alfalfa.
•
Entre las amazónicas ya determinadas están la erithrina sp, mimosa sp y inga sp
11. BIBLIOGRAFIA.
Huayamis J,2007.Las bacterias nitrificantes.Monografias.com nitrificantes.Monografias.com
[email protected] [email protected]
http/monografías.com/trabajos http/monografías.com/traba jos 10/clorofa/clorofa.schtml 10/clorofa/clorofa.schtml
Todo Micorrizas.2008.Wikipedia.com Micorrizas.2008.Wikipedia.com
