Protocolo F Nile Red

 

PROTOCOLO F

Detecció De tecció n de lípidos neutro s por medio de la té técnic cnic a de tinció n con Rojo de Nilo Nilo

INTRODUCCION El Rojo de Nilo (9-diethylamino-5H-benzo (alpha) phenoxazine-5-one), es un colorante liposoluble e intensamente fluorescente en determinadas longitudes de onda, que permite la detección de lípidos in situ, por medio de técnicas fluorométricas (Elsey et al., 2007; Chen et al., 2009).

OBJETIVO Evaluar la acumulación de lípidos neutros (LN), en células previamente inducidas por medio de privación de nitrógeno.

 

PROCEDIMIENTO 1) 1) Tomar  Tomar 1 – 3 mL de cultivo de microalgas. 2) 2)    Agrega  Agregarr 5 μM del colorante colorante Rojo de Nilo y un 20% DMSO (permite la permeabilización de las membranas y paredes celulares) 3) 3) Incubar  Incubar por 30 minutos en oscuridad. 4) 4) Para  Para una determinación cuantitativa, las células tratadas con Rojo de Nilo utilizar un espectrofluorómetro (excitar con luz polarizada a 486 nm (Shimadzu, model RF540), registra el pico de emisión a 556 nm. Evaluar la acumulación de lípidos en cultivos analizando el espectro de emisión entre 500 y 700 nm. 5) Para una determinación cualitativa, observar las células en microscopio de fluorecsencia.

MATERIALES Colorante Rojo de Nilo Microscopio de fluorescencia Espectrofluorometro

BIBLIOGRAFIA 1. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., & Hu, Q. (2009). A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of microbiological methods, 77(1), 41-47.

2. Elsey, D., Jameson, D., Raleigh, B., & Cooney, M. J. (2007). Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. Journal of microbiological methods , 68(3), 639-642.