Proteómica PP

 

PROTEÓMICA 

Curso: Bioquímica  Ano Letivo 2013/2014 Disciplina: Biologia Molecular Professor: Luka A. Clarke  Alunas: Inês Silva nº41698 e Patrícia Patrícia Marques nº42629

 

INTRODUÇÃO

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O que é a Proteómica? O princípio da Proteómica vs Genómica

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Técnicas usadas na Proteómica e respetivo equipamento

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 Análise e Interpretação de Resultados  Aplicações

 

O QUE É A PROTEÓMICA? 

É o estudo, em grande escala, de proteínas, nomeadamente, das suas estruturas e funções. f unções. Principais componentes das vias metabólicas fisiológicas das células

Proteína Proteoma Genoma

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 A Proteómica garante uma melhor compreensão do organismo, comparativamente à Genómica.

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O objetivo, atualmente, consiste em conhecer conjunto de todos os genes de um organismo ( Genoma) e compreender os mecanismos que se estabelecem entre as proteínas por eles codificadas (Proteoma).

 

O PRINCÍPIO DA PROTEÓMICA VS GENÓMICA 

Genómica:

- Determinar a estrutura das moléculas de DNA através da identificação da sequência dos componentes nucleótideos. Primeiro passo para a interpretação das informações genéticas codificadas no DNA, as quais determinam as características estruturais e funcionais de cada ser vivo.

Projeto Genoma:  Estrutural: - sequenciamento completo do genoma. 

Funcional:

-- Regiões codificantes de proteínas Funções celulares, metabólicas fisiológicas.

e

 

O PRINCÍPIO DA PROTEÓMICA VS GENÓMICA 

Engenharia Genética – “onde as diferenças entre espécies desaparecem” 

É possível devido: - Ao código genético (DNA): é a fonte de informações para a formação do organismo; - À transcrição: transcrição da informação genética contida no DNA para o RNA, que serve de molde para a tradução; - À tradução: tradução de informações genéticas para uma estrutura proteica funcional.

Sequenciação  Comparação com bancos de dados  Verif Verificação icação de homologia com genes previamente sequenciados

 

O PRINCÍPIO DA PROTEÓMICA VS GENÓMICA Pós-Genómica 

Os dados fornecidos pela Genómica ainda precisam de ser “decifrados”  Função das proteínas? Proteómica

Genómica Genómica Funcional Proteómic Estrutural a DNACristalografia Eletroforese 2D Microarra de raio x Espectrometria de y Massa NMR Sequenciamento de Proteína Sequência  Forma  Função

 

O PRINCÍPIO DA PROTEÓMICA VS GENÓMICA 

Um gene  Múltiplas proteínas - Dif Difere erente ntess combi combinaç nações ões de exõ exões es por s p l i c i n g   alternativo  alternativo - Pro roce cess ssam amen entto pós-traducional (ex. clivagem de pró-peptídeos) - Modificações pós-traducionais (ex. glicosilação, acetilação) - Mo Modi dififica caçõ ções es no dog dogma ma cent centra ral:l: DNA  –  RNA  – Proteínas 

É importante analisar produtos provenientes do gene, e nãoostanto o gene em si

 

O PRINCÍPIO DA PROTEÓMICA VS GENÓMICA 

Vantagens centrais da Proteómica: - Possibilidade de trabalhar ao nível dos produtos génicos, que são expressos e dão origem

a um produto final. 

Limitações centrais da Proteómica: - Apenas uma fração de proteínas sintetizadas pode ser detetada numa análise

experimental. 

Pré-requisito básico da Proteómica: - O genoma sequenciado do organismo em estudo ou, pelo menos, uma porção de cDNAs.

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA 

Objetivos: - O estudo da expressão génica, através de certas técnicas, permite obter um perfil molecular, bem

como identificar importantes alterações que ocorrem ao nível do RNA. Nos estudos proteómicos, podem ser combinadas diferentes metodologias.  As mais comuns envolvem: - A ext extraç ração ão de de prote proteína ínass da amo amostr stra a - Sep Separa aração ção por ele eletro trofor forese ese uni (1D (1D)) ou bidimensional (2D) - Cro Cromat matogr ografi afia a liqu liquida ida;; Ion Ioniza ização ção;; Fragmentação -- Anál An ális e deteç ão de pépt péptid idos os Aná nál lise ise is e ede dedet daeção da dos do s de

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA 

 As metodologias empregues na Proteómica Proteómica podem ser classificadas em dois tipos: bottom-up (ou shotgun) e top-down

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Bottom-up  – inclui separação por cromatografia líquida dos péptidos obtidos após a digestão por

tripsina de soluções proteicas complexas, seguida da análise por espectrometria de massa (MS). 

Sensibilidade e reprodutibilidade reprodutibilidade (mesmo para proteomas complexos)

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Modificações pós-traducionais não são reconhecidas; Alguns péptidos podem ser perdidos durante a cromatografia

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Top-down  – processo no qual as proteínas intactas são submetidas à análise por MS.

 A combinação destes métodos com outros processos pode de enriquecer a amostraou contendo compostos baixa abundância de organelos celulares de interesse

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

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Separação de proteínas por eletroforese uni e bidimensional Eletroforese uni (1D) e bidimensional (2D)

 As moléculas têm de ser inici inicialmente almente isoladas a partir de materiais biológicos

 

O procedimento de extração variamas, de acordo com dos o tipo e origem das amostras biológicas, na maioria casos, as proteínas precisam de ser solubilizadas, desagregadas,  desnaturadas e submetidas ao tratamento de agentes redutores.

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

Eletroforese bidimensional (2D)

 As proteínas são separadas em 2 etapas consecutivas: consecutivas: Focalização Isoelétrica (IEF) e SDS-PAGE

Focalização Isoelétrica:  

Gel com gradiente de pH imobilizado  As moléculas migram através do gel até atingirem o ponto isoelétrico (ponto no qual a sua carga é igual a zero)

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

Eletroforese bidimensional (2D)

SDS-PAGE: 



Eletroforese em direção perpendicular à IEF, em gel SDS-PAGE – dodecil sulfato de sódio  As moléculas são separadas de acordo com a sua massa molecular

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

Eletroforese bidimensional (2D)

Eletroforese 1D – bandas Eletroforese 2D – spots proteicos

Corados com Azul de Coomassie, Nitrato de prata e outros corantes comerciais



No caso de 2-DE, podem ser visualizados entre 100 a 2000 pontos (spots), cada um contendo proteína(s).



Podem ser detetadas modificações pós-traducionais na forma de uma linhagem de spots no eixo horizontal ou vertical.

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 A partir de ferramentas de informática, informática, o material de fundo (background ) é subtraído, os spots comparados e os dados normalizados e analisados estatisticamente para a quantificação de volumes proteicos ou intensidades.

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

Eletroforese bidimensional (2D)

Vantagens: 

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Desvantagens:

Possui uma boa resolução

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Fornece informações acerca das proteínas, tais como as modificações póstraducionais

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Presença de proteínas em elevadas concentrações, o que dificulta a migração eletroforética das menos abundantes Dificuldade na extração de proteínas intactas do gel para posterior análise topdown

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Limitado pelo range de pH

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

Fracionamento por Cromatografia Líquida e identificação por Espectroscopia de Massa

Cromatografia Líquida (IC): 

O analito é dissolvido numa fase líquida sem interagir quimicamente com a mesma

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 A fase líquida contacta com uma fase fase estacionária, geralmente empacotada em colunas

 Após a caracterizaçã caracterização o por massa molecular e purificados ou fracionados por cromatografia, os analitos ainda necessitam de ser identificados Espectroscopia de massa

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA

Espectroscopia de massa: 

Consiste na ionização de um composto e na avaliação da razão massa/carga (m/z) dos iões



Composto por uma fonte de ionização, um ou mais analisadores  de massas e um detetor

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

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Métodos de Ionização  Atualmente, existemna 2 métodos principais de ionização utilizados Proteómica: MALDI - Em Empre pregu gue e em am amos ostr tras as no no esta estado do sólido ESI - Em Empre pregu gue e em am amos ostr tras as no no esta estado do líquido

 

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

Tipos de analisadores

TOF -analógico, O detetor converte o sinal da passagem do ião em sinal . O que é lido e interpretado por um computador. computador resultado final traduz-se num gráfico de m/z vs intensidade iónica. Quadrupolo - Apr Aprese esenta nta um um conjun conjunto to de 4 elét elétrod rodos os em bast bastão ão que que funcionam como filtros de massas. Entre os elétrodos, existe um campo elétrico que assegura que somente os iões de uma certa m/z sigam a trajetória até ao detetor. Ion trap

-deFiltram e aprisionam, num campo elétrico tridimensional, os iões interesse, que são gradualmente libertados, de acordo com a

m/z crescente.  

TÉCNICAS DA PROTEÓMICA o

Identificação de proteínas

Determinação da m/z do péptido intacto

Os péptidosà fragmentação mais abundantes são selecionados e submetidos por colisão  a partir de um gás inerte (CID) ou por transferência de eletrões (ETD)  A fragmentação do péptido ocorre entre o O do grupo carbonilo e o N da amida, o que gera 2 grupos de iões designados y e b

 A avaliação avaliação dos fragmentos fragmentos obtidos obtidos com tamanhos tamanhos crescentes a partir do do N terminal (série b) ou C terminal (série y) permite a dedução da sequência do péptido, sendo possível a identificação da proteína.

 

 APLICAÇÕES  A análise do proteoma é incompleta incompleta em: • Células simples, principalmente em relação a proteínas de baixa abundância (recetores, transdutores de sinal e reguladores) • Células básicas e hidrófobas; • Células de membrana; • Células com massa molecular acima de 150kDa ou abaixo de 10 kDa.

Quais são os benefícios dos estudos proteómicos para o controlo de doenças humanas? • Caracterização parcial de proteínas de diferentes tecidos; • Caracterização parcial de condições; • Caracterização parcial de subproteomas (ex. fosfoproteinas41 e o de glicoproteinas42).

Biomarcadores específicos e sensíveis

Não são facilmente identificados por abordagens proteómicas, sendo que as análises de determinadas doenças dão

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Cancro da cabeça e pescoço; Cancro da mama; Cancro do colon; Cancro do ovário.

resultados semelhantes.  

 APLICAÇÕES Os tecidos afetados pela maioria das doenças humanas não são de fácil acesso, e por isso, não são utilizados nas análises de rotina.

Limitação da análise: Heterogeneidade celular 

resoluçã o

resolução

Fluidos corporais

Número reduzido de células • Manuseio extra da Proteínas libertadas no amostra. Diagnóstico sangue por tecidos doentes

Microdissecação por laser identifica m

 problema •

 

 APLICAÇÕES Problemas da utilização de fluidos corporais: Complexidade do material biológico; Característica dinâmica da composição proteica;  

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Necessidade de analisar um grande número de indivíduos para determinar a variabilidade intra e interindividual de um potencial marcador; No desenvolvimento de testes clínicos, um marcador isolado dificilmente terá sensibilidade e especificidade suficiente para se proceder a um diagnóstico  necessário um painel de proteínas associadas a condições específicas.

Exemplos de fluidos corporais que diagnosticam determinadas doenças: Urina  doença de Anderson-Fabry; Líquido cefalorraquidiano  esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, Creutzfeldt-Jakob e Parkinson; Líquido broncoalveolar  doença pulmonar obstrutiva crónica; 

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Líquido sinovial  osteoartitre; Lágrima  ceratocone; →

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 Aspirado mamilar

 cancro da mama.

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BIBLIOGRAFIA 

BARBOSA, Eduardo; VIDOTTO, Alessandra; POLACHINI, Giovana; HENRIQUES, Tiago; Tiago; TROVÓ DE MARQUI, Alessandra; TRAJARA, Eloiza. Proteómica: metodologias e aplicações no estudo de doenças humanas. Elsevier Editora Ltda, 2012.