Proteínas Iic

PROTEÍNAS II – PARTE

I.

OBJETIVOS:   

Preparar caseína. Realizar pruebas características de la caseína. Realizar pruebas con proteínas coagulables.

II. PRINCIPIOS TEÓRICOS: La caseína es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno. Las caseínas es un conjunto heterogéneo de proteínas por lo que es difícil fijar una definición. Sin embargo, todas las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común: precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque las proteínas que se denominan caseínas son específicas de cada especie, se clasifican en los siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electroforética: αs1-caseína, αs2-caseína, β-caseína y κ-caseína. Propiedades químicas y físicas de las caseínas A diferencia de muchas otras proteínas, incluso del queso, las caseínas no precipitan por acción del calor. Por el contrario, precipita por la acción de una enzima proteasa presente en el estómago de los mamíferos llamada renina y forma un precipitado denominado paracaseína. Si la precipitación se realiza por la acción de ácidos, se le llama caseína ácida. En la elaboración de los quesos tienen lugar ambos tipos de precipitaciones. La secuencia aminoacídica de la caseína contiene un número inusual de residuos del aminoácido prolina: entre 10 en la α-caseína y 35 en la β-caseína. Como resultado, las caseínas son relativamente hidrofóbicas (poco soluble en agua) y carecen de estructura secundaria o terciaria bien definidas. En la leche se encuentra como suspensión de partículas que asemeja a las micelas de surfactantes (pequeñas esferas hidrofílicas en el exterior e hidrófobicas en el interior). Estas micelas de caseína se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofóbicas.

III. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS: III.1.       

Materiales:

Tubos de ensayo Vasos de precipitado de 50 ml Una gradilla para tubos de ensayo Un erlenmeyer de 250 ml Un erlenmeyer de 150 ml Probeta de 50 ml Dos pipetas graduadas de 5.0 ml

      

Dos pipetas graduadas de 1.0 ml Agitador de vidrio Embudo de vidrio mediano Vidrio de reloj Papel filtro Dos goteros de plástico Pinzas para tubos de ensayo

    

HNO3 (c) Hidróxido de calcio Reactivo de Biuret Reactivo de Fehling A Reactivo de Fehling B

 3.2 Reactivos:      

Agua destilada Ácido acético Carbonato de calcio HCl al 2% NaOH al 1% NaCl al 10%

  3.3 EQUIPOS:  Máquina de centrifugación  IV. PARTE EXPERIMENTAL:  1. AISLAMIENTO DE LA CASEÍNA:  a) En un vaso de precipitados de 250 ml se colocaron 100 ml de leche pura de vaca, a la cual, previamente, se eliminó la mayor cantidad de grasa posible, mediante centrifugación durante 5 minutos a 3000 rpm. A continuación, se midió el pH de la leche y por medio de la acidificación con HCl al 20% se llevo el pH de la misma hasta 4.0. b) Posteriormente se dejó reposar alrededor de 15 minutos aproximadamente hasta observar grumos en la superficie. Inmediatamente después, el precipitado se repartió en cuatro tubos de centrifuga; se centrifugó durante 10 minutos a 2000 rpm. c) Al término de la centrifugación se retiraron los tubos y se separó en un tubo de ensayo el líquido de la superficie y se guardó. Posteriormente, la leche descremada se puso en un vaso de precipitado y se homogenizo con 20 ml de agua destilada, la solución se colocó en un solo tubo de centrifuga y en otro tubo agua para equilibrar con un mismo peso, se dejo 10 minutos a 2000 rpm, con el objeto de eliminar el HCl. d) Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y a la fase sólida (leche descremada) se agregaron 10 ml de etanol, se homogenizó con una varilla de vidrio y al terminar se centrifugó a 10 minutos a 2000rpm.  e) De la misma manera, se eliminó el sobrenadante y a la fase sólida se le agregaron 5 ml de acido acético y 5ml de éter, se homogenizó, al terminar se colocó en la centrifuga a 10 min a 2000 rpm. Por último se eliminó el sobrenadante y el precipitado se guardó hasta que se secara; se peso el precipitado seco. f) Observamos el aspecto de la caseína, pesar y calcular el porcentaje de caseína en la leche experimentada.  AÑADIMOS HCl HASTA QUE TENGA UN pH DE 4.0

SE SEPARA EL LIQUIDO DE LA SUPERFICIE Y SE SE ELIMINA EL 15 SOBRENADA

min LECHE PURA DE VACA

CENTRIFUGAMO S POR 5 Min A 3000 rpm

 



CENTRIFUGAMO S POR 10 Min A 2000 rpm SE ELIMINA EL SOBRENADA

LECHE SE DESCREMAD PASA A A CON 20ml UN DE AGUA TUBO DESTILADA DE

EQUILIBR A-MOS CON AGUA CON EL MISMO PESO EN UN TUBO

SE ELIMINA EL EL PRECIPITAD SOBRENADA O SE GUARDÓ HASTA QUE



CENTRIFUGAMO S POR 10 Min A 2000 rpm

FASE CENTRIFUGA SÓLIDA + MOS POR 10 10 ml de Min A 2000 rpm

FASE SÓLIDA + 5 ml de ÁCIDO ACÉTICO + 5  ml DE ÉTER

CENTRIFUGA MOS POR 10 Min A 2000 rpm

 2. PROPIEDADES Y PRUEBAS CARACTERISTICAS DE LA CASEÍNA 

2.1. Composición elemental: presencia de C, H, O y N

 En un tubo de ensayo pequeño limpio y seco pusimos 0.5 g de caseína en polvo y cogiendo con una pinza lo calentamos directamente con la llama suave del mechero. Observamos y tomamos nota del cambio de color de la caseína.  CASEÍN A EN POLVO

 

HUMOS BLANQUECI NOS GOTAS DE AGUA

 

RESIDU OS DE COLOR NEGRO

  

2.2. Solubilidad 1. Marcamos 5 tunos de ensayo como: A, B, C, D y E. Pusimos a cada tubo una pequeña porción de caseína. 2. Agregamos a los tubos 5 ml de: al tubo A, agua destilada, al B, cloruro de sodio al 10%, al C, solución de HCl al 0.2%, al D, solución de NaOH al 1% y al E, solución saturada de hidróxido de calcio. Agitamos los tubos y anotamos las observaciones relativas a la solubilidad de la caseína.



 

CASEÍN A EN POLVO

5 ml de AGUA DESTILA DA

INSOLUB LE

CASEÍN A EN POLVO

5 ml de CLORUR O DE SODIO AL 10%

INSOLUB LE

    CASEÍN A EN POLVO

 

5 ml de ÁCIDO CLORHIDRI CO AL

INSOLUB LE

 CASEÍN A EN POLVO

  

CASEÍN A EN N POLVO

ES: 

5 ml de HIDRÓXID O DE SODIO AL 1%

SOLUBLE

5 ml de HIDRÓXI DO DE CALCIO

INSOLUB LE

2.3. Prueba del Biuret: CASEÍN

 De acuerdo a la prueba de solubilidad, se A tomo el tubo D en el cual es más soluble la caseína y de acuerdo a ello, realizamos en esta solución la prueba del Biuret. Observamos y tomamos nota.  

 REACCIO

2.4. Prueba Xantoproteica:

+ NaOH al 1%

3 GOTAS DE

CuSO4

PRUEBA POSITIVA

 Efectuamos la prueba Xantoproteica en una pequeña porción de caseína. Observamos y tomamos nota. 



+

 CASEÍN A



PRUEB A POSITI

 

3. PROTEÍNAS COAGULABLES:  a) En un tubo de ensayo mediano vertimos 5 ml de suero obtenido en 1c) y lo neutralizamos con unas gotas de solución de NaOH al 1% (usamos papel indicador). Luego añadimos unas cuantas gotas de ácido acético hasta una ligera acidez. Calentamos hasta ebullición. Observamos y tomamos nota. b) Seguimos calentando el tubo hasta reducir su volumen a la mitad, y dejamos decantar. Separamos el sólido obtenido y efectuamos la prueba de Fehling y la Xantoproteica, por separado. Anotamos nuestras observaciones. 

5 gotas de NaOH al 1%



3 gotas de Ácido acético

   SUER O

 TOMA UN COLOR

SUER O

 V.

REACTIV O DE FEHLING



RESULTADOS:  1. AISLAMIENTO DE LA CASEÍNA

ÁCIDO NÍTRIC O

  SUER O

TOMA UN COLOR AMARILL



Se obtuvieron 0.8 gramos de caseína de 100 ml (equivalentes a 103 g si

consideramos su densidad de 1,030 g/ml a 15°C) de leche pura de vaca, por lo que se el rendimiento fue de 0.77% según la siguiente fórmula:  

Rendi



miento

=

Peso seco de la caseína



X 10 0



g de leche

%

utilizados

=





X 

0.

=

1

0.



0

77

10

0

%

%  El rendimiento de caseína obtenido en esta práctica es muy bajo al rendimiento reportado en la literatura (30 g por litro, 3%), es probable que esto se deba a que no se dejó que la caseína precipitara completamente o, a la eliminación del sobrenadante en cada una de las centrifugaciones, proceso en el cual se pudieron arrastrar cantidades considerables de proteína junto el agua utilizada para eliminar el HCl.  Cabe mencionar que la proteína no se precipitó a pH de 4.6, solamente se observaron pequeños grumos a pH de 4.0, fue entonces cuando se llevo a cabo la primera centrifugación. 

Los solventes orgánicos volátiles se utilizaron para eliminar el resto de

grasa de la caseína. 2. PROPIEDADES Y PRUEBAS CARACTERISTICAS DE LAS PROTEÍNAS:  2.1. Composición elemental: presencia de C, H, O y N  Al someter el tubo de ensayo que contenía caseína sobre la llama suave del mechero se formo un residuo de color negruzco indicando la presencia de Carbono, también se observo gotas de agua en las paredes del tubo de ensayo lo que indica la presencia de Hidrógeno y Oxígeno, y por último se observo el desprendimiento de humos blanquecinos con un olor característico “a cuerno quemado” lo que indica la presencia de Nitrógeno. 2.2. Solubilidad  De los 5 tubos de ensayos marcados como A, B, C, D y E, solo fue soluble el tubo D, que contenía caseína con Hidróxido de Sodio al 1%; los demás tubos de ensayo nos dieron pruebas negativas con respecto a la solubilidad. 2.3. Prueba de Biuret FORMULA QUÍMICA DEL BIURET

 Nos dio una reacción positiva, ya que el Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.  Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. 2.4. Prueba Xantoproteica  Nos dio una reacción positiva, ya que La reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la cantidad de proteína soluble en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro. 3. PROTEÍNAS COAGULABLES  Al agregar NaOH al suero obtenido de la leche este cambio de color a un verde indico, indicando que fue neutralizado, pero al agregar ácido acético formo un cuajo espeso blanquecino al fondo del tubo de ensayo, se separo el liquido que está en la superficie y se efectuó la prueba de Fehling, dándonos de un color azul a un color rojo, lo que nos indica la presencia de glúcidos tales como: lactosa y glucosa; luego realizamos la prueba de Xantoproteica y nos dio una coloración amarilla indicando una prueba positiva. VI. CONCLUSIONES:   Es posible la purificación parcial y el aislamiento de la caseína de la leche, utilizando la poca solubilidad que esta proteína tiene cuando se le lleva hasta su punto isoeléctrico y la rapidez de sedimentación de la misma al utilizar la centrifuga. No obstante, el rendimiento puede ser variado si se considera que los métodos de purificación son también variados.  Al someter a la caseína al calor suave del mechero se puede observar claramente su composición elemental que son: C, H, O y N, a través del residuo negruzco, los humos blanquecinos y las gotas de agua en las paredes del tubo de ensayo que se desprenden al someterlo a calentamiento suave.  La caseína es una proteína y fue más soluble con NaOH, es decir es soluble en solución alcalina.  La reacción de Biuret es una reacción que sirve para identificar los enlaces peptídicos de las proteínas, ya que en las pruebas realizadas nos dio positiva dándonos coloraciones de color morado claro.

 La reacción de Xantoproteica sirve para detectar compuestos aromáticos presentes en la estructura de proteínas, además de que las proteínas están formadas por aminoácidos, ya que en las pruebas realizadas nos dio positivas dándonos un color amarillo.  VII. CUESTIONARIO  1. Responda brevemente: a) ¿Qué son: albúminas, globulinas, seudoglobulinas y fosfoproteínas?   ALBUMINAS:  La albúmina es una proteína que se encuentra abundantemente en la sangre del ser humano y es sintetizada en el hígado, representando el 54,31% de la proteína plasmática. Normalmente tiene una presencia en sangre humana de 3,5 a 5 gramos por decilitro. FUNCIONES:  - Permite mantener la presión oncótica, fundamental para la correcta distribución de los líquidos corporales - entre compartimento intravascular y el extravascular, localizado entre los tejidos. - Transporta las hormonas tiroideas y las hormonas liposolubles. - Transporta ácidos grasos libres y la bilirrubina no conjugada. - Transporta muchos fármacos. - Controla el pH.  TIPOS DE ALBUMINAS:  Seroalbúmina: Es la proteína del suero sanguíneo.  Ovoalbúmina: Es la albúmina de la clara del huevo.  Lactoalbúmina: Es la albúmina de la leche. 

GLOBULINAS:  Las globulinas son un grupo de proteínas insolubles en agua que se encuentran en todos los animales y vegetales. Entre las globulinas más importantes destacan las seroglobulinas (de la sangre), las lactoglobulinas (de la leche), las ovoglobulinas (del huevo), la legúmina, el fibrinógeno, los anticuerpos (α-globulinas) y numerosas proteínas de las semillas. Las globulinas son un importante componente de la sangre, específicamente del plasma. Éstas se pueden dividir en varios grupos.  Principales grupos de globulinas:  globulinas alfa 1 y 2

 globulinas beta  globulinas gamma 

SEUDOGLOBULINAS:  Son proteínas solubles que pueden precipitarse de una solución acuosa por saturación de uno a tres cuartos con una sal acida. Las seudoglobulinas son menos frecuentes. La podemos encontrar en el suero de la leche se coagulan por calentamiento.



FOSFOPROTEÍNAS:  Proteínas combinadas con ácido fosfórico, o un radical que contiene fósforo que no sea un fosfolípido ni ácido nucleico. Ejemplo: caseína.

b) ¿en qué consiste la desnaturalización y la precipitación de proteínas?  Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.  La precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización y se dice entonces que la proteína se encuentra desnaturalizada. Ver figura.            c) ¿A qué se llama punto isoeléctrico?  El punto isoeléctrico es el pH al que una sustancia anfótera tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas.

A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se deben utilizar los pKa.    (Los pKa a considerar para esta ecuación, en una tabla de pH, son los que contienen a la especie química con carga igual a cero, cuando tienen más de un pKa).  Las moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es prácticamente nulo, se le denomina punto isoeléctrico. 2. Exponga en forma ordenada todas sus observaciones sobre:  a) Preparación de la caseína. ¿Qué es la caseína y que propiedades presenta? ¿Para qué sirve? ¿Qué es suero obtenido?  La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas de la leche y el 2.7% en la composición de la leche líquida. Y la propiedad que se vio claramente fue que las caseínas precipitan a pH 4,6, que es su punto isoeléctrico (a temperatura ambiente)        E l suero de leche es un líquido obtenido en el proceso de fabricación del queso y de la caseína, después de la separación de la cuajada o fase micelar. Sus características corresponden a un líquido fluido, de color verdoso amarillento, turbio, de sabor fresco,

débilmente dulce, de carácter ácido, con un contenido de nutrientes o extracto seco del 5.5% al 7% provenientes de la leche. b) ¿Qué elementos se detectaron en la caseína? ¿Cómo los certifica? ¿Qué ensayo realizaría para detectar la presencia de azufre?  Se detectaron el C, H, O y N, esto se vio claramente al someter a la caseína a la llama suave del mechero, se produjo un residuo negruzco (carbono), gotitas de agua en las paredes del tubo de ensayo (oxigeno e hidrogeno) y la presencia de humos blanquecinos (nitrógeno) y si tendríamos que detectar la presencia de azufre tendríamos que realizar la reacción de la cistina, que consiste en añadir 2 gotas de solución de acetato de plomo. Se obtiene un precipitado. Luego añadimos solución de hidróxido de Sodio para disolver este y luego hervir. La solución se torna pardo obscura (debido a la formación de sulfuro de plomo). c) ¿En cuál de las soluciones empleadas fue más soluble la caseína? 

En la solución alcalina de hidróxido de Sodio al 1% d) ¿Fueron positivas las reacciones del Biuret y la Xantoproteica? Escriba sus reacciones correspondientes 

REACCION DE BIURET: la prueba fue positiva y su reacción esta dado por:

 CASEÍN A HIDRÓXID SULFAT O DE O DE SODIO CuSO4 NaO

Na2 SO4 SULFATO DE SODIO



COMPLEJO TETRACOORDINADO DE COBRE

REACCION DE XANTOPROTEICA: la prueba fue positiva y su reacción esta dado por:

 3. Exponga sus observaciones y deducciones de los ensayos sobre las proteínas coagulables. Escriba las reacciones de Fehling y 2HN Xantoproteica. NaO O3  REACCIÓN FEHLING:

DERIVADO

DE

DERIVADO

 Al someter el suero obtenido con el licor de fehling nos da una coloración rojiza lo que nos indica la presencia de glúcidos: como la lactosa y la glucosa.

   PROTEÍN



REACTIVO DE FEHLING

  

LACTO SA



PRECIPITADO ROJO LADRILLO GLUCO SA

 

REACCIÓN DE XANTOPROTEICA:

 Al tubo de ensayo al agregarle ácido nítrico e hidróxido de sodio notamos que nos da una coloración amarillenta al ppdo.     VIII.

PROTEÍN

ÁCIDO COMPLEJO

BIBLIOGRAFIAS:  Guía de prácticas: PROTEÍNAS II, proporcionada por el profesor Mgr.Raúl Paredes Medina    

 



  

FACULTAD

:

INGENIERIA

ESCUELA

:

INGENIERÍA QUÍMICA

CURSO

:

BIOQUIMICA

 FLORES

NOMBRE

:

BRYAN MACHICADO

 MEDINA

PROFESOR

:

Ing. RAUL PAREDES



AÑO

:

SEGUNDO



FECHA DE ENTREGA

:

10 DE ENERO DEL 2012

       

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TACNA - PERU