Propagacion de Plantas Micropropagacion

 

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Tarea 1: Micropropagación de plantas 1. Micropropagación de plantas La microp micropropa ropagaci gación ón consist consiste e en la prop propaga agació ción n de planta plantass en un ambien ambiente te artificial controlado, empleando medio de cultivo adecuado. El es así una herramienta muy útil en losunprogramas de mejoramiento, yacultivo que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de tipotencia que tienen las células vegetales; esto es la capacidad de re rege gene nera rarr una una plan planta ta comp comple leta ta cuan cuando do está están n suje sujeta tass a los los estí estímu mulo loss adecuados. Así, las células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posea y al estímulo que reciban. Dependiendo de las características de la planta que se pretenda propagar y del objetivo perseguido, la micropropagación puede realizarse a través de diferentes vías de regeneración (Olmos, (2016)).

2. Etapas de micropropagación La microp microprop ropagac agación ión pres present enta a cuat cuatro ro etapas etapas pri princip ncipales ales:: est establ ablecim ecimien iento to del cultiv cul tivo, o, desarro desarrollo llo y mul multip tiplic licació ación n de vástagos vástagos o emb embrio riones nes,, enraiz enraizami amient ento o y aclimatación de las plántulas. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0) que es la etapa de preparación de los explantos para el establecimiento (Olmos, (2016)). 

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Et Etap apaa 0: Prep Prepar arac ació ión n del del mate materi rial al ve vege geta tal: l:  la corr correc ecta ta elec elecci ción ón y preparación del explanto incide directamente sobre la calidad del mismo y su re resp spue uest sta a fr fren ente te a los los do doss pr prin inci cipa pale less pr prob oble lema mass que que afec afecta tan n al establecimiento delexplanto. cultivo, que la contaminación microorganismos y la oxidación del Losson factores que influyencon sobre la calidad del explanto son: el tipo de órgano que sirve como explanto, la edad ontogénica y fisiológica del mismo, la estación en la cual se colecta el material vegetal, el tamaño y el estado sanitario general de la planta donante. La planta donante debe elegirse en base a una selección masal positiva para las características agronómicas deseables (Olmos, (2016)). objetiv etivo o de es esta ta etap etapa a es Etapa Eta pa 1: Establ Estableci ecimie miento nto del cul cultiv tivo o : el obj establecer cultivos viables y axénicos. El éxito está determinado por la calidad del explanto a utilizar. En esta etapa los principales procesos a controlar son la selección, el aislamiento y la esterilización de los explantos. Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son loso obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes, ya sean yemas axilares

 

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adventicias, embriones o semillas en plantas herbáceas y aquellos tejidos meristemáticos que determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las plantas leñosas (Olmos, (2016)). Etapa 2: Multiplicación: el objetivo de esta etapa es mantener y aumentar  la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y pod oder er des esttinar inar part parte e de ello elloss a la sigui iguien ente te etap etapa a de pr prod oduc ucci ción ón (enraizamiento, bulbificación, entre otros) (Olmos, (2016)). Etapa 3: Enraizamiento y aclimatización:  En esta etapa se produce la form ormac ació ión n de ra raííce cess ad adve vent ntic icia ias. s. En las espe especi cies es he herb rbác ácea eass es relativamente fácil mientras que en muchas especies leñosas resulta más complicada por su limitada capacidad rizogénica. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de substratos y reguladores de crecimiento, princi pri ncipal palmen mente te aux auxina inas, s, par para a pro promove moverr la riz rizogé ogénesi nesis. s. Es conven convenien iente te cont contar ar con con inst instal alac acio ione ness de inve invern rnad ader ero o o cáma cámara rass de cr crec ecim imie ient nto o adecuadas para brindar temperatura y humedad relativa moderadas que permitan lograr la rusticación de las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes substratos, mezclas de tierra y aren arena a y/o y/o ab abon onos os,, los los cua ualles co conv nvie iene nen n qu que e estén stén deb ebid idam amen entte desi de sinf nfect ectad ados os,, pa para ra lo logra grarr un una a bu buen ena a acli aclima matitiza zaci ción ón de la lass plánt plántul ulas as (Olmos, (2016)).

3. Componentes de medio de cultivo Los me Los medi dios os de cu cultltiv ivo o in incl cluye uyen n ag agua, ua, una una fu fuent ente e de ca carb rbono ono,, co comp mpue uest stos os inorgánicos (sales minerales), vitaminas, hormonas y factores reguladores del crecimi crec imient ento o (Mal (Malajo ajovic vich, h, (20 (2016)). 16)). En la fig figura ura se mue muestr stra a los com compone ponente ntess y caracteristicas y ejemplos.

 

Figura 1. Componentes de medio de cultivo para células vegetales. Fuente: (Malajovich, (2016))

4. Organogénesis directa e indirecta La orga organo nogé géne nesi siss es el pr proc oces eso o de re rege gene nera raci ción ón qu que e ocur ocurre re me medi dian ante te la formación de órganos, como vástagos, raíces, flores, hojas, etc. Puede ser directa si ocurre sin la formación previa de callo o indirecta si se requiere la formación previa de callo (Alvez, 2012). El callo es un tejido no organizado y poco diferenciado formado por células en proliferación que se producen tanto in vivo como in vitro. Estos últimos pueden ser  de dos tipos según su consistencia. a) friables, formados por células unidas en forma laxa, cuyas paredes celulares presentan mayores concentraciones relativas de hemicelulosa y pectina que de celulosa. b) compactos formados por células

 

fu fuert ertem ement ente e un unid idas as en entr tre e sí, sí, cu cuya yass pa pared redes es ce celu lula lare ress pre prese sent ntan an mayor mayores es concentraciones de celulosa que de hemicelulosa y pectinas (Alvez, 2012). Los callos in vitro en general se forman a partir de explantes cultivados en presencia de altas concentraciones de auxinas (Alvez, 2012). La organogénesis indirecta tiene interés en programas de selección en los que se requiere variabilidad genética adicional a la ya existente en la naturaleza como por  ejemplo la resistencia a antibióticos, herbicidas, sequía, etc. La organogénesis directa se utiliza en la micropropagación de plantas élites, que son las de mejores caracteristicas agronómicas (Alvez, 2012).

5. Cultivo de meristemos Técnica de cultivo que consiste en aislar asépticamente la región meristemática con 1-3 de los primordios foliares más jóvenes e implantarla en un medio de cultivo estéril, con el propósito de inducir la diferenciación de células y tejidos en planta pla ntass com comple pletas tas,, med median iante te la utiliz utilizaci ación ón de med medios ios de cul cultiv tivos os adecuado adecuadoss (Hurtado, 1987). En los primeros estadios del desarrollo embrionario vegetal la división celular tiene lugar en todo el organismo, pero a medida que el embrión se desarrolla y se transforma en una planta adulta la adición de nuevas células se restringe a ciertas partes de la misma, mientras que el resto de la planta se especializa en otras activ act ivida idades des espe especí cífifica cas. s. Es Esto toss gr grup upos os de cé célu lula lass qu que e re retitien enen en su acti activi vida dad d embrionaria durante toda la vida de la planta se denominan meristemos. Los meri me rist stem emos os in incl cluye uyen n me meri rist stem emos os de ra raíz íz,, de ta tallllo o (p (prin rinci cipal pales es y la late teral rales es)) e interca intercalar lares, es, así como como tam tambié bién n el engr engrosam osamien iento to de merist meristemo emoss prim primari arios os y meristemos secundarios, como lo son el felógeno y el cambium. El meristemo apical api cal de tallo tallo da lug lugar ar a diverso diversoss tip tipos os de cél célula ulas, s, tejidos tejidos y órga órganos nos (Hurtado, 1987).. 1987) Los meristemos apicales han sido los inoculos más efectivos para la producción de plan planta tass comp comple leta tass en una una am ampl plia ia ga gama ma de cult cultiv ivos os econ económ ómic icam amen ente te importantes. Si se cultivan en un medio adecuado, los meristemos pueden regenerar plántulas completas más rápidamente que los tejidos de otras fuentes; las planta pla ntass reg regene enerada radass usualme usualmente nte ret retien ienen en las car caract acterí erísti sticas cas gené genétic ticas as de los pr prog oge enitores res, lo qu que e se de debe be a la naturaleza dipl plo oide de las cé céllulas meristemáticas. Además, dado que los meristemos son tejidos no diferenciados, entonces el paso de desdiferenciación celular se obvia en estos casos y se va directamente a la diferenciación celular (Hurtado, 1987).

6. Cultivo de anteras

 

Consiste en el cultivo de anteras enteras con polen inmaduro, el polen se divide para formar embriones o callos. Cuando estos se transfieren a laos medios de regeneración regener ación se forma plantas. Por lo genera generall el culti cultivo vo de anteras se utiliza para la ob obtten enci ción ón de plant lantas as haplo aploid ides es.. Es Esttas se re rege gene nera ran n a tra ravé véss de la embr em brio iogé géne nesi siss somá somátitica ca a pa part rtir ir de dell pole polen, n, dire direct ctam amen ente te o po porr la vía vía de organogénesis a partir de un callo. Algunas veces se cultiva el polen una vez aislado de la antera y se llama cultivo de pole o microeporas. 7. Cultivo de yemas Las plantas adultas presentan meristemas en los extremos del eje principal y en las ramificaciones del vástago de la raíz. Los meristemos del vástago o domo meristemático se encuentran rodeados por los primordios foliares y en conjunto constituyen las yemas apicales o axilares dependiendo de su posición en la planta. Las yemas axilares aisladas o las presentes en número variable en los nudos de microesquejes cultivados in vitro en presencia de hormonas, generalmente de citocininas, forman brotes. El número de brotes formados dependerá del número de yemas preexistentes, de la concentración de hormonas endógenas, así como de las concentraci concentraciones ones relativas de las hormonas añadidas. Los brote brotess formad formados os pueden provenir de yemas axilares preexistentes o de yemas adventicias; estas últimas pueden formarse al proliferar en si misma la yema axilar. Generalmente las yema yemass adve advent ntic icia iass se form forman an en pr pres esen enci cia a de alta altass conc concen entr trac acio ione ness de citocininas. El cultivo de yemas y microesquejes se utiliza en la micropropagación clonal masiva de plantas élites. El cultivo de los domos meristemáticos o de yemas con pocos primordios se utiliza para la obtención de plantas libres de virus (Alvez, 2012).

8. Rescate de embriones Consiste en aislar los embriones de los óvulos de una planta y cultivarlos en un medio estéril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desar de sarro rollllo o nor norma mal.l. Esta Esta té técn cnic ica a es re rela latitivam vamen ente te fá fáci cill de lllleva evarr a ca cabo bo en embriones maduros y sus posibilidades de éxito son muy buenas. Las dificultades se incrementan cuanto más inmaduro sea el embrión a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son más específicos en las etapas tempranas de desarrollo del embrión (Cardone, (2016)).

9. Embriogénesis somática

 

La embriogénesis somática (asexual o adventicia, consiste en el desarrollo de embriones a partir de células que no son el producto de una fusión gamética, o en otras palabras, es un proceso por el cual se produce una estructura bipolar  (embrión) a partir de una célula somática (López, (2016)).

10. Áreas de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales  

 

 

Área de preparación de medios de cultivo: se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer también un espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plástico y los reactivos químicos. Este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitación, y otros elementos; también debe incluir vitrinas, estanterías y espacio para el equipo de refrigeración, y para la incubadora o la cámara de crecimiento (Santana, 2012). Material y equipo: refrigerador, balanzas, (macrobalanza y de precisión), pote po tenc nció ióme metr tro, o, plan planch cha a eléc eléctr tric ica a con con ag agititad ador or ma magn gnét étic ico, o, fr fras asco coss erlenmeyer (125, 250 y 500 ml), botellas y material de vidrio o plástico (Santana, 2012). Área de lavado y de esterilización: El área de lavado debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fría y una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada; para el efecto se debe usar un destilador de vidrio o de material no toxico y un desionizador de agua colocado entre le destilador y el lavadero. Esta área debe disponer de un espacio para almacenar agua destilada en botellas de plástico; también debe proveer basureros adecuados para el mate ma teri rial al ve vege geta tal,l, in inor orgá gáni nico co y de vidr vidrio io que que se desec deseche he..   El ár área ea de destilación debe tener espacio para la autoclave vertical u horizontal, el cual puede ser pequeño (olla de presión) o grande (de carga frontal y de enfriamiento lento y rápido), según sea el volumen del material que se procese.. Esta área también debe incluir espacio para estufas, secadores y procese un lavadero con agua caliente y fría (Santana, 2012). Material y equipo: autoclave manual o automático, destilador de vidrio, grad gradililla lass pa para ra se secad cado, o, band bandej ejas as de al alum umin inio io y de plás plástiticos cos de va vari rios os tamaño tam años, s, reci recipie piente ntess de pla platic tico o gran grandes des,, est estufa ufass para est esteril eriliza izació ción n y secado (Santana, 2012). Área de Transferencia: en esta área del laboratorio se realiza el trabajo de excisión, inoculación, y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo demanda los más altos niveles de limpieza ambiental, se recomienda la instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertica vert icall de aire filtrado filtrado baj bajo o presión presión,, o la constr construcci ucción ón de cuar cuartos tos de

 

transferencia. Sin embargo, ciertas operaciones de inoculación, como la excisión y el cultivo de ápices y meristemos en tubos de ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una mesa limpia, ubicada en un lugar del laboratorio libre de corrientes de aire y polvo.  Los gabinetes de flujo laminar  deben ubicarse, en lo posible, en un lugar alejado de las puertas y con un mínimo mínim o de corrient corriente e de aire, con el fin de prolongar la vida útil de los filtros filtros (Santana, 2012). Material y equipo: gabinete de flujo laminar, microscopio de disección con luz incidente, e instrumentos de disección: cuchillas # 10 y # 11, mangos para par a cuch cuchill illas, as, agu agujas jas de dis disecci ección, ón, pin pinzas, zas, titijera jeras, s, navaja navaja de afe afeita itar. r. También se necesitan frascos con alcohol, mascaras, guantes, marcadores a prueba de agua, bandejas, y tacho para basuras (Santana, 2012). Área de incubación: los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o cámaras de crecimiento; estas pueden ser más eficientes en cuanto al control ambiental, pero son más costosas. El área de incubación o crecimiento in vitro debe proporcionar un buen control de la temperatura (20-28 °C), de la iluminación (variable, según las necesidades: 1000 a 5000 lux) y de la humedad relativa (70-80%).   En este cuarto de incubación se instalan estanterías instalan estanterías metál metálicas icas o de madera para colocar los cultivos. Estas estanterías pueden tener dimensiones variables: el ancho entre 0.3 m 1 m, el largo de acuerdo con el tamaño del cuarto, y la altura total de 1.8 a 2.2 m; la distancia entre peldaños es de 0.2 a .5 m.   Esta área debe incluir, además, un espacio para cultivos en agitación y para cultivos estáticos en la oscuridad.  Es necesario propiciar una buena distribución del aire en este cuarto para evitar zonas de recalentamiento por efecto de la luces. Cuando se utilizan tubos fluorescentes, es conveniente sacar los balastros fuera de este cuarto.  La regulación de la temperatura se puede logra por medio de aparatos de aire acondicionado de pared o de un sistema central. En

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cual cu alq quier uier caso caso,, es nec eces esar ariio tom omar ar pr prec ecau auci cion ones es para para ev evit itar ar el ca cale lent ntam amie ient nto o ex exces cesiv ivo, o, in inst stal alan ando do al alarm armas as y co cont ntro role less pa para ra cor corta tarr l iluminación cuando falle el aire acondicionado (Santana, 2012). Materi Mat erial al y equ equipo ipo:: un cua cuarto rto con tem temper peratu atura, ra, ilumin iluminaci ación ón y hum humeda edad d re rela latitiva vass co cont ntrol rolad adas; as; es esta tant nter ería íass co con n ililum umin inaci ación ón pa para ra lo loss cu cultltiv ivos, os, bandej ban dejas, as, termóme termómetro tross de máxima máxima y mín mínima ima,, y gradil gradillas las para tubos de varios tamaños (Santana, 2012). general ralmen mente te los Área Ár ea de obse observ rvac ació ión n y exam examen en (e (exa xani nima maci ción ón): ): gene microscopios (estéreo, compuesto, invertido y otros) se localizan tanto en el área área de inc incuba ubaci ción ón co como mo en la de tr tran ansf sfere erenc ncia ia,, per pero o op opci cion onal alme ment nte e pueden estar en un área separada. El objetivo de esta área es realizar  observaciones periódicas de los cultivos, tanto en medios semisólidos como en medios líquidos (Santana, 2012).

 

 

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Material y equipo Material equipo:: micros microscopio copio estere estereoscópic oscópico, o, microscopio microscopio compue compuesto, sto, lentes de aumento, y elementos ópticos complementarios (Santana, 2012). Área de creci crecimient miento o in vivo: las plantas que se regeneran en el área de incuba inc ubación ción se pued pueden en aco acondi ndicio cionar nar o aclima aclimatar tar y lue luego go tra traspl splant antar ar en macetas, bandejas o camas apropiadas. Esta operaciones se pueden llevar  a cabo en tinglados, casas de malla o invernaderos, dependiendo de la condiciones climáticas del lugar donde está ubicado del laboratorio y de los requerimientos de aislamiento de los materiales por razones fitosanitarias (Santana, 2012). Material y equipo: macetas, suelo, bandejas, cámaras de alta humedad, entre otros (Santana, 2012). Áreas Áre as de cuaren cuarenten tenaa y de contro controll fitosa fitosanit nitari ario: o: esta esta se incl incluy uye e en la labor borat atori orios os con fifines nes de pr produ oducc cció ión n de ma mate teri rial ales es elit elites es de san sanid idad ad ce cert rtifific icada ada.. El áre área a de cu cuare arent nten ena a de debe be est estar ar se separ parada ada de dell re rest sto o de dell laboratorio pero cercana del área de control fitosanitario. En el área de control fitosanitario se realizan las pruebas necesarias para comprobar la sanidad de material vegetal, espacialmente causada por virus, hongos y bacterias (Santana, 2012). Área Ár ea de of ofic icin ina: a: se deb debe e in incl clui uirr aq aquí uí,, el mo mobi bililiar ario io de ofic oficin ina a como como escritorios, archivos y almacenamiento de datos, los libros de referencia y de control del laboratorio, los catálogos y otros documentos. También se coloca en ella el equipo de cálculo o computación (Santana, 2012).

11. Reguladores de crecimiento Auxinas: Se denominan auxinas los compuestos caracterizados por su capacidad de in indu duci cirr el elon ongac gació ión n en cél célul ulas as de vás vásta tago gos. s. La au auxi xina na na natu tura rall de ma mayo yor  r  distribución es el ácido 3-indolacético (AIA), aun cuando el ácido 4-cloroindol-3acético ha sido aislado de plantas superiores. En general este grupo de hormonas afecta otras características fisiológicas, además de la elongación, pero esta acción es considerada crítica (http://bd.unsl.edu.ar).

Citoqu Cit oquini ininas: nas: Las citoquininas son un grupo de fitohormonas que regulan la división celular y la diferenciación en tejidos vegetales, participan en el control del desarrollo y la senescencia.   Se define definen n com como o citoqui citoquinin ninas as a los comp compues uestos tos natural nat urales es o de sín síntes tesis is que en en prese presenci ncia a de auxinas

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clasificació icación n de giberelina giberelinass se encuentra una familia familia de Giberelinas: dentro de la clasif compuestos diterpénicos conocidos como ent-giberelanos. Si bien el más popular  es el ác ácid ido o gib giberé erélilico co (GA (GA3), act actual ualmen mente te se conocen conocen alr alrede ededor dor de och ochent enta a giberelinas de origen natural, presentes en vegetales y microorganismos.   En la actualidad se conoce que las giberelinas se encuentran involucradas en el control de procesos claves en el desarrollo de las plantas, entre los que pueden citarse elonga elo ngació ción n de tallos tallos,,

mov movili ilizaci zación ón end endospé ospérmi rmica, ca, flora floració ción n y fru fructi ctific ficació ación n

(http://bd.unsl.edu.ar).

12. Bibliografía 12.1.. Olmo 12.1 Olmoss S; Lu Luci cian anii G; Gald Galdea eano no E. (2016 (2016). ). Mé Méto todo doss de pro propag pagac ació ión n y conservación de germoplasmas (en línea). Consultado el 04 de mayo de 2016. Disponible en http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_IV.pdf. http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_IV.pdf. 12.2. Alvez B. 2012. Cultivo de tejidos vegetales. Caracas, Venezuela, Universidad Cent Ce ntra rall de Ve Vene nezue zuela la.. Co Consu nsultltad ado o el 04 de ma mayo yo de 20 2016 16.. Disp Dispon onib ible le en http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/andrea.menendez/archivos/Guia %20Cultivo%20de%20Tej%20Veg%20II%202012.pdf. 12.3. Hurtado. Hurtado. 1987. Cultivo de merist meristemos emos (en línea) línea).. Consul Consultado tado el 04 de mayo de 2016. Disponible en http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203024/2013/203024/leccin_321_cultivo_d e_meristemos.html. 12.4. San 12.4. Santan tana a A. 2012 2012.. Áre Área a de laborat laboratori orio o de cultiv cultivos os vege vegetal tales es (en lín línea). ea). Consultado el 04 de mayo de 2016. Disponible en http://asantanac.blogspot.com/2012/09/instituto-tecnologico-de-cd.html. 12.5. López C. (2016). Embriogénesis somática (en línea). Consultado el 04 de mayo de 2016. Disponible en http://www.encuentros.uma.es/encuentros39/embriogenesis.html. 12.6. Cardone S. (2016). Métodos para generar y analizar diversidad: rescate de embr em brio ione ness (e (en n líne línea) a).. Co Cons nsul ulta tado do el 04 de mayo mayo de 2016 2016.. Disp Dispon onib ible le en http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_II.pdf. 12.7. Reguladores Reguladores de Crecimient Crecimiento o (en línea) línea).. Consultad Consultado o el 04 de mayo de 2016. Disponible en http://bd.unsl.edu.ar/download.php?id=746.

 

12.8.. Ma 12.8 Mala lajo jovi vich ch.. (2 (2016 016). ). Mi Micr cropr oprop opaga agaci ción: ón: me medi dios os de cul cultitivo vo (en lílíne nea). a). Consultado el 04 de mayo de 2016. Disponible en http://www.bteduc.bio.br/guias_es/96_Micropropagacion_medios_de_cultivo.pdf.