Producción de Glucoamilasa Por Aspergillus Niger

 

Producción de Glucoamilasa por  Aspergillus niger 

Katherine L. Suárez Herencia

 

Introducción •

El desarrollo de tecnologías emergentes implica el reto permanente de ulizar nuevas herramientas de gesón tecnológica. La ingeniería de enzimas y su respecva tecnología en el contexto de la biotecnología, es una de las áreas del conocimiento sobre las cuales reiteravamente se plantean grandes expectavas como posible generador de ventaja compeva en economías emergentes. En este sendo, la importancia de producir glucoamilasa a parr de  Aspergillus sp. mediante aplicaciones biotecnológicas está dirigida esencialmente al área de alimentos.

 

Enzimas •

Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores de las diferentes reacciones bioquímicas que constuyen el metabolismo de los seres vivos. Para que se produzca una determinada reacción, es necesaria la presencia de una determinada enzima, y la mayor o menor candad de ésta suele modicar la velocidad de la reacción controlada.

 

Amilasas •

Las amilasas son enzimas que catalizan las reacciones hidrolícas del almidón, dando origen a diversos productos que posees una gran relevancia para algunas operaciones y procesos industriales. Las amilasas son comúnmente halladas en animales y plantas; sin embargo, para nes industriales las más ulizadas son aquellas de origen bacteriano o fúngico.

Tipos de alfa-amilasas

 

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Amilasa de origen fúngico . Se producen por fermentación de una cepa del hongo  Aspergillus niger , y es la más ulizada en la fabricación del pan, como alternava a la harina de malta. Ello es debido al hecho, entre otros, de que la alfa-amilasa fúngica ene una mayor tolerancia a la sobredosicación que la de origen cereal, lo que se basa en su desacvación durante la primera fase de la cocción (60-65°C), (60-65°C), por lo que no existe el riesgo de que se produzca exceso de dextrinas, lo cual produciría producir ía migas pegajosas. La acvidad de las alfa-amilasas de origen fúngico comerciales se mide en dos unidades:  – FAU (Unidad Fungal Amilasa o Fungal Amylase Unit), que es la candad que dextrinizará dextrinizar á una solución estándar de almidón a una velocidad de 1 g/hora a 40°C.  – SKB que mide la capacidad de la enzima para degradar una solución de almidón puro, a un pH de 4,5, durante 60 minutos a 30°C. La relación entre las FAU y las SKB, es que 1.000 FAU/g aproximadamente equivalen a 10.000 SKB/g. Las amilasas de origen fúngico ulizadas en la panadería enen una acvidad variada que va desde baja acvidad 2.500 SKB/g hasta alta acvidad 50.000 SKB/g.

 

Tipos de alfa-amilasas •

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La alfa-amilasa Bacteriana. Se produce a parr de la bacteria Bacillus subtlis, y es muy resistente al calor por lo que a temperaturas de 70 a 90°C alcanza su máxima velocidad de reacción. El efecto secundario pico de la amilasa bacteriana es una disminución de la viscosidad del engrudo del almidón. La alfa-amilasa de origen cereal (harina de malta) . Su elaboración consiste en la germinación del trigo para que se movilicen las alfaamilasas naturales del grano. Estas amilasas se inacvan a 75°C. La Amiloglucosidasa. También denominada Glucoamilasa se obene del hongo  Aspergillus niger , y actúa sobre las dextrinas produciendo glucosa, lo que se traduce en una aceleración de la fermentación.

 

Glucoamilasa •

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La glucoamilasa es un enzima extracelular producida por diversas especies de Aspergillus. La Glucoamilasa también reconocida como amiloglucosidasa es una exohidrolasa que en la nomenclatura internacional está idencada como E.C.3.2.1.3., y su nombre sistemáco es 1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa. Es una enzima que ene como función actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas de polisacáridos operando en los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa separando unidades de glucosa a parr del extremo no reductor de la cadena.

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Los enlaces ramicados α-1-4 también se hidrolizan, pero mucho más lentamente, formándose un jarabe de glucosa, un contenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y de un 30 a un 5 % de oligosacáridos grandes. Debido a esto se le dene como una enzima desramicadora. La enzima es capaz de hidrolizar también, aunque lentamente, los enlaces a-1-3. La glucosa formada se uliza como jarabe o se cristaliza para obtener glucosa pura sólida.

 

Glucoamilasa •

El principal producto nal de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de las alfa y beta amilasas.

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Las glucoamilasas son inacvas sobre almidón navo. Su acvidad es máxima entre pH 4 y 5.5, y temperatura alrededor de 55-65°C. La rata de reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato, siendo máxima sobre almidones previamente somedos a licuefacción. La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la industria de procesado del almidón en de tanques a 55-60 °C ylas pHdextrinas de 4,5 y con períodos incubación 48-92 disconnuos horas, para transformar formadas porde la a-amilasa en glucosa.

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La Glucoamilasa se encuentra en el mercado tanto en forma sólida como líquida (líquido color marrón claro).

 

Usos de la Glucoamilasa •

Fabricación de alcohol (biocombusbles).

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Fabricación de azúcar de almidón.

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Elaboración de la cerveza y fabricación de vinagre (la levadura de la substución con la enzima puede mejorar la producción). Fabricación de jarabes de glucosa. Fabricación de polvos gastrónomos, de anbiócos, de ácido cítrico, etc. Fabricación de jugos de fruta (hidroliza el almidón, evitando que se produzca turbidez después de la concentración).

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Como reacvo para la determinación de almidones en alimentos.

 

 Aspergillus niger  •

En 1729 el  Aspergillus  fue catalogado por primera vez por el biólogo italiano Pier Antonio Micheli, que usó el nombre "Aspergillum" por parecerse el hongo al instrumento usado para dispersar d ispersar agua bendita.

 

 Aspergillus niger  •

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 Aspergillus niger   es un hongo que produce un moho negro en vegetales -muy común en la lechuga, el tomate o la acelga-. Es una de las especies más corrientes del género Aspergillus. Puede exisr en dos formas básicas: levaduras e hifas.

El   Aspergillus niger   se culva para producir varios productos químicos como: ácido cítrico (E330), ácido glucónico (E574), y enzimas como: glucoamilasa, galactosidasa, etc.

 

Clasicación Cienca Dominio: Eukaryota Reino: Fungi   Filo: Ascomycota   Sublo: Pezizomycona   Clase: Euroomycetes   Orden: Euroales      

Familia: Trichocomaceae Género: Aspergillus Especie: Aspergillus niger  

 

Producción y Caracterización de Amiloglucosidasa extracelular de Aspergillus niger CA-19 mediante Fermentación en Estado Sólido (SSF) •

Este estudio fue realizado con el propósito de producir la enzima amiloglucosidasa a parr de  A. niger  usando   usando el método de Fermentación en Estado Sólido (SSF - Solid-State Fermentaon) y encontrar una caracterización preliminar de la enzima producida.

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A. niger fue aislado en un medio de agar almidón con azul brillante de Remazol y fue usado como sustrato del proceso de fermentación para la producción enzimáca el salvado de arroz suplementado con harina de soya. El crudo de la enzima extraída tuvo una temperatura y pH ópmos a 60°C y pH 4 respecvamente. Con excepción del almidón de cocoñame, la preparación enzimáca fue capaz de hidrolizar el almidón del maíz y el almidón de otras raíces como el camote, yuca, etc. La hidrólisis fue directamente proporcional a la candad de almidón de la fuente.

 

Deección y Aislamieno de la cepa amilolítca de  Aspergillus niger  niger  •

La cepa amilolíca de A. niger fue aislada de muestras de suelos tomadas en diferentes áreas de la UNAAB (University of Agriculture Abeokua, Nigeria) usando un medio de agar almidón con azul brillante de Remazol. La producción de una amilasa fue detectada por la desaparición del color azul del mediorestando alrededor de losde lugares deaclarada inoculación de las que fue calculada al radio la zona el radio decolonias, la colonia.

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Las colonias de A. niger que produjeron grandes zonas de aclaramiento fueron tomadas y puricadas sembrándolas en estrías en un agar de extracto de malta. La idencación de este aislamiento se basó en las caracteríscas morfológicas de las colonias y de las células con referentes en el método de Rasper y Fennel (1965).

 

Producción de Amiloglucosidasa por Fermenación en Esado Sólido •

La fermentación fue realizada en matraces Erlenmeyer de 250ml. El medio estaba constuido de salvado de arroz (10g) y harina de soya (3g) humedecido al 55%, esta humedad fue dada con una solución acuosa de sales minerales [MgSO4.7H20, 0.1%: KH2PO4, 0.1%; CaCl2, 4 0.1%; , 0.05% y (NH4Después )2SO4, 0.1%]. La esterilización se fueron hizo a 121°C FeSO durante 15 minutos. de enfriar los matraces, inoculados con 1ml de suspensión conidial de A. niger CA-19 (2x10 6  esporas/100ml) y fue incubado a 30°C durante 72h.

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La extracción de la enzimafueron del salvado enmohecido sebuer hizo: Para 1g de salvado enmohecido, agregados 10ml de citrato 0.01M (pH4.5) y la mezcla fue removida en un agitador orbital (LABLINE, UK) a 150 rpm, durante 1 h a 28°C. El ltrado fue realizado a parr del caldo obtenido de la fermentación.

 

Prueba de Amiloglucosidasa •

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La acvidad de la Amiloglucosidasa fue probada a 60°C durante 1h usando almidón de maíz al 1% (p/v) en buer citrato 0.1M (pH4.5). Los azúcares reductores fueron calculados por el método del DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico). 3,5-dinitrosalicílico). Una unidad de acvidad de amilasa (FAU) fue denida como la candad de enzima que liberó 0.1 umol de D-glucosa de almidón en 1.0uL de la mezcla reacva.

 

Caracterización de Glucoamilasa •

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Efecto de la Temperatura: Para establecer la temperatura ópma de acvidad de la amiloglucosidasa, la enzima fue incubada con almidón soluble en un buer de acetato 0.1M, en donde las temperaturas de reacción uctuaron entre 20 y 90°C. Efecto del pH: La acvidad de la amiloglucosidasa fue medida en varios rangos de pH que fueron de 4 a 10. El pH de reacción de la mezcla fue variando conforme se usaban diferentes buers (buer citrato para pH=3-6, buer fosfato para pH=7-8 y buer borato

para pH=9-10) •

Estabilidad de la Enzima: La solución enzimáca se mantuvo a una temperatura ambiente por 34 días. A diferentes intervalos de empo, se tomaron alícuotas de solución estándar de amilasa para

analizar su acvidad.

 

Caracterización de Glucoamilasa •

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Digesón de Almidones Primarios: La capacidad del crudo de la enzima para hidrolizar almidones primarios fue estudiado usando almidones de maíz, yuca, camote, ñame y cocoñame. La solución comercial de almidón fue ulizada como estándar. La solución enzimáca (1mL; buer acetato fosfato (pH 4.5, 1 mL)) y 3mL de cada solución de crudo de almidón fue incubada a 60°C durante 1h. La capacidad de los crudos de almidón para hidrolizarse fue calculada de acuerdo a la candad de azúcares reductores (mg g-1) producidos. Cromatograa en Capa Fina: Los azúcares producidos por la hidrólisis del crudo de almidón con amiloglucosidasa de A. niger CA19 fueron idencados mediante Cromatograa en Capa Fina (TLC) usando como fase móvil n-butanol : ácido acéco : diel éter : agua (9:6:3:1). Los azúcares reductores fueron revelados con un spray de

hidrocloruro de p-anisidina.

 

Discusión y Resultados •

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Es necesario el aislamiento y la selección de los organismos adecuados para la producción de amilasa. a milasa. El resultado de este estudio mostró que la capacidad de aislar microorganismos de amiloglucosidasa, el Aspergillus niger, constuyen productores la mayor fuente de producción de como po comercial para enzimas usando la técnica de Fermentación en Estado Sólido.

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En la Fermentación en Estado Sólido, la selección de un adecuado sustrato sólido es un punto críco que involucra la detección de un gran número de materiales agro-industriales para el crecimiento microbiano y la formación de sus productos. Dado que el salvado de arroz es un producto barato y de fácil disponibilidad, su uso como sustrato para la producción de enzimas lo hace ideal para la producción a gran escala de amilasa por fermentación en estado sólido.

 

Caracterización de Glucoamilasa •

Los estudios preliminares para caracterizar la enzima por sus acvidades enzimácas mostraron que la amiloglucosidasa producida por Aspergillus niger CA-19 fue ópmamente acva a 60°C. La acvidad de la enzima decayó dráscamente a temperaturas mayores a 60°C y se paralizó totalmente a los 90°C.

 

Caracterización de Glucoamilasa •

El resultado mostró que la acvidad de la enzima fue ópma cuando el ensayo se llevó a un pH 4.0. Al superar el pH 4, se observó un connuo decaimiento en la acvidad de la enzima.

 

Hidrólisis del Almidón Crudo

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La capacidad de los gránulos de almidón de ser digeridos por la enzima, depende de la fuente de almidón y de la candad de enzima con la que se traten.

 

Cromaografa en Capa Fina •

Los productos nales determinados mediante la cromatograa en capa na en ópmas condiciones (pH 4.0 a 60°C) mostraron que la glucosa fue el único producto obtenido después de 10, 20, 40 y 60 minutos de hidrólisis, indicando que el patrón de comportamiento de la enzima fue completamente el de la amiloglucosidasa. Este comportamiento resulta en una gran ventaja para la producción industrial de jarabe de glucosa. Así es como, este estudio de producción de amiloglucosidasa por A. niger CA19 nos arroja resultados bastante promisorios .

 

Conclusiones •

Este estudio conrmó que Aspergillus niger es un excelente productor extracelular de amiloglucosidasa. Dado el hecho de que este microorganismo se encuentra en la lista de microorganismos generalmente reconocidos como seguros (GRAS - Generally Recognized As Safe) para elaboración de alimentos, cervezas y aplicaciones farmacéucas, se hace necesaria ahondar las invesgaciones para opmizar el proceso fermentavo para así obtener mayores candades de producción de amiloglucosidasa por esta cepa.

 

Referencias •

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