Proceso de Fermentación Láctica de la Leche para la Obtención de Yogurt en COOLECHERA Mediante el Uso de Cultivos Bacterianos de Tipo Lactobacillus Bulgaricus.docx

Proceso de Fermentación Láctica de la Leche para la Obtención de Yogurt en COOLECHERA Mediante el Uso de Cultivos Bacterianos de Tipo Lactobacillus Bulgaricus P. Cuello, R. Domínguez, A. Movilla, J. Pertuz, H. Valencia Facultad de Ingeniería, Ingeniería Química, VIII semestre Universidad del Atlántico, Km 7 Antigua vía a Puerto Colombia, espacio 205A, A.A. 1890, Barranquilla, Colombia

Resumen La producción de derivados lácteos fermentados tales como el yogurt y otros, se da a nivel global mediante el uso de cultivos bacterianos que promueven la fermentación de la leche para la obtención de tales derivados, consumidos ampliamente en todo el mundo. El proceso de fermentación de la leche para la obtención de yogurt en COOLECHERA consiste de tres etapas de mezclado y preparación de la leche para el proceso, seguida de una de pasteurización a 90°C para luego ser fermentada la mezcla láctea preparada. La fermentación es realizada en reactores batch cargados con 5000 litros de leche, mediante el uso de cultivos de lactobacillus bulgaricus a temperatura constante a 40°C durante aproximadamente 8 horas, tiempo en que el pH desciende entre 4 – 4.5 y se completa el proceso de fermentación hasta el punto deseado para obtener las propiedades organolépticas características del yogurt, el cual es luego empacado en cajas o bolsas de acuerdo a la presentación. Para analizar los aspectos cinéticos de la reacción, se recurrió a la literatura existente acerca de la reacción global de producción de acido láctico a partir de lactosa con el cultivo estudiado y algunos similares, encontrándose que el proceso obedece a tres modelos empíricos, siendo estos la ecuación logística para la producción de biomasa, la ecuación de Luedekin y Piret para la producción de acido láctico y la ecuación de Hanson y Tsao para el consumo de sustrato, a partir de este ultimo modelo se logró concluir que la cinética del proceso varía de segundo a primer orden a desde el principio hasta el final del proceso respectivamente. Palabras claves: Derivados, fermentados, lactasa, cultivo, pH, lactobacillus, madurador.

1. Introducción Muchos de los productos derivados de la leche, tales como la mantequilla, el queso y el yogurt fueron descubiertos de manera accidental a través de la experiencia [1,2,4]. Mucho tiempo después del descubrimiento de estos productos se conocería que el proceso que lleva a estos es la fermentación de la leche y la formación del cuajo. El descubrimiento y producción de los derivados fermentados impulsó el desarrollo de la industria láctea, que se estableció como tal en el transcurso de la revolución industrial y de la urbanización masiva [1-3,5], como resultado de los avances tecnológicos y del incremento de la población en las ciudades, sin embargo la base de estas industrias se encuentra en las granjas, establecidas desde que el ser humano desarrolló la agricultura miles de años atrás [1-3]. Los productos fermentados derivados de la leche, tales como el yogurt o el kumis son ampliamente consumidos en muchas partes del mundo [4] desde tiempos antiguos, debido a su facilidad de obtención y de digestión, así como también a los efectos positivos en la salud que les han sido atribuidos a lo largo de

la historia [1-5]. Existen muchas variedades de derivados fermentados producidas en distintos lugares del mundo, siendo muchas de estas autóctonas de una región, país o sección continental, haciendo parte de la cultura de estas [4]. Los derivados de la leche tratados son producidos a partir de procesos de fermentación con determinados cultivos bacterianos, los cuales básicamente transforman por medio de enzimas la lactosa y las proteínas presentes en la leche en acido láctico o etanol (fermentación láctica o alcohólica respectivamente) y en otros metabolitos respectivamente, los cuales le confieren a estos derivados sus propiedades organolépticas y nutritivas características [1-5]. Para producir un determinado derivado se deben utilizar los cultivos bacterianos apropiados a unas condiciones especificas y realizar las operaciones unitarias correspondientes para lograr obtener un producto de calidad [1,2], dichas operaciones generalmente se circunscriben a mezclado, pasteurización y posterior empacado.

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Los procesos de fermentación para la obtención de productos lácteos y de ácido láctico y etanol han sido estudiados ampliamente en el siglo XX por diferentes investigadores [6,8-10,1214,16], junto a otros procesos biológicos, obteniéndose varios modelos [10,11] con resultados aceptables que describen las diferentes etapas que ocurren en este proceso. Uno de los modelos más empleados y mejorados a partir de su concepción fue el modelo de Monod del crecimiento de un cultivo bacteriano [7], este modelo es de naturaleza empírica y se basa en el hecho de que las bacterias se alimentan de un nutriente que se agota con el tiempo [7, 15].

de leche a 40 °C, luego la leche del tanque 14 y la leche del tanque de mezcla son llevadas a un tanque el cual se encuentra conectado a un pasteurizador, este tanque se conoce como tanque de balance del pasteurizador el cual mezcla la leche del tanque 14 con la leche del tanque de mezcla para luego pasar al pasteurizador donde 5000 litros de leche se calientan a 90 °C durante 45 minutos, luego esta leche preparada pasa a los maduradores. El proceso de fermentación de la leche en el madurador demora en total 8 horas, durante las dos primeras horas se baja la temperatura de la leche lentamente a 40 °C, después de las dos primeras horas se agregan los cultivos bacterianos, estos vienen en sobres dosificados, el cual se agrega 1 sobre por cada 1000 litros de leche y se efectúa agitación de 10 a 15 minutos, luego se esperan en promedio 6 horas donde en las 4 primeras horas el cultivo bacteriano se activa y en el resto del tiempo las bacterias continúan fermentando la leche disminuyendo su pH, se toman muestras para ver si la acidez es la adecuada, para el caso trabajado se habla de un pH de 4 a 4.5 [1,2,5], si la acidez es adecuada el proceso se corta, es decir, se enfría la leche por medio de agua de enfriamiento a 24 °C y luego se toma otra muestra para liberación esto es para verificar que este lista la mezcla para ser envasada. Al finalizar la tanda del proceso se lava el reactor durante 20 minutos y luego el reactor comienza a trabajar en otra tanda.

El proceso a estudiar es la fermentación láctica de la leche para la obtención de yogures. El proceso de fermentación láctica de la leche con cultivos bacterianos para la producción de derivados como el yogur es el paso vital en la producción de dichos derivados, dicho proceso se suele llevar a cabo en reactores por tandas debido a la naturaleza de la reacción [1,2]. Es fundamental controlar las condiciones a las que ocurre el proceso, especialmente la temperatura y la acidez en las que se maneja dicho proceso ya que los cultivos bacterianos y las enzimas que estos producen realizan sus funciones en unos determinados rangos de temperatura, fuera de las cuales se desactivan reversible o irreversiblemente [1,2,5-16], mientras que la acidez es una medida del avance de las reacciones en el proceso, de modo que a determinada acidez se tiene el producto con las propiedades organolépticas y nutritivas deseadas, siendo la acidez del proceso entonces la variable que fija el tiempo que demora el proceso [1,2].

El producto una vez esté listo para ser envasado se efectúa esta etapa del proceso de manera manual por los operarios.

2.2. Características de los reactores 2. Características del proceso 2.1. Equipos utilizados y realizadas en el proceso

El proceso consiste en la fermentación láctica de la leche para la producción de yogurt, dicho proceso se lleva a cabo en reactores tipo batch que se conocen como maduradores debido a que se realizan procesos de fermentación en ellos, cabe anotar que se encuentran tres tanques diferentes los cuales funcionan cada uno de manera independiente para producir cada uno de los productos que se deseen, de acuerdo a la demanda de productos que se pidan para la venta en el mercado, es decir, que si se necesita mayor producción por ejemplo de yogurt se utilizan los tres reactores para aumentar la oferta de yogurt con el fin de satisfacer la demanda del mercado.

operaciones

En la figura 1 se puede observar un esquema general del proceso, con todos los equipos utilizados en este. El proceso de fermentación empieza con la leche que llega a un tanque de almacenamiento llamado tanque 14 al cual le llega leche producida en el mismo día, mientras que a otro tanque, de mezcla esta vez, le llega leche y se le agrega azúcar a una razón de 12 bultos de azúcar de 50 Kg cada uno por cada 1000 litros

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Azúcar E-8

Leche

Tanque de mezcla E-7

E-5

E-1

Reactores (Maduradores)

Leche Tanque 14

Tanque de balance del pasteurizador

E-3

Pasteurizador E-6

E-4

E-2

Producto final (Yogurt y otros derivados) Figura 1. Diagrama de flujo del proceso.

distribuir mejor la leche alimentada, el otro tubo de la parte superior se utiliza para circular agua de enfriamiento a través de las camisas del reactor cuando sea requerida esta operación. El tubo de la parte inferior comunica con una maquina envasadora donde se retira el producto por gravedad. Las únicas condiciones que se controlan en el reactor son la temperatura de la mezcla y la velocidad de agitación en tres niveles, esto se hace por medio de controles externos de los maduradores que se ubican en la parte inferior donde el operario puede manejarlos. En la figura 2 se puede observar un esquema detallado de las partes del reactor.

Los reactores por tandas tienen un cuerpo cilíndrico con un techo en forma de domo, dos de los reactores son de 4 metros de alto y tienen un volumen de 6000 litros, el tercero es de 3,5 metros de alto y tienen un volumen de 5000 litros. Los reactores empleados son tanques que están en contacto con el ambiente por lo cual la presión de estos es la presión atmosférica (no hay presurización), los reactores están hechos de acero inoxidable y cuentan con una camisa de enfriamiento cada uno, los reactores en la parte superior, en el domo, cuentan con una tapa por la cual se le pueden agregar los cultivos bacterianos y cualquier otro aditivo que se quiera adicionar a la mezcla (partículas solidas, saborizantes y demás aditivos que le den las propiedades características al producto deseado) además por medio de la apertura de la tapa se toman muestras del producto durante el proceso para analizarla en un laboratorio y determinar si el proceso se debe finalizar. Estos reactores cuentan con agitadores de 6 paletas cada uno para homogeneizar la mezcla, además tiene formas especiales con diversos espacios libres para generar turbulencias. Cada reactor cuenta con una mirilla para observar el nivel y el estado de la mezcla. Los reactores poseen 4 tuberías tres de ellas por encima y una por debajo del mismo, dos de las tuberías de la parte de arriba se utilizan para alimentar al reactor con leche pasteurizada, estos tubos terminan en lados opuestos del domo para

Para la reacción deseada el reactor trabaja a una temperatura de 35 – 45°C, temperatura a la que el cultivo bacteriano esta activo y trabaja en sus más óptimas condiciones, debido a que los cultivos bacterianos empleados son termófilos [1,2,10]. Por otra parte el pH de la mezcla debe ser verificado en un tiempo de proceso total de 8 horas en promedio, para ver si esta en los niveles óptimos que den las propiedades deseadas a los productos, este pH debe estar entre 4 y 4.5 para evitar la desactivación de las bacterias por el exceso de acidez y la descomposición de los productos (para evitar que se rancien).

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3. Aspectos generales de la reacción, modelos utilizados y determinación del orden cinético de reacción

Agitador de paletas Orificio de alimentación

Entrada de Alimentación Salida Agua de Enfriamiento

3.1. Reacciones de interés involucradas en el proceso

Entrada de Alimentación

Mirilla

Entrada Agua de Enfriamiento

El proceso de fermentación láctica acontece en condiciones anaeróbicas, es decir, en ausencia de oxígeno, cuyo producto final es el ácido láctico obtenido a partir de una serie de etapas de reacciones teniéndose como sustrato a la lactosa (C12H22O11), estando presente la enzima lactasa involucrada en la hidrólisis de la lactosa a glucosa y galactosa (C6H12O6 ambas), enzima aportada por bacterias del tipo lactobacillus y también por algunas bacterias del tipo streptococcus [10], las cuales son las encargadas de ejecutar la degradación de carbohidratos, y también tomándose en cuenta la cantidad de bacterias en el cultivo que prosiguen con las etapas posteriores a la hidrolisis mediante mecanismos de respiración celular. Para el proceso tratado, el tipo de cultivo predominante empleado es el lactobacillus bulgaricus. A continuación se presentan las reacciones realizadas por las bacterias relacionadas a la producción de ácido láctico (C3H5O3) [1,2]:

Camisa de Enfriamiento

Salida de producto Controles externos (Temperatura y velocidad de agitación)

Figura 2. Diagrama detallado del reactor.

2.3. Justificación del diseño del reactor El diseño de los maduradores se debe a varios factores, el primero y más importante es el hecho de que se trabaja con cultivos bacterianos, los cuales presentan unos intervalos de temperaturas y acidez especificas de activación [1,2], así como unos tiempos de activación relativamente largos, para el caso estudiado de 4 horas, para luego empezar en si el proceso de fermentación, lo anterior deja por fuera de discusión el uso de reactores de flujo continuo para este proceso, sin embargo para otros procesos que involucren la obtención de ácido láctico con un sustrato distinto y con otros fines, tales como los de investigación, es posible el uso de reactores continuos para procesos de fermentación [16]. Un segundo factor que justifica el uso de reactores batch a presión atmosférica es el hecho de que se trabaja con una mezcla líquida, que durante las reacciones puede producir algunos gases, más que todo CO2, el cual no es conveniente que permanezca en el reactor ni que genere una presión adicional, por lo cual este problema se elimina al estar en contacto con la atmosfera. Un tercer y último factor es el hecho de que durante el proceso se deben agregar aditivos y el mismo cultivo bacteriano, los cuales son sólidos y no es posible agregarlos por tuberías, esto justifica la presencia de una tapa en la parte superior de los reactores y complementa el hecho de que se encuentren a presión atmosférica.



Hidrólisis



Glucólisis

ADP: Adenosín Difosfato. ATP: Adenosín Trifosfato. NADH: Nicotinamida dinucleótido.

adenina

Pi: Grupo fosfato, necesario para balancear la ecuación estequiométrica, se encuentra en la forma (HPO42-).



4

Fermentación láctica

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Figura 3. Mecanismo de reacción de la hidrólisis de D-Lactosa para formar D-Glucosa y D-Galactosa por medio de la enzima lactasa [17].

La acción de la enzima lactasa es la que inicia todo el proceso de fermentación, estando involucrada en la etapa de la hidrolisis, propiciando la reacción por medio de un ataque axial a la molécula de lactosa por medio de un glutamato nucleófilo de la lactasa, de modo que durante el proceso se libera primero la molécula de glucosa y luego la de galactosa por medio de un ataque hidrofílico [17, 18]. El mecanismo de acción aceptado para esta enzima se puede observar en la figura 3.

similares a las de operación suministradas por la empresa, tales como reactor Batch, temperaturas y presiones similares, tiempos de carga comparable y el uso de cultivos lactobacillus bulgaricus. Se proponen los siguientes modelos cinéticos de mayor ajuste:



Consumo sustrato, S. Ecuación de Hanson y Tsao:

El resto del proceso, la glucólisis y la fermentación láctica son producto de la respiración celular anaerobia, la explicación para estos procesos se puede reducir sencillamente a un proceso de oxido-reducción para la glucolisis, y se puede facilitar la explicación para la fermentación láctica tratándola como una reacción ácido-base.

Donde Ks es la constante de saturación del sustrato (L/g*h), S la concentración de sustrato y X la concentración de biomasa.

La reacción se podría ver de un modo global refiriéndose a la lactosa como sustrato, siendo S la concentración de sustrato; la cantidad de bacterias en el cultivo se representaría en el término de concentración de biomasa, X, ya que las bacterias se reproducen, y la concentración de producto, es decir de ácido láctico se representaría como P, resultando la siguiente expresión [6]:



Producción de Biomasa, X. Modelo Logístico:

(

3.2. Modelos empíricos ajustados al proceso

)

Siendo μmax la máxima velocidad especifica de crecimiento (h-1) y Xmax la máxima concentración de biomasa alcanzada en la fermentación.

Debido a que no se proporcionó información experimental a cerca de la fermentación láctica, se recurre a la literatura científica, por lo que según lo expuesto por Jakymec et al. [6], en el cual se estudia la cinética en condiciones

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

Generación de producto, P. Ecuación de Luedekin y Piret: Por lo cual es posible observar que el orden global de esta reacción a primera vista sería de segundo orden, antes de continuar con el análisis se debe considerar que la población bacteriana presenta una curva de crecimiento, esta se muestra en la figura 4, en la que se puede observar que la curva se divide en cuatro etapas o fases [19]:

Siendo α una constante adimensional, β una constante de producción (h-1) y P la concentración del producto. Estos modelos son capaces de describir el comportamiento del proceso cuando se emplean cultivos de bacterias lactobacillus bulgaricus, sin embargo algunos de los modelos presentados u otros similares, la mayoría basados en la ecuación de Monod o en el modelo de Gompertz [6,8-10,12-14,16], son aplicables a estos cultivos y a otros tipos de cultivos bacterianos involucrados en la producción de derivados lácteos de fermentación láctica, tales como los sporolactobacillus CASD, lactobacillus Planarum, lactobacillus helveticus, lactococcus lactis, y streptococcus cerevisiae, entre otras [10], siendo algunos de estos modelos aplicables también al cultivo de lactobacillus bulgaricus [6].



La primera fase consiste en la fase de adaptación en la que las bacterias se adaptan a las condiciones de crecimiento y todavía no pueden dividirse ya que apenas se están activando.



La segunda fase es la fase exponencial o fase logarítmica, la cual es un periodo de duplicación celular donde la población bacteriana crece en proporción a su tamaño en el tiempo.



La tercera fase es la fase estacionaria, donde la tasa de crecimiento disminuye como consecuencia del agotamiento de nutrientes y acumulación de toxinas, aquí el número de bacterias es aproximadamente constante.



La última fase es la fase de declive o muerte bacteriana que se da debido a que se agotan los nutrientes y a otros factores, como un medio excesivamente ácido generado por las bacterias.

3.3. Determinación de los órdenes cinéticos de reacción Al analizar los aspectos relacionados con el reactor y la reacción que transcurre en este, se observa que al efectuar un balance de moles en el reactor para el sustrato, que esta en fase líquida se tiene que:

Considerando el hecho de que la producción de acido láctico se da en la fase de crecimiento logarítmico y en la fase estacionaria, se tiene entonces que la cinética de la reacción de consumo tiene dos comportamientos, el primero es el que se da durante el periodo de crecimiento logarítmico de la población bacteriana (y por ende de la biomasa), que se describe de acuerdo a la ecuación logística, para el cual el orden global aparente de reacción es de 2, siendo el orden individual tanto para biomasa como para sustrato de 1, mientras que el segundo comportamiento sería cuando el crecimiento bacteriano se detenga y la concentración de biomasa permanezca

Como el volumen manejado es constante y nS = SV se simplifica la expresión a:

De acuerdo a la ecuación de Hanson y Tsao planteada para el consumo de sustrato en esta reacción se tiene que:

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Figura 4. Curva de crecimiento bacteriano con respecto al tiempo [19].

constante, luego entonces el termino X de la ecuación de Hanson y Tsao es una constante que se puede incluir en la constante de saturación del sustrato, resultando el orden global aparente y el de concentración del sustrato iguales, siendo estos de orden 1, quedando la ley de velocidad de la siguiente forma:

condiciones proceso.

necesarias

para

efectuar

el

También se puede concluir que el proceso se da por lotes principalmente debido al largo tiempo de activación del cultivo, de 4 horas, sin embargo los otros factores mencionados en la justificación del diseño del reactor influyen considerablemente. Por otra parte se puede concluir que la cinética de la reacción de fermentación varía de acuerdo al crecimiento del cultivo bacteriano, lo cual lleva a que la ley de velocidad de reacción deducida a partir de la literatura [6] tenga dos formas, una con dependencia a la concentración del cultivo y del sustrato, y otra con dependencia solo a la concentración del sustrato, siendo la concentración del cultivo constante, resultado en dos diferentes orden de reacción globales aparentes, de 2 y 1 respectivamente.

Donde C = KSX.

4. Conclusiones El proceso de fermentación láctica de la leche para la obtención de yogurt es un proceso que esta regido por las condiciones optimas a las que el cultivo bacteriano puede fermentar la leche de manera eficiente y rápida, para el cultivo empleado por la empresa Coolechera, lactobacillus bulgaricus, estas son una temperatura de trabajo de 40°C y 8 horas de proceso, donde la acidez final debe estar dada por un pH de 4-4.5, valores de operación esperados para bacterias termófilas. Este proceso debe ser llevado a cabo con el más sumo cuidado para evitar la inhibición o la desactivación del cultivo bacteriano, o que la materia prima que entre al reactor no este a las

No se debe olvidar que existen diferentes modelos que pueden describir adecuadamente el proceso de fermentación tanto para el cultivo bacteriano estudiado como para otros relacionados al mismo proceso, de modo que para un análisis mas completo se requeriría efectuar investigaciones que provean de datos para poder efectuar los análisis correspondientes. Aun así los datos tomados de la literatura provienen de fuentes confiables, por lo cual se concluye que la 7

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[19] M. Zwietering, I. Jongenburger, F. Rombouts, K. Van’t Riet, Applied and Environmental Microbiology, Vol 56 N°6 (1990) 1875, 1877, 1879.

validez del análisis realizado para efectos de ilustración no es un problema.

5. Referencias [1] AMIOT, Ciencia y Tecnología de la Leche, Editorial Acribia, Zaragoza, España, 1991, p 359-366. [2] ALFA – LAVAL, Manual de Industrias Lácteas, 2° Edición, Iragra S.A. Madrid, España, p 169-174. [3] J. Henriksen, Milk for Health and Wealth, FAO Diversification booklet N°6 (2009) 1 – 8. [4] K. Steinkraus, Antonie van Leeuwenhoek 49 (1983) 337-339. [5] S. Alonso, M. Herrero, M. Rendueles, M. Díaz, Biomass and Bioenergy 34 (2010) 931 – 932 [6] M. Jakymec, H. Morán, G. Páez, J. Ferrer, Z. Mármol, E. Ramones, Revista Científica FCV-LUZ Vol. XI N°1 (2001) 53-59. [7] G. Tsao C. Yang, Biotechnology and Bioengineering Vol. XVIII (1976) 1827-1830. [8] U. Kulozik, J. Wilde, Enzyme Microb. Technol. vol. 24 (1999) 297 – 302. [9] A. Schepers, J. Thibaultb, C. Lacroix, Enzyme and Microbial Technology 30 (2002) 176–186. [10] D. Altiok, Kinetic Modelling of Lactic Acid Production from Whey, Izmir Institute of Technology, Izmir, Turkey, 2004. [11] L. Serna, A. Rodriguez, Cienc. Tecnol. Aliment. Vol 5 N°1 (2005) 54 – 65. [12] A. Amrane, Enzyme and Microbial Technology 28 (2001) 827–834. [13] B. Zhao , L. Wang, F. Li, D. Hua , C. Ma, Y. Ma, P. Xu, Bioresource Technology 101 (2010) 6499–6505. [14] W. Fu, A. Mathews, Biochemical Engineering Journal 3 (1999) 163 – 170. [15] L. Rogers, E. Whittier, 229.

J. Bacteriol. (1928) 211 -

[16] T. Payot, Z. Chemaly, M. Fick, Enzyme Microb. Technol. vol. 24 (1999) 191 – 193. [17] P. Fernández, F. Castañeda, J. Jiménez–Barbero, M. Martín–Lomas, Carbohydrate Research 271 (1995) 31, 32. [18] L. Zecca, J. Mesonero, A. Stutz, J. Poirée, J. Giudicelli, R. Cursio, S. Gloor, G. Semenza, FEBS Letters 435 (1998) 225, 226.

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