Procediminetos en Microbiologia Clinica 1ª Ed.pdf

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Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: Gonzalo Piédrola de Angulo

José Elías García Sánchez Mª Luisa Gómez-Lus Centelles Fernando Carlos Rodríguez López Aurora Torreblanca Gil

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INDICE 1.- Introducción y Objetivos. 2.- Normas básicas generales. 3.- Hemocultivo. 4.- Urocultivo. 5.- Tracto gastrointestinal 5.1.- Heces (coprocultivo). 5.2.- Hisopos Rectales. 5.3.- Muestras digestivas altas 5.4.- Otras muestras digestivas bajas. 6.- Tracto respiratorio 6.1.- Tracto respiratorio Superior 6.2.- Tracto respiratorio Inferior 7.- L.C.R. 8.- Líquidos orgánicos. 9.- Tracto Genital. 9.1.- Tracto genital femenino. 9.2.-Tracto genital masculino 9.3.- Muestras para el estudio de clamidias y micoplasmas. 10.- Exudados oculares. 11.- Exudados óticos. 12.- Piel y tejidos blandos. 13.- Muestras odontológicas. 14.- Catéteres y drenajes. 15.- Biopsias 16.- Necropsias. 17.- Médula ósea. 18.- Otras investigaciones en sangre y suero. 19.- Investigación de microorganismos especiales. 19.1.- Anaerobios 19.2.- Micobacterias. 19.3.- Hongos 19.4.- Parásitos intestinales y no intestinales. 19.5.- Virus. 20.- Bibliografía

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1. RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS 1993 1.INTRODUCCION Y OBJETIVOS El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se basa en el estudio de los síntomas y signos clínicos, así como en la demostración de la presencia de su agente productos o de la huella que éste ha dejado en su contacto con el sistema inmunocompetente del individuo. El diagnóstico clínico es en muchos casos bastante demostrativo para el médico bien avezado en recoger los datos que la historia clínica y la exploración le ofrecen, pero, aún así, este diagnóstico deberá ser confirmado por un diagnóstico de laboratorio. Aún más, hay casos en que por la clínica sólo se puede llegar al diagnóstico del agente causal. Por otro lado un mismo microorganismo puede dar una gran variedad de cuadros clínicos, en una o varias localizaciones. Por todo ello, la única confirmación de un diagnóstico clínico es el diagnóstico etiológico, que ofrece el laboratorio de microbiología clínica. Toda la información diagnóstica que el laboratorio de microbiología puede proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida. Por ello, una toma mal realizada, pobremente recogida o mal transportada determinará un posible fallo en la recuperación de los agentes patógenos o de la microbiota normaml, que puede inducir a errores diagnósticos, e incluso a un tratamiento inadecuado del enfermo. Este hecho es bien conocido de los microbiólogos, pero no tanto de muchas de las personas que realizan las tomas en clínicas, salas y consultas, por lo que es necesaria la preparación continuada de dicho personal sanitario, al que hay que concienciar del gasto inútil y la falsedad de los datos obtenidos a partir de una analítica realizada de forma inadecuada. El objetivo de este trabajo es realizar una puesta al día de la recogida, transporte y conservación de las muestras microbiológicas reseñando el material necesario, la técnica de obtención, volumen, número y transporte de cada una de ellas, según las distintas localizaciones y características especiales de aquellas o de los microorganismos a investigar. Aunque cada capítulo ha sido realizado por su autor, la lectura conjunta por los autores de la Subcomisión y las múltiples reuniones de la discusión científica y positiva, nos han

llevado a la responsabilización conjunta de todo lo escrito, que esperamos sea de utilidad y consulta para todo al que estos procedimientos acuda.

2. NORMAS BÁSICAS GENERALES Son muchas las consideraciones generales que deben guiar la recogida y envío de muestras microbiológicas, con criterio didáctico y no solamente temporalmente, ya que muchas de ellas son simultáneas, podemos estudiarlas en los siguientes apartados: volante o vale de petición, obtención de la muestra, recogida de la misma y transporte. 2.1 Vale de petición. Cada muestra deberá ir acompañada de un volante de petición a ser posible con copia autocalcable, que deberá estar correcta, legible y completamente cumplimentada. Cada laboratorio tiene sus modelos propios, único o varios (bacteriología, serología, micología o parasitología), muy detallados o no. En general, cada petición debería suministrar al laboratorio la sufuciente información para que la muestra se procesara convenientemente y se interpretarán los resultados; sin embargo, no siempre sucede así con lo que se evitan errores en la transcripción y se ahorra tiempo de procesamiento; en este caso, el papel autocopiable es imprescindible. Las copias sirven para la comparación de cultivos repetidos, el control de las infecciones hospitalarias, las futuras investigaciones o peticiones judiciales; una copia siempre quedaría de control en el laboratorio. Si el vale de petición y el impreso de resultados no van unidos, éste último precisará todas las copias antes citadas. La utilización de ordenadores en el área administrativa de los laboratorios facilita enormemente el almacenamiento y recuperación de los datos de todo tipo, ya programados. Todo volante o vale de petición deberá poseer las cinco áreas siguientes: 1. Filiación y datos administrativos, donde se deben especificar el nombre y apellidos, sexo y edad del paciente, el médico solicitante y el centro, servicio, o consulta al que pertenezca, así como cualquier otro dato de identificación, como el número de cama, de afiiación a la Seguridad Social, de historia clínica, etc.

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2. Datos clínicos, como fecha del comienzo de la enfermedad, diagnóstico clínico de presunción, estado inmunitario del paciente, etc. Todos estos datos son de gran interés para orientar las técnicas que hay que seguir. 3. Datos de la muestra, como fecha de la obtención y, en algunos casos, la hora, naturaleza del producto y exacta localización de la toma, así como el procedimiento de extracción, o si se ha seguido alguna técnica especial (punción transtraqueal, vesical, etc.) 4. Terapéutica seguida: antibíoticos, que se han administrado y tiempo desde la última toma o inyección. El ideal es que todas las muestras se tomarán antes de empezar un tratamiento antibiótico. 5. Area para la solicitud, indicando claramente el tipo o tipos de determinaciones que se desean, y en caso de que se desee la búsqueda de un microorganismo determinado, se reseñará éste (M. tuberculosis, Mycoplasma,etc.). Muchos laboratorios añaden una sexta área, en la que se hace constar la fecha y hora de entrada de la muestra en el laboratorio, hecho que ha de tenerse en cuenta especialmente en las peticiones de urgencia, que en muchos centros poseen un vale de distinto color (p.ej. rojo) al de los normales. Existen muchos modelos de vales, algunos de ellos con los datos preimpresos, para que solo sea necesario marcar los correspondientes a cada uno. El volante puede poseer también un espacio en blanco para la emisión de los resultados. Con el uso generalizado de los ordenadores, estos dan directamente los resultados de muchas pruebas, enviándose los datos de la impresora al Servicio solicitante, a la vez que se almacenan con las finalidades más arriba citadas. Así mismo, es muy útil que los vales estén numerados, y que lleven 3 ó 4 etiquetas adhesivas con el mismo número para adherir al recipiente de la muestra. 2.2 Obtención de la muestra. Hay situaciones en que es conveniente la toma junto a la cama del enfermo, como en hemocultivos y líquido cefalorraquídeo (LCR), pero en otras es imprescindible realizarla en el propio laboratorio como en exudados genitales que requieren una observación en fresco al microscopio (chancro sifilítico, trichomonas) y siembra inmediata (Chlamydia, Ureaplasma).

En lineas generales en toda la localización es necesario que la toma se efectúe en el sitio exacto de la lesión con las máximas condiciones de asepsia que eviten la contaminación con microbios exógenos, que la muestra nunca se ponga en contacto con antisépticos o desinfectantes, que la toma sea lo más precoz posible y que se prefieran siempre los productos purulentos frescos líquidos (recogidos por aspiración directa con geringa) o tejidos sospechosos, a las muestras tomadas con hisopos o torundas con algodón. Se tomarán cantidades adecuadas de la muestra, que se estudiarán con detalle en cada uno de los apartados siguientes. Todas las muestras deben recogerse antes de la instauración del tratamiento antibiótico. Cuando esto no es posible, se obtendrán justo antes de la administración de la dosis del antimicrobiano, o tras 48 horas de la retirada del mismo, indicándolo en el vale de petición. 2.3 Recogida de la muestra. Cada tipo de muestra requiere un material estéril para recogida e incluso transporte de la misma. Aunque éste se estudia con detenemiento en cada uno de los apartados correspondientes, en las páginas siguientes se recogen los principales envases, contenedores, hisopos, tubos, etc, de uso en el laboratorio de microbiologia. 2.4 Transporte. Todas las muestras deberán ser enviadas lo más rápidamente posible al laboratorio, por desgracia es casi imposible que sean transportadas y procesadas dentro de las dos primeras horas de recogida, con escasas e importantes excepcionales (LCR en meningitis agudas), problema que se agrava en las tomas efectuadas durante la noche o desde lugares alejados geográficamente del laboratorio. La mayoría de las bacterias resisten bien las temperaturas bajas, por lo que los productos pueden mantenerse en la nevera unas horas, pero el LCR (el meningococo es muy sensible al frío), exudados, heces y muestras de anaerobios no deben ser refrigerados (2º-8ºC). En todos los casos, el envío de la muestra debe evitar la salida (y posible contaminación) del contenido, por lo que el recipiente debe de cerrarse con seguridad, o utilizar un doble recipiente, siempre quedarán claras la identidad de la muestra, de la persona a quien pertenece, y los servicios solicitante y receptor.

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ENVASES / CONTENEDORES

Cuando la viabilidad de las baceterias es muy escasa o la posibilidad de desecación de la muestra es grande (favoreciéndose la destrucción bacteriana) y la toma no puede realizarse en el mismo laboratorio, se usarán medios de transporte. Se trata de medios, tales como el Stuart o Amies, que no son nutritivos, sino que preservan las bacterias existentes, sobre todo si son escasas, a la vez que impiden el crecimiento exagerado de otra flora bacteriana no deseada. Estos medios existentes en el comercio pueden ser para bacterias aerobias o anaerobias, y aunque pueden conseguir supervivencias de hasta 24 horas a temperatura ambiente, deberán

enviarse también lo más rápidamente posible al laboratorio. Mención especial requiere cualquier tipo de muestras obtenidas a partir de enfermos con presumible o demostrada hepatitis vírica o SIDA, por ser infectivos no sólo el suero, sino todas las secreciones. Las muestras serán debidamente señalizadas para prevenir la posibilidad de contagio del personal, para ello, en muchos laboratorios se utilizan etiquetas de color amarillo o rojo, con el fin de hacer más visible su procedencia. En casos de envíos por correo, siempre se seguirán las normas existentes para el transporte de productos biológicos peligrosos.

SISTEMAS DE TRANSPORTE ESPECIFICOS PARA EL ESTUDIO DE ANAEROBIOS 1º Viales y tubos con atmósfera anaerobia y base de ágar con indicador para transporte de líquidos o hisopos

2º Hisopos con atmósfera anaerobia

3º Tubos con atmósfera anaerobia y medio de transporte prerreducido para líquidos e hisopos

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4º Bolsas y jarras de anaerobios

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA ESTUDIO DE ANAEROBIOS 1º Muestras líquidas a) Jeringuillas b) Tubos

c) Viales o tubos con atmósfera anaerobia

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2º Hisopos

3º Tejidos

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3. HEMOCULTIVO. A. MATERIAL NECESARIO. · Frascos de hemocultivo. · Compresas de goma. · Jeringas y agujas de punción IV. · Gasas estériles. · Guantes de goma estériles. · Alcohol etílico o isopropílico al 70%. · Solución Yodada. B. OBTENCION DE LA MUESTRA. -Retirar los tapones externos de los frascos. -Desinfectar los tapones de goma con alcohol iodado o con iodóforo, dejándolo secar al menos un minuto. -Localizar por palpación la vena que se va a puncionar. Debe utilizarse una vena distinta para cada extracción. Desinfectar con alcohol una zona de piel de unos 10 cm de diámetro. Se comenzará por el centro y se irán haciendo círculos concéntricos hacia el exterior. - Repetir el paso anterior pero con el alcohol iodado, dejándolo secar durante un minuto. - Extraer la sangre sin tocar en ningún momento el campo desinfectado. Si fuera necesario palpar nuevamente la vena se utilizarán guantes de goma estériles o se desinfectarán los dedos de la misma manera que la piel del paciente.

- Introducir la sangre en los frascos evitando que entre aire en el frasco para cultivo en anaerobiosis. La ventilación se realizará en el laboratorio de Microbiología. Mover los frascos para que la sangre y el medio de cultivo se mezclen. Introducir los frascos a 37ºC. C. VOLUMEN DE LA MUESTRA. La cantidad de sangre a introducir en cada frasco viene determinada por el modelo utilizado en cada hospital, entre 15-20 ml por toma en adultos y 1-3 ml en niños. Como norma general es adecuado que la sangre mantenga una proporción 1:10 con el medio de cultivo. Es decir, para un frasco de 100 ml, introducir 10 ml. de sangre. En caso de neonatos y niños pequeños en que no se pueden obtener volúmenes grandes de sangre es suficiente una cantidad de 1-5 ml, que se introduce en un solo frasco. D. NÚMERO DE MUESTRAS. Tres hemocultivos por paciente, previos al tratamiento antimicrobiano. El intervalo entre las extracciones debe ser superior a una hora cuando sea posible, pero cuando exista una gran urgencia en iniciar el tratamiento, este intervalo puede acortarse hasta 15 minutos. En caso de sepsis y endocarditis subaguda las extracciones se

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reparten en 24 horas y en caso de que sean los hemocultivos negativos, obtener tres muestras más al día siguiente. E. TRANSPORTE. Deben enviarse al laboratorio. Hasta su envío mantener a 35-37ºC; cuando esto no sea posible, mantener a temperatura ambiente. Nunca debe refrigerarse ni congelarse. F. OBSERVACIONES. Cuando no haya venas accesibles puede realizarse la extracción de sangre arterial. No son adecuadas las muestras procedentes de catéter, solamente en caso de que se sospeche infección del propio catéter y se complica su retirada; se recomienda tomas del brazo opuesto y otras del brazo del catéter, para saber si es intra o extraluminal. En caso de sospecha de determinados microorganismos (Brucella spp, Neisseria gonorrhoeae...) ponerse en contacto con el laboratorio de Microbiología.

4. UROCULTIVOS. 1.

ORINA OBTENIDA MEDIA.

POR

MICCIÓN

A. MATERIAL NECESARIO. - Gasas estériles. - Jabón neutro. - Recipiente de boca ancha con tapa de rosca hermético y estéril. - Bolsas de plástico o colectores estériles para niños. B. OBTENCION DEL PRODUCTO. La muestra idónea es la primera micción de la mañana, ya que permite la multiplicación de bacterias durante la noche. Técnicas para mujeres. - La paciente debe quitarse la ropa interior. - Se lavará las manos cuidadosamente con agua y jabón, las enjuagará con agua y las secará con una toalla limpia. -Se separarán los labios mayores y menores, y los mantendrá separados en todo momento hasta que se haya recogido la orina. - Con una gasa enjabonada se lava bien la vulva pasándola de delante hacia atrás, se repetirá el proceso un total de 4 veces.

- Enjuagar cuidadosamente con agua hervida para eliminar los restos de jabón. - Se indicará a la paciente que orine desechando los 20-25 primeros mililitros, tras lo cual y sin interrumpir la micción, se recogerá el resto de la orina en el recipiente. - El frasco debe sujetarse para que no tome contacto con pierna, vulva o ropa del paciente. Los dedos no deben tocar el borde del frasco o su superficie interior. Técnica para hombres. - Lavado de las manos con agua y jabón. - Retraer completamente el prepucio, que se mantendrá así en todo momento, hasta que se haya recogido la orina. - Limpiar el glande con jabón neutro. - Eliminar los restos de jabón enjuagándolo con agua hervida. - Se pedirá al paciente que orine desechando los primeros 20-25 mililitros para, sin interrumpir la micción, recogerse el resto de la orina en el recipiente estéril. Técnica para niños. - En niños y niñas mayores la orina se recoge de forma similar a los adultos. - En niños y niñas más pequeños, la orina se recogerá en colectores o bolsas estériles especialmente diseñadas para ellos de la siguiente forma: * Lavado cuidadoso de los genitales y área perineal igual que en los adultos. * Colocar la bolsa de plástico o el colector. * Vigilar la bolsa cada 30 minutos y tan pronto como el niño haya orinado, deben retirarse y enviarse al laboratorio para su procesamiento. * Si la micción no se ha realizado en una hora, se repite la operación colocando una nueva bolsa. C. VOLUMEN MINIMO DE LA MUESTRA. Es suficiente un volumen de orina de 5-10 ml. (Tabla nº1). D. TRANSPORTE. La orina debe llegar al laboratorio en el plazo de una hora. Cuando esto no sea posible debe refrigerarse a 4ºC durante un tiempo máximo de 24 horas. El laboratorio debe controlar el transporte, garantizándose el que las muestras han sido refrigeradas desde el momento de su toma, siendo admisible, si no puede garantizarse el transporte correcto, la utilización de algún conservante (ácido bórico al 2% o el sistema comercial con bórico-formiato).

TABLA 1: RECOMENDACIONES SOBRE EL VOLUMEN DE ORINA DETERMINACION

VOLUMEN (ml)

COMENTARIOS

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BACTERIA HONGOS MYCOBACTERIAS

0,5-1 >20 >20

ANAEROBIOS

1

VIRUS

10-15

PARÁSITOS.

PRIMERA ORINA DE LA MAÑANA. PRIMERA ORINA DE LA MAÑANA. PRIMERA ORINA DE LA MAÑANA TRES DÍAS CONSECUTIVOS. ASPIRADO SUPRAPÚBICO, ENVIAR EN UN SISTEMA DE TRANSPORTE PARA ANAEROBIOS PRIMERA ORINA DE LA MANANA, ENVIAR CON HIELO Y TRANSPORTAR AL LABORATORIO INMEDIATAMENTE. ORINA DE 24 HORAS.

E. OBSERVACIONES. - En pacientes ingresados con imposibilidad de recoger la muestra por sí mismos, se realizará sondaje vesical por personal sanitario experto con las medidas asépticas oportunas. - Para la investigación de anaerobios es necesario que la orina se obtenga por punción suprapúbica. - Para la búsqueda de micobacterias, la orina se recoge de la forma descrita anteriormente durante tres días consecutivos. En este caso el volumen de orina debe ser 100-150 ml. y se elegirá preferentemente la primera micción de la manana. Cuando se sospecha la presencia de hongos y virus, el volumen de orina será superior a 20 ml. y en el caso de parásitos se recogerá la orina de 24 horas.

estando el paciente en decúbito supino, con una jeringa de 10 ml. y con aguja larga (calibre 19) se aspira el contenido vesical (fig. 1). En caso de orina obtenida por punción suprapúbica se enviará al laboratorio lo antes posible en la misma jeringa de la extracción, tras expulsar el aire de su interior y con la aguja pinchada en un tapón de goma estéril, indicando en volante adjunto, procedencia de la muestra o técnica empleada para su recogida (dato importante a la hora de valorar el recuento de colonias). Indicaciones. Evidencia clínica del cuadro urinario con recuentos bajos o nulos, neonatos y lactantes, cateterización contraindicada o dificultosa, búsqueda de anaerobios y urocultivos repetidos con dos o más bacterias.

2. ORINA VESICAL. Es la orina obtenida por punción suprapúbica o por citoscopia. La punción suprapúbica requiere un buen conocimiento de la técnica y de las precauciones que hay que adoptar, con rigurosa asepsia, descartando problemas de hemostasia y con la vejiga palpable y previa desinfección y anestesia local; se punciona ésta a 1,5 cm. de la sínfisis pubiana, en la línea media,

3. ORINA DE PACIENTES CON CATETER PERMANENTE.

A. MATERIAL NECESARIO. - Gasas. - Alcohol 70º o solución yodada. - Jeringa o aguja estéril. - Recipiente estéril

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Figura 1: Punción suprapúbica. B. OBTENCIÓN DEL PRODUCTO. - Se limpiará con catéter con una gasa humedecida en alcohol o solución yodada. Dejamos secar unos minutos. -Pinchar directamente con la aguja el catéter, por la zona desinfectada, aspirando entre 3-5 ml. C. TRANSPORTE. Puede enviarse en la jeringa o pasar la orina a un recipiente estéril. Si no puede llevarse al laboratorio, se debe refrigerar a 4ºC. D. OBSERVACIONES. Como regla general se considera que la muestra de sonda vesical no es una muestra adecuada y que está justificado rechazar su procesamiento.

5. TRACTO GASTROINTESTINAL 5.1 HECES. A. MATERIAL NECESARIO. -Recipiente de boca ancha para recoger las heces, tipo orinal, bacinilla o cuña. No es necesario que esté estéril, sólo es preciso que esté limpio. No contendrá restos de jabones, detergentes, desinfectantes o iones metálicos. -Recipiente estéril de boca ancha y cierre hermético para enviar la muestra. Puede ser válido el empleado para recoger orinas, aunque es preferible utilizar un recipiente que tenga espátula para tomar la muestra de las heces. -Medios o sistemas de transporte para heces. Se emplean sólo si la remisión de la muestra se retrasa y los distribuye el laboratorio de Microbiología. Existen sistemas comerciales para bacterias (CaryBlair o modificaciones o solución de glicerol tamponado) o para parásitos con el fin de fijarlos [PVA (alcohol polivinílico /10% de formalina), SAF (acetato sódico/ácido acético/formalina), MF]. -Espátulas, cucharillas o depresores. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA. - Si son formadas o pastosas se toma una porción del recipiente donde hayan sido emitidas y se transfieren al sistema elegido para el envío al laboratorio. Se seleccionan zonas donde haya sangre, moco o pus. No son válidas las muestras contaminadas con orina. No debe utilizarse para la recogida papel higiénico, porque suelen

tener sales de bario que inhiben algunas bacterias enteropatógenas. C. VOLUMEN MÍNIMO. Heces formadas o pastosas: al menos 1 ó 2 gr. para virología, añadir de 2 a 4 gr. más. Muestras del tamaño de una nuez son muy adecuadas pues permiten realizar la mayoría de las investigaciones posibles. Heces líquidas: entre 5 y 10 ml. D. TRANSPORTE. - Para el estudio bacteriológico es suficiente enviar la muestra en un recipiente estéril si se va a procesar en el plazo de 1 ó 2 horas después de su emisión. En caso contrario se remite en un sistema de transporte para bacterias. En ambos casos se mantiene en refrigeración hasta el procesamiento, para evitar el sobrecrecimiento de la flora normal que puede enmascarar o destruir a los enteropatógenos. El frío puede afectar la viabilidad de Shigella spp. Para el estudio de toxinas de C. difficile, la muestra se puede mantener hasta 48 horas en refrigeración, congelada a -20ºC se puede mantener indefinidamente. Este tipo de muestra, preferiblemente sin medio de transporte, es indispensable para el examen en fresco, el ensayo de las toxinas de C. difficile, detección por concentración de huevos o parásitos y estudios virológicos (cultivos, inmunoelectromicroscopía, ELISA, o látex para rotavirus). - Es preferible enviar las muestras para estudio virológico sin medio de cultivo, pues este diluye las partículas virales disminuyendo la sensibilidad. Si su envío se retrasa mucho es necesario utilizar un medio de transporte. Se enviarán en recipientes colocados en hielo. Para el estudio de parásitos es útil además, enviar una muestra pequeña en un medio fijador. Una parte en dos de fijador de alcohol polivinílico. E. OBSERVACIONES. - Las muestras para coprocultivo, deberán tomarse antes de la administración de antimicrobianos o agentes antidiarréicos. Es conveniente también evitar, sobre todo para estudios parasitológicos la utilización previa de antiácidos y laxantes oleoso, así como de los compuestos habitualmente utilizados para estudios radiológicos digestivos (bario, bismuto).

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- Indicar siempre el juicio díagnóstico de presunción y si el paciente es menor de un año. - Solicitar las investigaciones especiales explícitamente (C. difficile, C. perfringens, S. aureus, etc.). - Si con la primera muestra no se detecta la presencia de enteropatógenos, es necesario enviar en los días siguientes, dos tomas adicionales. En general, para los estudios parasitológicos, se deben enviar tres muestras tomadas en diferentes días. F. MUESTRAS INADECUADAS. - Muestras fecales. - Heces emitidas anteriores a dos horas y que no hayan sido refrigeradas. - Las tres tomas realizadas el mismo día. 5.2 HISOPOS RECTALES. A. MATERIAL NECESARIO. - Hisopos rectales con medio de transporte. - Guantes. B. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA. En general debe desaconsejarse su uso, aunque hay que recurrir a él si no se puede disponer de heces, como en neonatos o adultos debilitados. Se ha demostrado eficaz en el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae, Campylobacter spp., Shigella spp. (protege de la desecación), C. difficile, especialmente en el hospital, virus herpes simplex y en portadores anales de Streptococcus pyogenes. No es válido para la búsqueda de antígenos. Para realizar la toma se introduce el hisopo sobrepasando un poco el esfínter anal y se rota para hacer la toma de las criptas anales, dejar 10 a 30 segundos para que se absorban los microorganismos y retirar. Una vez realizado se introduce en un medio de transporte. C. TRANSPORTE. Se introducen inmediatamente en medio de transporte adecuado (Stuart, Cary-Blair, para anaerobios en el caso de C. difficile), pues así se protege a las bacterias de la desecación y se envía rápidamente al laboratorio. D. OBSERVACIONES. Son válidas las referentes a las heces. E. MUESTRAS INADECUADAS. - Hisopos rectales secos. - Hisopos rectales sin medio de transporte. - Hisopos con heces cuando se busquen bacterias distintas a enteropatógenos.

5.3 MUESTRAS DIGESTIVAS ALTAS. 1. ASPIRADOS. - Lavado gástrico, aspirado duodenal. A. MATERIAL NECESARIO. - Tubo de lavado gástrico. - Recipientes estériles de boca ancha, tubo de tapón de rosca, tubo de vacío. - Medio de transporte para parásitos. - Cápsula de Entero-test. - Solución salina. B. TOMA DE MUESTRAS. Lavado gástrico: (ver tema de muestra para estudio de micobacterias). Aspirado duodenal: Para la búsqueda de Giardia intestinalis, Strongyloides stercolaris, Ascaris lumbricoides. Introducir el tubo a través de la boca hasta alcanzar el duodeno y aspirar; para la búsqueda de G. intestinalis es necesario llegar a la tercera porción del duodeno. Como método alternativo, existe la posibilidad de la cápsula duodenal, (ver toma de muestra para estudio de parásitos). C. VOLUMEN MÍNIMO. - De 0,5 a 3 ml en el aspirado duodenal. D. TRANSPORTE. - En un recipiente estéril de boca ancha, tubo de vacío o tubo de tapón de rosca, si se envía y procesa rápidamente. Fijado en PVA o formalina al 5% si hay demora en el transporte o procesamiento. - Mantener las muestras a temperatura ambiente. 2. BIOPSIA Y TOMAS OBTENIDAS POR ENDOSCOPIA. A. INDICACIONES. -Biopsia esofágica: candidiasis e infecciones por Citomegalovirus y HSV - Biopsia gástrica y duodenal: Helicobacter pylori. - Biopsia de intestino delgado: G. intestinalis, Cryptosporidium, Microsporidium. B. MATERIAL NECESARIO. Endoscopio y material complementario. - Tubos estériles de tapón de rosca. -Tubos estériles de tapón de rosca con caldo tioglicolato para H. pylori. - Tubos de transporte con medio para parásitos. - Tubos de transporte con medio para virus. - Tubos con solución salina para muestras pequeñas.

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C. TOMA DE MUESTRAS. - Introducir oralmente el endoscopio y recoger la biopsia mediante pinzas, cepillado reiterado o lavado (25-30 ml de solución salina) con posterior aspiración del material. - En sospecha de infección por H. pylori es fundamental obtener varias muestras tanto de la base como de los cuatro cuadrantes del margen de la úlcera, sin olvidar la biopsia de la mucosa antral. 5.4 OTRAS MUESTRAS DIGESTIVAS BAJAS. En este apartado se incluyen la biopsia rectal empleada para la detección de Entamoeba histolytica, el HSV y Balantidium coli, y las muestras tomadas por sigmoidoscopia para la detección de E. histolytica, micobacterias y colitis seudomembranosa por C. difficile y S. aureus. A. MATERIAL NECESARIO. - Sigmoidoscopio, rectoscopio y material complementario. - Pipetas. - Tubos de tapón de rosca estériles con o sin solución salina. - Tubo de transporte para anaerobios. B. TOMA DE MUESTRA. Biopsia rectal: emplear pinzas para tomar muestras de las lesiones o de la mucosa rectal posterior a unos 7-10cm del esfínter anal. Sigmoidoscopia: toma con pinzas o con pipeta, para la búsqueda de parásitos se realizan después de la defecación normal o 2-3 horas después de una defecación conseguida con laxantes. C. TRANSPORTE. - En tubo de tapón de rosca. Si la muestra es pequeña o se va a dilatar el envío se emplearán tubos con solución salina para evitar la desecación. - El envío debe ser inmediato y la conservación adecuada; si se sospecha C. difficile emplear medio para transporte de anaerobios. Para la búsqueda de parásitos se envía inmediatamente al laboratorio o en su defecto las muestras tomadas con pipeta se incluirán en fijador.

6. TRACTO RESPIRATORIO. 6.1 TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR. 1. FARINGO-AMIGDALINO.

- Depresor lingual. - Torunda de algodón sin medio transporte (fig. 5).

de

B. TÉCNICA. Bajo visión directa, con la ayuda de un depresor lingual, se tocará con la torunda en todas las partes con exudado, membranas o inflamación. Se deben frotar las criptas tonsilares y la faringe posterior. No tocar nunca la mucosa oral, lengua o úvula. C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Basta con una torunda. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. No requiere medidas especiales para su transporte y conservación. D. OBSERVACIONES. Se investigará rutinariamente la presencia de Streptococcus beta-hemolítico del grupo A (S. Pyogenes). En las sospechas de difteria deberán mandarse porciones de membrana, una torunda faríngea y una torunda nasofaríngea por vía pernasal. 2. NASOFARINGE. Es la muestra indicada para la investigación de Bordetella pertussis. A. MATERIAL NECESARIO. - Torundas flexibles de alginato cálcico. - Para aspirados: Tubo aspirador de Teflón o jeringa y catéter. B. TÉCNICA. Frotis: pasar la torunda a través de la nariz suavemente, hasta llegar a la nasofaringe. Hay que mantener la torunda cerca del septum y suelo de la fosa. Rotar la torunda y extraerla. Aspirado: Aspirar el moco, pasando el tubo de teflón o un catéter conectado a una jeringa por vía pernasal, de igual forma que la torunda. C. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Ante la sospecha de Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae y Corynebacterium diphteriae, o para la detección de portadores de Slaphylococcus aureus o Neisseria meningitidis. D. MATERIAL NECESARIO. - Torundas de alginato cálcico flexibles. E. TECNICAS.

A. MATERIAL NECESARIO.

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Introducir la torunda unos 2 cm en la nariz, girar suavemente contra la mucosa de la superficie nasal y extraer. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Las muestras deben procesarse antes de 2 horas. OBSERVACIONES. Los microorganimos encontrados en fosa nasal no tienen por que ser los mismos que se aíslan en el seno en caso de sinusitis, por lo que los cultivos de exudados masales no sirven para el diagnóstico etiológicos de la sinusitis y no pueden sustituir nunca a la punción del seno. SENOS PARANASALES. Se realiza la punción-aspiración de los mismos, lo que suele requerir un especialista en O.R.L. o personal especializado en dicha técnica. A. MATERIAL NECESARIO. -Povidona iodada al 10%. - Contenedor estéril. -Medio de transporte para anaerobios. -Material quirúrgico de O.R.L. B. TÉCNICA. -Desinfectar el lugar de la punción con Povidona. -Introducir una aguja en el antrum maxilar por debajo del cornete inferior, o en el seno frontal por debajo del marco supraorbital del ojo. -Aspirar el líquido del seno. Cuando no se obtenga líquido, instalar 1 ml de suero salino estéril y aspirarlo nuevamente. -Inyectar una parte de la muestra en un medio de tranporte para anaerobios y enviar el resto en un contenedor estérli o en la propia jeringa. C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se intentará obtener al menos 1 ml de muestra. D. TRANPORTE Y CONSERVACIÓN. Deben enviarse inmediatamente al laboratorio utilizar un medio de transporte. 4. CAVIDAD ORAL. Esta muestra se emplea habitualmente para el diagnóstico de candidiasis o de la "Angina de Vincent". A. MATERIAL NECESARIO. - Torundas de algodón sin medio de transporte. - Portas limpios.

B. TÉCNICA. - Se pedirá al paciente que se enjuague la boca con agua. - Tras enjuagar la boca, frotar o raspar las lesiones con una espátula o con una torunda y hacer una extensión sobre un porta. - Se repetirá la toma con una segunda torunda para cultivo (sólo para la investigación de Candida albicans). C. NÚMERO DE MUESTRAS VOLUMEN. 1 extensión en porta + 1 torunda.

Y/O

D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. No requiere medidas especiales para su transporte y conservación. 6.2 TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR. 1.- Esputo, esputo inducido. 2.- Jugo gástrico. 3.- Aspirado traqueobronquial simple. 4.- Punción transtraqueal (P.T.T.). 5.- Muestras obtenidas a través de fibrobroncoscopia. 5.1.-Broncoaspirado (BAS). 5.2- Cepillado bronquial con catéter telescopado. (CBCT) (catéter telescopado de doble luz ocluido en su extremo distal. CTO). 5.3.Lavado broncoalveolar (LBA). Protegido o no. 5.4.-Biopsia transbronquial (BTB). 5.5.-Punción pulmonar transbronquial. 6.- Muestras obtenidas por abordaje percutáneo. 6.1.-Punción pulmonar aspirativa (PPA) Transtorácica. 6.2.-Punción biopsia pulmonar. 6.3.-Biopsia pulmonar con toracoscopio. 6.4.-Biopsia pulmonar por tarocotomía (BPT). 7.-Muestras extrapulmonares. 7.1.-Líquido pleural. 7.2.- Biopsia pleural. 7.3.- Sangre venosa. 1. ESPUTO, ESPUTO INDUCIDO. En las condiciones habituales de la clínica diaria, no es una muestra representativa de la situación existente en el tracto respiratono inferior por su mezcla con secreciones procedentes de todo el arbol traqueobronquial y con la flora saprófita de la orofaringe. No obstante es un método fácil y rápido cuya utilidad o relación entre resultado obtenido y verdadera etiología depende en gran medida de su correcta obtención, control de calidad antes de iniciar

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su procesamiento, tipo de agente que se pretenda detectar y valoración adecuada del resultado. A.MATERIAL NECESARIO. - Frasco estéril de boca ancha y hermético. - Suero fisiológico estéril y nebulizador. B.TÉCNICA O METODOLOGÍA DE LA OBTENCIÓN DEL PRODUCTO. - Enjuagar la boca con agua destilada estéril o solución salina. - Obtener el esputo tras una expectoración profunda, preferentemente matinal. De no producirse expectoración espontánea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones de suero fisiológico estéril (15 ml durante 10 minutos), siendo útil además realizar un drenaje postural o fisioterapia respiratoria. C.VOLUMEN MÍNIMO. De 2 a 10 ml, si es posible. D.TRANSPORTE Y CONSERVACION. Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si no es posible, conservar en frigorifico 4ºC. E.OBSERVACIONES. - Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibiótico. - No es útil para anaerobios. - No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia. - La expectoración debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente (mas de 25 leucocitos polimorfonucleares por campo 100x, y de 10 células epiteliales por campo 100x). 2. JUGO GASTRICO. En niños pequeños o en pacientes que no expectoran y tragan sus esputos, puede realizarse una aspiración gástrica tras un periodo de ayuno de 8 horas. Válido no sólo para un número muy pequeño de microorganismos especialmente resistentes al pH gástrico, como micobacterias. 3. ASPIRADO TRAQUEOBRONQUIAL SIMPLE. Obtención con sonda de aspiración. De valor análogo al esputo por su contaminación con la flora orofaríngea. No emplear anestésicos en su obtención por su poder bactericida. 4. PUNCION TRANSTRAQUEAL.

A. MATERIAL NECESARIO. - Guantes, paños, gasa estériles. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Alcohol yodado al 1 ó 2% o un iodóforo al 10% como Povidona iodada. - Solución salina. - Jeringas estériles. - Aguja y catéter nº 14-16 (de subclavia). - Anestésico local / lidocaína al 1-2% con adrenalina. B. TÉCNICA O METODOLOGÍA DE OBTENCIÓN DEL PRODUCTO. De infección de la piel con alcohol yodado o Povidona yodada. -Introducción del catéter por punción a través de la membrana cricotiroidea, inyectar solución salina y aspirar. C. VOLUMEN DE LA MUESTRA. La máxima cantidad de aspirado posible. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Expulsar el aire de la jeringa, pinchar la aguja en un tapón de goma estéril y enviar inmediatamente al laboratorio. Si esto no es posible depositar la muestra en un medio de transporte para anaerobios y mantener a temperatura ambiente hasta su procesamiento. E. OBSERVACIONES. -Útil en el diagnóstico de anaerobios. -Útil en enfermos graves que no expectoran o lo hacen con esputos de calidad insuficiente. -Indicado ante neumonías que responden mal al tratamiento empírico y neumonía nosocomial. - No aconsejable en enfermedad obstructiva crónica ni en enfermos hospitalizados durante largo tiempo ya que pueden encontrarse muy colonizados. Contraindicado en hipoxia severa y trastornos de coagulación. Posibles complicaciones como enfisema subcutáneo o hemoptisis. 5. MUESTRAS OBTENIDAS A TRAVES DE FIBROBRONCOSCOPIA. En términos generales las muestras obtenidas por fibrobroncoscopia salvo el cepillado bronquial por catéter telescopado (CBCT), son muestras contaminadas en mayor o menor grado con flora orofaríngea. A. MATERIAL NECESARIO. - Material específico para broncoscopia. - Recipiente estéril hermético. - Tubo estéril con 1 ml de solución Ringer.

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- Material de corte estéril. B. TRANSPORTE V CONSERVACION. Enviar inmediatamente al laboratorio. Cuando no sea posible, conservar en frigorífico a 4ºC. C. OBSERVACIONES. Es aconsejable recoger tres esputos en días consecutivos tras la broncoscopia. D. TÉCNICA O METODOLOGÍA DE OBTENCIÓN DEL PRODUCTO. Pueden emplearse las siguientes: 5.1. BRONCOASPIRADO (BAS). Recogida de secreciones respiratorias a través de fibrobroncoscopio, pudiendo introducirse de 3 a 5 ml de suero fisiológico previo a la aspiración. Con menor grado de contaminación que el esputo. 5.2 CEPILLADO BRONQUIAL POR CATÉTER TELESCOPADO CBCT. Cepillado de la mucosa bronquial del lóbulo afectado a través de un fibrobroncoscopio mediante un cepillo telescopado protegido por un doble catéter ocluido distalmente para evitar la contaminación de vías altas. 5.3 LAVADO BRONCOALVEOLAR LAB. Lavado de un segmento pulmonar (lóbulo medio o língula) previo anclado del broncoscopio, introduciendo de 20 a 50 ml de suero fisiológico. Indicado especialmente en procesos pulmonares intersticiales. De escasas complicaciones, pero no obvia la contaminación orofaríngea cuyo problema puede disminuirse si se inserta un tubo endotraqueal para pasar el broncoscopio. 5.4 BIOPSIA TRANSBRONQUIAL BTB. Obtención de tejido pulmonar mediante técnica broncoscópica. Posible contaminación de la pinza de biopsia. Complicaciones: neumotorax, hemorragia. 6. MUESTRAS OBTENIDAS POR ABORDAJE PERCUTÁNEO. Dentro de las técnicas invasivas son las que permiten la obtención de muestras más representativas del parénquima pulmonar, no obstante, sólo deben emplearse cuando fracasen otros métodos menos invasivos o cuando la situación del enfermo haga imprescindible conocer el diagnóstico etiológico.

-Material quirúrgico específico para punción. -Recipiente estéril y hermético. -Formol al 10%. -Suero fisiológico.

B.VOLUMEN MÍNIMO. Si es un producto de aspiración, la mayor cantidad posible. Si es una pieza de biopsia, una cuña de 3ml., cuando sea posible. C. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. Si es un producto de aspiración, depositar en tubo estéril. Si es una pieza de biopsia se divide en dos fragmentos: uno se coloca en suero fisiológico o formol al 10% y se envía para estudio anatomo-patológico, y el otro, destinado a ser cultivado en Microbiología, se introduce en un tubo estéril con suero fisiológico. Debe enviarse inmediatamente al laboratorio. D. TÉCNICA O METODOLOGIA OBTENCION DEL PRODUCTO.

DE

Pueden emplearse las siguientes: 6.1 FUNCION PULMONAR ASPIRATIVA (PPA) TRANSTORÁCICA. Obtención del exudado de las lesiones pulmonares a través de una punción transtorácica con aguja ultrafina con control radioscópico o ecográfico. Debe aplicarse ante infiltraciones densas (no intersticiales) y sobre todo si son periféricas. Contraindicado en pacientes con bullas, trastornos de coagulación y sospecha de hidatiadosis. Posibles complicaciones, como neumotórax y hemoptisis. Es una muestra ideal para estudio en infección anaerobia grave en niños, especialmente en edades tempranas. 6.2 PUNCION BIÓPSICA PULMONAR. Biopsia transtorácica con trocar. Sólo en casos excepcionales y en caso de lesiones muy periféricas debido al alto riesgo de neumotórax. 6.3 BIOPSIA TORACOSCOPIO.

PULMONAR

6.4 BIOPSIA PULMONAR TORACOTOMÍA BPT. Permite la selección visual del neumónica a cielo abierto.

A. MATERIAL NECESARIO.

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CON POR aerea

Obtención por toracocentesis.

7. MUESTRAS EXTRAPULMONARES. 7.1 LIQUIDO PLEURAL.

INDICACIONES Y VALORACION DE LAS MUESTRAS RESPIRATORIAS. MUESTRAS

INDICACIONES G C L MY N A MT H V PC

VALORACIÓN

ESPUTO

* * *

*

*

*

*

ACEPTABLE

ESPUTO LÍQUIDO

* * *

*

*

*

*

* ACEPTABLE

ASPIRADO TRAQUEOBRONQUIAL

* * *

*

*

*

*

ACEPTABLE

PUNCIÓN TRANSTRAQUEAL

* * *

*

* *

*

*

MUY BUENA

BRONCOASPIRADO

* * *

*

*

*

*

BUENA

LAVADO BRONCOALVEOLAR

* * *

*

*

*

*

BUENA

LAVADO BRONCOALVEOLAR PROTEGIDO * * *

*

* *

*

* *

* MUY BUENA

BIOPSIA TRANSBRONQUIAL

* * *

*

*

*

* *

* MUY BUENA

PUNCION PULMONAR TRANSBRONQUIAL * * *

*

*

*

* *

* MUY BUENA

PUNCION PULMONAR ASPIRATIVA BIOPSIA PULMONAR NECROPS IAS

* * * * * *

* *

* * * *

* *

* * * *

* MUY BUENA * EXCELENTE

LIQUIDO PLEURAL

* * *

*

* *

*

*

EXCELENTE

SANGRE

* *

*

*

EXCELENTE

G: Gram C: Cultivo habitual L: Legionella MY: Mycoplasma N: Nocardia A: Anaerobios MT: Micobacterias H: Hongos V: Virus PC: Pneumocystis carinii 7.2 BIOPSIA PLEURAL. Cerrada o por pleuroscopia. 7.3 SANGRE VENOSA. Hemocultivo. Según técnica señalada.

7 . LÍQUIDO CEFALORRAQUIDEO A. MATERIAL NECESARIO. - Paños estériles. - Guantes estériles. - Gasas estériles. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Povidona yodada. - Anestésico local. -Jeringuillas de 5-10 ml. -Agujas de puncion IM. -Trócares de punción lumbar de varios tamaños. -Tubos limpios y estériles con tapón de rosca. Es necesario que estén totalmente

lim-pios pues la presencia de bacterias muertas por la esterilización puede inducir a errores por tinciones falsamente positivas. - Sistemas de presión de LCR de un solo uso. B. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA. Se obtendrá antes de instaurar cualquier terapeutica antibiótica. 1.-LCR obtenido por punción lumbar: - Se localiza la zona elegida para la punción lumbar mediante palpación de los espacios intervertebrales una vez colocado el paciente en la posición adecuada. - Se desinfecta con alcohol al 70% una zona de uso 10 cm de diámetro en el área elegida, la aplicación del desinfectante se hace de forma concéntrica del centro a la periferia. Se repite la operación con povidona yodada que se deja secar durante un minuto. - Realizar la punción entre los espacios inter-vertebrales L3-L4, LA-L5 o L5-S1, siguiendo las normas de la más estricta asepsia. - Al llegar al espacio subaracnoideo retirar el estilete y dejar salir libremente el líquido cefalorraquídeo que se recogerá en tres tubos sin conservantes con tapón de rosca.

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Generalmente el primero para el estudio bioquímico, el segundo para el estudio microbiológico y el tercero para investigación de células (este suele ser el más transparente aunque la punción haya sido traumática). No obstante, el tubo más turbio se enviará a Microbiología. 2. LCR obtenido de reservorio Ommaya: - Hacer la toma de lugar de colección del reservorio previa desinfección. C. VOLUMEN MÍNIMO. - Para el estudio bacteriológico rutinario es suficiente 1 ml, aunque es preferible disponer de volúmenes superiores. - Para hongos o micobacterias se necesitan al menos 2 ml adicionales más por cada uno de los estudios, siendo deseable llegar a los 10 ml - Para estudio de virus se necesita al menos 1 ó 2 ml más. D. TRANSPORTE. El producto debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues alguno de los agentes etiológicos como S. pneumoniae, pueden lisarse rápidamente a partir de una hora tras su recogida. Si no es posible se mantendrá en estufa a 35-37ºC y una parte se incubará en un frasco de hemocultivo que se mantendrá en idénticas condiciones hasta su procesamiento en el laboratorio. Si no se dispone de estufas se mantendrá a temperatura ambiente. Nunca deberá refrigerarse pues se puede afectar la viabilidad de N. meningitidis y H. influenzae. En el LCR no se estudian rutinariamente anaerobios. En caso de solicitar una investigación se enviará en un medio de transporte de líquidos para estudio de anaerobios o en hemocultivo de anaerobios. Las muestras para el estudio de virus se enviarán en hielo, si el envío se retrasa más de 24 horas, se deberá de conservar a -70ºC. E. OBSERVACIONES. Como la meningitis suele surgir por un proceso bacteriémico se solicitarán simultáneamente hemocultivos, pudiendo ser así mismo estudiadas las posibles lesiones metastásicas cutáneas. Es necesario que el médico señale claramente las investigaciones solicitadas (bacterias habituales, micobacterias, anaerobios, hongos o virus).

En este apartado trataremos de los líquidos orgánicos, habitualmente estériles, salvo LCR, como: Peritoneal, de diálisis peritoneal, pleural, articular y pericárdico. A. MATERIAL NECESARIO. - Paños estériles. - Gasas estériles. - Guantes estériles. - Jeringuillas y agujas estériles. No se deben utilizar jeringuillas heparinizadas, pues heparina lleva conservantes que pueden interferir la viabilidad de los microorganismos. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Povidona yodada. - Recipientes estériles con tapón de rosca. - Recipientes estériles de boca ancha (ej. urocultivo). - Sistemas de transporte de líquidos para estudio de anaerobios. - Frascos de hemocultivos. - Hisopos. - Heparina. B. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA. Varía dependiendo del líquido corporal que se trate, pero siempre deberá seguirse una técnica rigurosamente estéril al 70%. - Desinfectar la piel con alcohol, haciendo círculos concéntricos desde el centro hacia la pe feria en una zona de unos 10 cm de diámetro. - Repetir el paso anterior con povidona yodada, dejando secar durante un minuto. En pacientes con hipersensibilidad al iodo, realizar la desinfección con alcohol dos veces consecutivas. - La toma se hace por punción percutánea (toracocentesis, paracentesis, punción pericárdica o punción articular) de forma aséptica para evitar la contaminación por la flora cutánea o ambiental. La punción pericárdica se realiza con control electrocardiográfico. - Una vez realizada la toma percutánea se retira la povidona yodada de la piel con un apósito impregnado en etanol al 70%. - Más raramente se pueden realizar tomas de estas localizaciones en el transcurso de intervenciones quirúrgicas. En esta circunstancia debe desaconsejarse el uso de hisopos, siendo preferible también la aspiración; se utilizarán si el contenido no puede ser aspirado. - La muestra del líquido de diálisis peritoneal ambulatoria crónica puede ser la propia bolsa que lo contiene.

8. LÍQUIDOS ORGÁNICOS. C. VOLUMEN MÍNIMO.

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Para el estudio bacteriano rutinario es suficiente de 1 a 10 ml. Cuando se requiera la investigación de Mycobacterium spp. u hongos se enviará un volumen superior a 10 ml. Esta es la mínima cantidad necesaria para el estudio bacteriológico del líquido empleado en la diálisis peritoneal. En el caso de que el procesamiento se lleve a cabo por filtración se debe enviar al menos 1.000 ml. D. TRANSPORTE. Si es necesario evitar la coagulación de algunos de estos líquidos se usará heparina sin conservantes; otros anticoagulantes pueden tener acción bacteriana. No usar la jeringuilla utilizada para la recogida. Si se emplea es imprescindible sustituir la aguja por una estéril tapada con su correspondiente protector. Los recipientes idóneos son tubos estériles de tapón de rosca o de presión negativa sin conservantes. Se llenarán hasta cerca del tapón, de esta forma pueden ser útiles para el estudio de anaerobios, especialmente si la muestra es purulenta. Viales o tubos prereducidos para el transporte de muestras para el estudio de anaerobios. Se emplearán especialmente en aquellos productos en los que habitualmente se encuentran estas bacterias, como es caso de los empiemas pleurales. Hemocultivos, se inocularán 10 ml. Este es un sistema adicional a los anteriores. Está particularmente indicado cuando el envío se puede retrasar o en los líquidos que pueden coagularse. Si se sospecha anaerobios emplear uno adecuado para estas bacterias. Con su uso se ha incrementado el aislamiento bacteriano en peritonitis espontaneas o en las asociadas a diálisis peritoneal ambulatoria crónica. Tam-bién se recomienda como transporte de líquidos articulares. El líquido de diálisis peritoneal se transporta en frascos estériles de boca ancha o en la bolsa contenedora. Debe desaconsejarse el uso de hisopos, y si se emplean se hará junto a sistemas de transporte para anaerobios. Las muestras deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio y hasta su procesamiento se mantendrán a temperatura ambiente. Cuando las muestras se destinen a la investigación de micobacterias y hongos, deberán mantenerse en nevera.

Los hemocultivos se mantendrán entre 35ºC y 37ºC, o en su defecto a temperatura ambiente. E. OBSERVACIONES. Cuando se utilice una anestesia local, hay que cambiar de jeringuilla y aguja para hacer la extracción de la muestra, ya que los anestésicos pueden inhibir el crecimiento bacteriano.

9. TRACTO GENITAL. 9.1 MUESTRAS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO. 1. Exudados vaginales. 2. Exudados cervicales. 3. Exudados uretrales. 4. Exudados rectales. 5. Endometrios. 6. Culdocentesis. 7. Trompas y ovarios. 8. Vulva. 9. Lesiones cutáneomucosas para campo oscuro (chancros). 10. Ganglios linfáticos inguinales. 11. Líquido amniótico. 12. Productos de la concepción. 9.2 MUESTRAS DEL TRACTO GENITAL MASCULINO. 1. Exudados uretrales. 2. Exudados rectales. 3. Ganglios linfáticos inguinales. 4. Lesiones de campo oscuro (chancros). 5. Muestras para el estudio de la prostatitis 9.3 MUESTRAS PARA EL ESTUDIO DE CLAMIDIAS Y MICOPLASMAS. 1. Muestras para la investigación de Chlamydia trachomatis. 2. Muestras para la investigación de Mycoplasma sp. 9.1 MUESTRAS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO. 1. EXUDADOS VAGINALES A. MATERIAL NECESARIO. - Camilla ginecológica. - Espéculo estéril. - Torundas de alginato cálcico o Dracon, con medio de transporte. B. TÉCNICA. Con la paciente en posición ginecológica se introducirá un espéculo "sin lubricante" (si es necesario para lubricar utilizar agua templada). Recoger la muestra, bajo visión directa, con una torunda, de la zona con mayor

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exudado, o en su defecto, del fondo del saco vaginal posterior. (Véase figura)

Repetir la operación con la segunda torunda.

B. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se obtendrán dos torundas, una destinada al estudio microscópico y otra al cultivo.

B. TÉCNICA. Con la paciente en posición ginecológica introducirá suavemente el espéculo sin lubricar (o lubricado con agua templada). Se limpiará el exocérvix de secreciones vaginales, con una torunda seca. Bajo visión directa se comprimirá cuidadosamente el cérvix con palas del espéculo y se introducirá una torunda en el canal endocervical con un suave movimiento de rotación. (Véase figura) Se repetirá la operación con la segunda torunda.

C. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN El envío de la muestra debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando la muestra pueda procesarse antes de 15 minutos deberán emplearse torundas con medio de transporte tipo Stuart-Amies, que se mantendrán a temperatura ambiente, o preferentemente, en estufa 35-37ºC hasta su procesamiento, que deberá ser antes de 3-6 horas. D. OBSERVACIONES. Aunque ocasionalmente puede aislarse Neisseria gonorrhoeae de muestras vaginales, esta no es la localización habitual de la infección, por lo que no debe descartarse esta posibilidad con un cultivo normal. Cuando se sospeche la infección por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis Mycoplasma hominis o Ureaplasma urealtycum, deberá enviarse muestra endocervical. Para completar el diagnóstico de vaginosis si la toma no se realiza en el servicio de Micro biología, es imprescindible realizar en el momento de la misma, la determinación pH vaginal, la producción de aminas volátiles por la adición de KOH al 10% y observar características del flujo, todos estos datos consignarán en el volante. No deben utilizarse en los días previos a la recogida de la muestra, soluciones antisépticas vaginales, óvulos ni pomadas. 2. ENDOCERVICALES. A. MATERIAL NECESARIO. - Camilla ginecológica. - Espéculo estéril. - Torundas secas sin medio de transporte (para limpieza de exocérvix). - Torundas de alginato cálcico o Dracon con medio de transporte tipo Stuart-Amies. - Torundas con medios de transporte específicos para Mycoplasma y Chlamydia.

C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Deberán recogerse dos torundas, una destinada al examen microscópico y otra al cultivo. Para investigación de Mycoplasma y Chlamydia se recogerá una tercera torunda con medio de transporte específico. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. El envío de la muestra debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando la muestra no pueda procesarse antes de 15 minutos, deberán emplearse torundas con medio de transporte tipo Stuart-Amies, que se mantendrán a temperatura ambiente o, preferentemente, en estufa a 35-37ºC hasta su procesamiento, que será siempre que sea posible antes de 3 horas. No puede garantizarse la viabilidad de Neisseria gonorrhoeae transcurridas 6-8 horas. E. OBSERVACIONES. Debe evitarse el uso de torundas de algodón ya que contienen ácidos grasos instaurados que pueden inhibir el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae. 3. EXUDADOS URETRALES. A. MATERIAL NECESARIO. - Torundas uretrales finas, con varilla de alambre no excesivamente flexible, de alginato cálcico o Dacron con medio de transporte tipo Stuart-Amies. - Gasas estériles.

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B. TÉCNICA. Limpiar cuidadosamente la mucosa circundante con gasas estériles. Introducir la torunda suavemente con un movimiento de rotación hasta penetrar unos 2 cm dentro de la uretra (3-5 cm para la investigación de Chlamydia trachomatis).

(Véase figura) Repetir operación con una segunda torunda.

Cuando no haya sufuciente exudado, puede estimularse mediante un masaje suave de la uretra contra la sínfisis del pubis, a través de la vagina. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Deberán enviarse dos torundas, una destinada al examen microscópico y otra al cultivo. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. Debe ser inmediato. Cuando no puedan procesarse las muestras antes de 15 minutos, se utilizarán torundas con un medio de transporte Stuart-Amies que se mantendrán a temperatura ambiente o, preferentemente, en estufa a 35-37ºC. Las muestras se procesarán siempre que se pueda antes de 3 horas, y como máximo en un plazo de 6-12 horas. OBSERVACIONES. La muestra ha de recogerse preferentemente antes de la primera micción de la mañana, si no es posible, se deberá esperar al menos una hora tras la última micción para recogerla.

muestra no pueda procesarse antes de 15 minutos, deberán emplearse torundas con medio de transporte Stuart-Amies, que se mantendrán en estufa a 35-37ºC hasta su procesamiento. OBSERVACIONES. Cuando se sospeche proctitis por Chlamydia trachomatis, las muestras deberán tomarse mediante visión directa por anoscopia, buscando las lesiones ulcerosas o hipertróficas.

4. EXUDADOS RECTALES. MATERIAL NECESARIO. -Guantes de goma. -Torundas con un medio de tranporte (Stuart-Amies). TÉCNICA. Introducir una torunda suavemente a través del esfínter anal. Rotar contra las criptas rectales, dejar 10-30 segundos para que se absorvan los microorganismos y extraer. Se intentará evitar el contacto con materia fecal. Cuando la torunda salga manchada de heces, deberá tomarse una nueva muestra NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Basta con una torunda, dado que la visión microscópica no es representativa. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. El envío de la muestra debe ser inmdediato siempre que sea posible. Cuando la

5. ENDOMETRIO. Se ha cuestionado ampliamente la utilidad de estas muestras para el diagnóstico endometritis. Los métodos no invasivos como las torundas pasadas a través del cérvix se contaminan sistemáticamente, obteniéndose resultados similares en mujeres con endometritis y en mujeres sanas. Se han descrito varios métodos intentando eliminar la contaminación cervical, como son la aspiración uterina a través de un catéter de doble luz o de torundas protegidas, o el método descrito por Martens et al. con el que se obtienen bajos índices de contaminación tomando las muestras con una torunda o aspirando un catéter, previa dilatación y descontaminación del cérvix con Povidona iodada. En cualquiera de los casos, los resultados del cultivo de estas muestras deben interpretarse con cautela, teniendo siempre en cuenta la posibilidad de una contaminación cervical. Es recomendable sacar hemocultivos, ya que se obtienen resultados positivos en un 30% de los casos de endometritis. 6. CULDOCENTESIS. A. MATERIAL NECESARIO. Se precisa el material quirúrgico que requiera la técnica, contenedores estériles y si se desea la investigación de anaerobios, un medio de transporte específico.

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B. TÉCNICA. Aspiración a través del fondo de saco vaginal posterior con jeringa y aguja. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se intentará obtener 1-5 ml de muestra. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. La muestra se remitirá en un contenedor estéril o en la misma jeringa. Cuando se busquen anaerobios deberá inyectarse una parte de la muestra en un medio de transporte específico. E. OBSERVACIONES. El material obtenido por culdocentesis es representativo de los microorganismos existentes en las trompas. 7. TROMPAS Y OVARIOS. A. MATERIAL NECESARIO. - El material quirúrgico que requiera la técnica. - Agujas y jeringas estériles. - Contenedores estériles. - Medios de transporte para anaerobios. - Torundas de alginato cálcico o cepillos de broncoscopia. B. TECNICA. Deben obtenerse por laparotomia o laparoscopia. La muestra se recogerá directamente a la luz de la trompa mediante una torunda o con un cepillo de broncoscopia. Cuando la trompa esté obstruida se podrá recoger la muestra por punción-aspiración, introduciendo una parte en un medio de transporte para anaerobios y enviando el resto en un contenedor estéril o en la jeringa de la extracción. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se recogerá la máxima cantidad de muestra posible. En el caso de muestras liquidas se intentaran obtener de 1-5 ml. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. Debe ser inmediato. Cuando no sea posible deberán emplearse medios de transporte tipo Stuart-Amies o medios de transponte específicos para anaerobios, que se mantendrán a temperatura ambiente o, preferentemente, a 35-37ºC. 8. VULVA. A. MATERIAL NECESARIO. -Torundas.

-Alcohol etílico o isopropílico al 70%. -Povidona iodada al 5%. -Jeringas y agujas estériles. B. TÉCNICA Desinfectar la piel con alcohol y Povidona iodada, las superficies mucosas se limpiará con agua estéril, nunca con alcohol ni Povidona. Frotar con una torunda entre las lesiones y si hay abscesos aspirarlos con jeringa y aguja. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Deberá obtenerse la mayor cantidad de exudado posible. Cuando se trate de abscesos se intentará obtener al menos 1 ml. D. TRANSPORTE V CONSERVACION. Si la muestra no puede enviarse de inmediato se usarán medios de transporte, en el caso de torundas sirve el medio de Stuart-Amies y para punciones de abscesos una parte se introducirá en un medio de transporte para anaerobios. 9. LESIONES CUTANEOMUCOSAS PARA CAMPO OSCURO. A. MATERIAL NECESARIO. -Guantes de goma estériles. -Gasas estériles. -Suero salino estéril. -Pipeta Pasteur o capilar de vidrio. -Portaobjetos y cubreobjetos. B. TÉCNICA. Una vez colocados los guantes, se limpiará la superficie de la lesión con gasas humedecidas en suero salino. Se evitarán en la limpieza jabones y otras sustancias ya que pueden tener actividad antitreponémica. Con una gasa seca se frotará suavemente la lesión hasta que se obtenga el fluido, intentando no producir demasiado sangrando, ya que pueden interferir en el examen microscópico. Limpiar las primeras gotas de exudado que se obtienen y dejar salir el fluido profundo a la superficie. Recoger el fluido por capilaridad con una pipeta Pasteur o un capilar. Colocar una gota de fluido en un porta limpio y examinar inmediatamente con campo oscuro. Si es necesario, añadir l gota de suero salino. También puede aplicarse el porta directamente sobre el fluido para recogerlo.

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C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Antes de considerar un examen negativo hay que estudiar 3 muestras en días consecutivos. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Debe realizarse la toma en el mismo laboratorio y procederse de inmediato al examen microscópico. 10. GANGLIOS LINFATICOS INGUINALES. A. MATERIAL NECESARIO. - Gasas estériles. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Povidona iodada al 10%. - Jeringa y aguja o material quirúrgico. - Contenedor estéril. B. TECNICA. Desinfectar la piel con alcohol y posteriormente con Povidona, dejándola secar durante 1 minuto. Realizar una punción-aspiración con jeringa y aguja o una escisión quirúrgica del ganglio. Enviar en la jeringa de la punción, o si se trata de una pieza quirúrgica, en un contenedor estéril "sin formol". C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. La máxima cantidad de muestra que se pueda obtener. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. La muestra ha de llegar al laboratorio dentro de la hora siguiente a la extracción. En el caso de punciones-aspiraciones debe realizarse de inmediato. E. OBSERVACIONES. Es preferible obtener la muestra por punción-aspiración de la adenopatía a través de piel sana, que a partir de los puntos de drenaje. Debe avisarse al laboratorio la sospecha de infección por Haemophilus ducreyi para que las muestras sean procesadas adecuadamente. 11. LIQUIDO AMNIOTICO. A. MATERIAL NECESARIO. - Gasas estériles. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Povidona iodada al 10%. -Aguja y jeringa. - Contenedor esteril. - Se requiere la monitorizacion del feto. B. TECNICA.

Punción aspiración con jeringa y aguja tras desinfección de la piel dos veces consecutivas, la primera con alcohol y la segunda con Povidona. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se intentará obtener una muestra de 1-5 ml. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Deberá enviarse al laboratorio lo antes posible para su procesamiento. E. OBSERVACIONES. Debe informarse de la existencia de rotura de membranas de más de 24 horas. 12. PRODUCTOS DE LA CONCEPCIÓN. A. MATERIAL NECESARIO. -Material quirúrgico. -Contenedores estériles. B. TÉCNICA. Procedimientos quirúrgicos. Se enviarán tejidos o aspirados. C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se enviará un bloque de tejido de las zonas sospechosas. En zonas en que se sospeche contaminación enviar un cubo de 6cm³, que incluya una superficie serosa o capsular intacta. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. No debe pasar más de una hora desde su recogida a su procesamiento por el laboratorio de Microbiología. E. OBSERVACIONES. Son muestras habitualmente muy contaminadas y difíciles de evaluar. Suelen ser muestras inadecuadas para cultivo salvo en casos concretos en que se sospeche infección por Listeria monocytogenes o Streptococcus betahemolítico del grupo B (S. agalactiae). Es recomendable sacar hemocultivos, ya que son positivos en 2/3 de los casos de aborto séptico. 9.2 TRACTO GENITAL MASCULINO. 1. EXUDADOS URETRALES. A. MATERIAL NECESARIO. - Torunda uretrales finas, de alginato cálcico o Dracon con medios de transporte tipo Stuart-Amies (Fig. nº6). - Gasas estériles. - Asa de siembra de platino.

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B. TÉCNICA. Cuando exista exudado franco puede recogerse con una torunda o con un asa de siembra e Platino-Iridio. El exudado puede estimularse exprimiendo la uretra. Cuando no se obtenga exudado se introducirá una torunda suavemente con un movimiento de rotación hasta penetrar unos 2 cm. dentro de la uretra (3-5 cm para investigación de Clhamydia trachomatis). Repetir la operación con una segunda torunda. C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Deberán enviarse dos torundas, una destinada al examen microscópico y otra al cultivo. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. Debe ser inmediato. Cuando no puedan procesarse las muestras antes de 15 minutos, se utilizarán torundas con medio de transporte Stuart-Amies que se mantendrán a temperatura ambiente o preferentemente se estufa a 35-37ºC. Las muestras se procesarán siempre que se pueda antes de 3 horas, y como máximo en un plazo de 6-12 horas. E. OBSERVACIONES. La muestra ha de recogerse preferentemente antes de la primera micción de la mañana. Si es imposible, esperar al menos una hora tras la última micción para recogerla. 2. LESIONES PARA CAMPO OSCURO Y GANGLIOS LINFÁTICOS INGUINALES. Se seguirá la misma técnica que para el tracto genital femenino. 3. MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE PROSTATITIS (TÉCNICA DE MEARES-STAMEY). A. MATERIAL NECESARIO. Se preparará el mismo material que para un urocultivo y cuatro contenedores estériles que deberán ir identificados de la siguiente forma: - "F-l" o "Frasco-1" (primera orina). - "F-2" o "Frasco-2" (micción media premasaje). - "F-3" o "Frasco-3" (masaje prostático). - "F-4" o "Frasco-4" (orina post-masaje). B. TÉCNICA.

Retraer el prepucio y limpiar el meato y el glande igual que para un urocultivo. Pedir al paciente que orine, recogiendo los primeros 10 ml. en el primer contenedor "F-1". Recoger los siguientes 10 ml. en el segundo contenedor "F-2". Esta porción corresponde a la "micción media". Interrumpir la micción antes de que se haya vaciado totalmente la vejiga. Hacer un masaje prostático y recoger el fluido en el tercer contenedor ("F-3" masaje prostático). Si no se produce fluido, presionar la uretra en su totalidad 30 segundos. Tras el masaje, acabará saliendo fluido prostático por el meato. Finalmente se pedirá al paciente que orine y se recogerán los 10 ml. primeros de orina en un cuarto recipiente ("F-4" orina postmasaje). C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Frasco 1: 10 ml. Frasco 2: l0 ml. Frasco 3: Toda la muestra que se obtenga. Frasco 4: 10 ml. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. Las muestras deberán procesarse antes de 1 hora. Para períodos más prolongados se deberán mantener en nevera a 4ºC hasta un máximo de 24 horas. E. OBSERVACIONES. Se realizarái cultivos cuantitativos. Cuando el número de bacterias del frasco-1 es mayor al del frasco-2 y frasco-4, se considera que las bacterias son de origen uretral. Cuando el número de bacterias de los frascos 3 y 4 es, por lo menos, 10 veces superior al de los frascos 1 y 2, se atribuye a colonización prostática. Las muestras de semen no son adecuadas para cultivo, al estar sistemáticamente contaminadas, y los resultados obtenidos no son representativos de los microorganismos aislados en próstata. 9.3 MUESTRAS PARA EL ESTUDIO DE CHLAMYDIA Y MYCOPLASMA. 1. MUESTRAS PARA CHLAMYDIA. Para investigación de Mycoplasma y Chlamydia deberán seguirse las directrices de cada laboratorio, ya que el equipo de recogida de muestras, medios de transporte y conservación dependen en parte de la técnica que emplea el diagnóstico (cultivo, inmunofluorescencia, etc.). No obstante, más adelante se describen los

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procedimientos generales para la recogida de estas muestras, destinadas fundamentalmente al cultivo. Las muestras adecuadas no son las secreciones, ya que Chlamydia trachomatis sólo afecta células escamo-columnares, como las células del epitelio de transición del cérvix. No son adecuadas muestras vaginales para estas determinaciones. A. MATERIAL NECESARIO. - Espátulas. - Torundas de alginato cálcico o Dracon con medios de transporte 2-SP.

Cuando no vaya a procesarse la muestra de inmediato deberá emplearse una torunda con 2 ml de medio de transporte (caldo tripticasa soja + 200-400 U/ml de Penicilina). Sirven también el medio de transporte de Chlamydia "2-SP" o el medio de StuartAmies. Las muestras que vayan a procesarse antes de 24 horas podrán mantenerse en nevera (4ºC). Para demoras superiores deberan congelarse a -70ºC.

10. EXUDADOS OCULARES. 1. FROTIS CONJUNTIVALES.

B. TÉCNICA. La muestra se recogerá mediante frotado o raspado enérgico de la zona afectada, siguiendo las instrucciones específicas descritas para cada localización. C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Generalmente es suficiente con una torunda destinada exclusivamente al aislamiento de Chlamydia. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. Las muestras que no puedan ser procesadas de inmediato deberán incluirse en un medio de transporte específico (medio sucrosa-fosfato "2-SP"). Cuando las muestras no puedan procesarse de inmediato se conservarán en nevera (4ºC) hasta 24 horas. Para períodos más prolongados deberán congelarse a -70ºC. E. OBSERVACIONES. Las torundas del alginato cálcico pueden variar en toxicidad frente a Chlamydia trachomatis dependiendo de los lotes 2. MUESTRAS PARA LA INVESTIGACIÓN DE MYCOPLASMAS UROGENITALES. A. MATERIAL NECESARIO. Torundas con medio de transporte. Da igual que las torundas sean de algodón o de alginato cálcico siempre que se use un medio de transporte con proteínas. B. TÉCNICA. La descrita localización.

anteriormente

para

cada

C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Es suficiente con una torunda destinada a este estudio. D.TRANSPORTE Y CONSERVACION.

A. MATERIAL NECESARIO. - Torundas de alginato cálcico o Dracon con medio de transporte Stuart-Arnies. - Suero salino estéril. B. TÉCNICA. Debe obtenerse la muestra antes de la instalación de los analgésicos locales, colirios o antibióticos. Con una torunda mojada en un suero fisiológico frotar sobre la conjuntiva tarsal inferior y el fórnix. Para la investigación de Chlamydia trachomatis, everter el párpado y frotar con una torunda la superficie conjuntival. C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Deberá utlizarse una torunda para cada ojo. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. El transporte deberá ser inmediato. Cuando no sea posible, se utilizarán hisopos con medio de transporte tipo Stuart-Amies, que se mantendrá a temperatura ambiente. Para Chlamydia se utilizará un medio de transporte específico ("2-SP"). E. OBSERVACIONES. Los cultivos conjuntivos preoperatorios no son útiles. El número y tipo de microorganismos de la conjuntiva normal varía diariamente, por lo que estas muestras no son válidas, excepto en el caso de signos inflamatorios a nivel ocular.

2. RASPADOS CONJUNTIVALES. A. MATERIAL NECESARIO. - Espátula de platino flexible de Kimura. - Anestésico local (clorhidrato de propacaína al 0,5%). - Portas limpios con círculos marcados.

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- Vaso de Koplin con metanol al 95%.

transporte para bacterias tipo Stuart-Amies, que se mantendrán a temperatura ambiente.

B. TÉCNICA. Instilar uno o dos gotas de anestésico. Preferentemente se utilizará clorhidrato de propacaína, ya que es el anestésico local que inhibe menos el crecimiento bacteriano. Raspar suavemente con la espatula de Kimura la conjuntiva tarsal inferior, sin inducir sangrado. El material obtenido se colocará en el circulo de un porta limpio. Fijar el porta en Metanol durante 5-10 minutos. C. NÚMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Mínimo 1 portaobjetos con varias improntas corneales. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. Una vez fijados los portas no requieren medidas especiales para su transporte y conservación. 3. RASPADOS CORNEALES. A. MATERIAL NECESARIO. Igual que para los raspados conjuntivales. B. TECNICA. Igual que para los raspados conjuntivales. Realizar el raspado de multiples áreas de ulceración. Es importante que cada raspado se inocule directamente en el medio de cultivo, por lo que se avisará previamente al Servicio de Microbiología que desplazará al personal y/o material necesario para ello.

11. EXUDADOS OPTICOS. 1. OIDO EXTERNO. A MATERIAL NECESARIO. - Torundas de algodón o espátulas. - Un antiséptico suave (ej. Cloruro de Benzalconio al 1/100.) B. TECNICA. Limpieza del oído externo con un antiséptico suave. Se tomará la muestra mediante frotis con torunda, raspado o aspiración del fluido en caso de abscesos. Se obtendrá la muestra del borde activo y el exudado o las secreciones de las zonas profundas. C. NUMERO DE MUESTRAS VOLUMEN. Una torunda para cada oido.

Y/O

D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Si las muestras no pueden enviarse inmediatamente se emplearán medios de

E. OBSERVACIONES. Suele tratarse de muestras de mala calidad y en ningún caso resultan representativas de los microorganismos existentes en oido medio. 2 OIDO MEDIO. A. MATERIAL NECESARIO. El de una miringocentesis (Timpanocentesis). - Torundas estériles. - Contenedor estéril. - Medio de transporte para anaerobios. - Povidona iodada al 10%. B. TÉCNICA. Timpanocentesis: Debe obtener la muestra un especialista en O.R.L. o personal entrenado para ello. Se limpiará el canal auditivo externo con una torunda impregnada en Povidona iodada. Se puncionará el tímpano a través de un otoscopio estéril. La muestra se enviará en un contenedor estéril. Cuando no sea suficiente se tomará con torunda. Si se desea la investigación de anaerobios, se enviará el fluido en un medio de transporte específico. Las muestras en torunda no sirven para cultivo de anaerobios. Muestras con tímpano roto: Tras la limpieza del canal externo se tomará la muestra con torunda a través de un otoscopio estéril. Estas muestras no son válidas para anaerobios, y además el fluido suele colonizarse con flora de CAE, con lo que la interpretación de los resultados es siempre complicada. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se intentará obtener la mayor cantidad de exudado posible. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. El transporte deberá ser inmediato. Cuando exista demora se utilizará un medio de transporte.

12. PIEL Y TEJIDOS BLANDOS. 1. ULCERAS Y HERIDAS SUPERFICIALES. A. MATERIAL NECESARIO. - Suero fisiológico a solución de Ringer lactato. -Jeringa y aguja estériles.

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-Torundas con medio de transporte tipo Stuart-Amies. B. TECNICA. Lavar cuidadosamente la superficie de la herida. Recoger el pus mediante jeringa y aguja, aspirando preferentemente de zonas profundas. Cuando la muestra sea insuficiente, instilar suero o solución de Ringer lactato y aspirarlo nuevamente en la jeringa. Cuando los procedimientos anteriores no sean factibles podrá efectuarse un frotis de las partes profundas de la herida con una torunda. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Para muestras líquidas se intentara obtener 1-10 cm³. En el resto de las ocasiones se enviará la máxima cantidad posible. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. El envío al laboratorio debe ser inmediato. Se utilizará para el envío la misma jeringa de la extracción 2, debidamente identificada si puede procesarse antes de 2 horas y si no usar medio de transporte. E. OBSERVACIONES. Las muestras recibidas en torunda son de escasa rentabilidad y deben obtenerse sólo en circunstancias muy excepcionales, cuando no se pueda recoger la muestra por otros métodos. 2. EXANTEMAS. A. MATERIAL NECESARIO. - Gasas estériles. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Povidona iodada al 10%. - Jeringa estéril. - Aguja IM. - Medio de transporte para anaerobios. B. TECNICA. Aspirar directamente con jeringa y aguja el contenido de las lesiones. Cuando no sea suficiente, instilar una pequeña cantidad de suero salino estéril y aspirarlo. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se obtendrá el máximo volumen de muestra. D. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN. Igual que para úlceras y abscesos.

3. ABSCESOS CERRADOS. A. MATERIAL NECESARIO. - Gasas estériles. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Povidona iodada al 10%. - Jeringa estéril. - Aguja IM. - Medio de transporte para anaerobios. B. TECNICA. Desinfectar la piel. Limpiar la zona con alcohol, de fonna concentrica comenzando por el centro. Abarcar una zona de unos 10 cm. Repetir la operación con Povidona. En pacientes con hipersensibilidad al iodo, en lugar de Povidona se utilizará alcohol dos veces consecutivas. Dejar secar al menos 1 minuto para que la Povidona ejerza su acción antiséptica. Realizar una punción-aspiración del absceso con jeringa y aguja. Introducir una pequeña parte de la muestra en el medio de transporte para anaerobios. Desinfectar la superficie de goma del tapón con Povidona e inyectar con la misma jeringa, parte de la muestra. No deberán utilizarse nunca los medios que hayan adquirido una coloración azul. Dejar el resto de la muestra en la jeringa y remitirla así, o bien, traspasarla a un contenedor estéril. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Deberá enviarse un volumen de muestra entre 1-5 ml. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Las muestras deben enviarse al laboratorio tan pronto como sea posible. Hasta que esto suceda, mantener las muestras y el medio de transporte a temperatura ambiente. E.OBSERVACIONES. Es muy importante especificar en el volante de petición la localización del absceso con vistas a la interpretación de los resultados.

4. FISTULAS Y TRACTOS SINUSALES. A. MATERIAL NECESARIO. - Gasas estériles. - Alcohol etílico a isopropílico al 70%. - Povidona iodada al 10%. - Jeringa y aguja. B. TECNICA.

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Limpiar cuidadosamente la superficie cutánea con alcohol y luego con Povidona. Aspirar el exudado de la parte profunda de la fístula con jeringa y aguja. C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. El volumen óptimo para el cultivo es de 1-5 ml. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Enviar las muestras al laboratorio antes de 2 horas. E. OBSERVACIONES. Este tipo de muestras son inadecuadas para la investigación de anaerobios. Los trayectos fistulosos y sinusales suelen estar colonizados habitualmente por distintos microorganismos que no están implicados en la patogenia de proceso, por lo que estas muestras habitualmente son poco rentables y hay que evaluar los resultados con precaución.

13. MUESTRAS ODONTOLOGICAS. A. MATERIAL NECESARIO. - Algodón - Hisopos. - Puntas de papel. - Anestésico local. - Cureta. - Sistema para el transporte de anaerobios. B. OBTENCION DE LA MUESTRA. Placa subgingival y supragingival: Tras aislar la zona de donde se obtendrá la muestra con rollos de algodón. Se obtiene la muestra con curetas y se seca con algodón estéril. Canal dental: Se desinfecta y se introducen en el canal 1 ó 2 puntas de papel hasta el fondo del canal. Bolsa periodontal: Tras limpiar la placa supragingival se toma la muestra con cureta estéril introdueléndola lo más vertical posible hasta el fondo de la bolsa periodontal. Abscesos: Tras desinfección, puncionar el contenido del mismo. C. VOLUMEN DE LA MUESTRA. El máximo que se pueda disponer. D. TRANSPORTE. Las muestras se remiten rápidamente, evitando el contacto con el oxígeno y la desecación. Es utilizado algún medio de transporte de los indicados en el apartado de anaerobios.

14. CATETERES Y DRENAJES. 1. CATETERES INTRAVASCULARES. A. MATERIAL NECESARIO. - Guantes de goma estériles. - Gasas estériles. - Pinzas y tijeras estériles. - Recipiente estéril con tapa de rosca. - Alcohol etílico a isopropílico al 70%. - Alcohol iodado al 1-2 por 100 o un iodóforo al 10%. B. OBTENCIÓN DEL PRODUCTO. Desinfectar con alcohol una zona de piel de unos 10 cm correspondiente a la zona de entrada del catéter. Hacerlo en forma de círculos comenzando par el centro. - Repetir la misma operación, pero con el alcohol iodado o el iodóforo, dejando que se seque durante un minuto. Retirar el catéter con la máxima asepsia. Ayudándonos de las pinzas y las tijeras estériles, cortar los 5 cm distales del catéter que corresponden a la porción intravascular. Introducir el segmento de catéter en un recipiente estéril correctamente identificado. C. TAMAÑO DE LA MUESTRA. 3 cm. de la porción más distal. D. TRANSPORTE. La muestra deberá enviarse al laboratorio en un periodo inferior a 30 minutos. Cuando esto no sea posible deberá conservarse en nevera. 2. OTROS CATETERES Y DRENAJES. Son muestras que no se procesan habitualmente en la mayoría de los laboratorios, por lo que se recomienda contactar con el Servicio de Microbiología, previo al envío de dichas muestras.

15. BIOPSIAS. A. MATERIAL NECESARIO. - El material quirúrgico estéril que precise la técnica empleada para la obtención de las biopsias de distintas localizaciones. - Recipientes estériles con tapa de rosca. - Suero salino estéril. - Jeringas y agujas estériles. - Sistemas de transporte para anaerobios (vales, placas con sistemas de generación de atmósfera anaeróbica, jarras de transporte, etc.). B. TECNICA. Muestras sólidas: Se obtendrá un bloque de tejido por escisión quirúrgica procurando incluir las zonas más afectadas, y cuando

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las lesiones estén bien delimitadas se intentará incluir también el borde activo de la lesión. Muestras liquidas: Se obtendrán por aspiración con jeringa y aguja siguiendo técnicas estrictamente asépticas C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Muestras sólidas: Se recomienda obtener una pieza de al menos 5-10 cm³. Muestras liquidas: 5-10 ml³. Muestras líquidas: 5-10 ml. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Las muestras sólidas se introducirán en un recipiente estéril con tapa de rosca, al que pueden añadirse unas gotas de suero salino estéril para prevenir la desecación de las muestras de pequeño tamaño. Cuando se disponga de ellos, las muestras se enviarán en bolsas, campanas o recipientes preparados para mantener un ambiente de anaerobiosis. Las muestras líquidas se introducirán en un vial con medio de transporte específico para anaerobios, que se mantendrá a temperatura ambiente hasta su envío. El envío y procesamiento de estas muestras debe ser inmediato. E. OBSERVACIONES. Es muy importante no introducir las muestras en formol ni en otras sustancias que puedan inhibir el crecimiento de microorganismos, ni utilizar recipientes de dudosa esterilidad. Dado que estas muestras suelen ser de extremada importancia, difícil obtención, con riesgos y molestias para el paciente, y en muchas ocasiones son insustituibles, es recomendable que antes de iniciar el procedimiento se establezca contacto con los Servicios de Microbiología para evitar posibles errores y orientar las investigaciones posteriores en relación a las distintas sospechas clínicas.

16. NECROPSIAS A. MATERIAL NECESARIO. - Material quirúrgico estéril. - Recipientes estériles con tapa de rosca. - Suero salino estéril - Jeringas y agujas estériles. - Frascos de hemocultivo anaerobios para muestras de sangre.

Las muestras se recogerán preferentemente antes de que el cadáver se manipule demasiado o se abra. La piel o las superficies serosas de los órganos deben desinfectarse antes de realizar punciones o extraer bloques de tejidos. Para esto pueden seguirse los procedimientos generales de desinfección, utilizando consecutivamente alcohol de 70º y Povidona iodada al 10%, o bien, cauterizar mediante una espátula al rojo. Muestras sólidas: Se enviará una cuña de unos 6 cm³, que incluya una superficie serosa o capsular intacta. Muestras líquidas: Se obtendrán por aspiración con jeringa y aguja siguiendo técnicas estrictamente asépticas. Muestras de sangre: Se obtendrán por punción-aspiración de cavidades cardíacas derechas. La sangre así obtenida se inoculará en un frasco de hemocultivo anaerobio siguiendo los procedimientos generales descritos en el apartado de "hemocultivos". C. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Muestras sólidas: Se recomienda obtener una pieza de al menos 5-10 cm³ Muestras líquidas: 5-10 ml. Muestras de sangre: 5-10 ml. D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Las muestras deberán transportarse en recipientes estériles con cierre hermético, que no contengan formol ni otras sustancias inhibidoras. Cuando el envío no pueda realizarse rápidamente las muestras pueden conservarse en nevera. E. OBSERVACIONES. Los cultivos de muestras de autopsias se contaminan con frecuencia con bacterias del agua o entericas, lo que debe tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. Para la investigación de virus, hongos, micobacterias, etc, deberán seguirse los procedimientos específicos descritos en sus respectivos apartados.

17. MEDULA OSEA: ASPIRADOS. A. INDICACIONES. - Infecciones fúngicas: histoplasmosis, criptococosis, candidiasis diseminada. - Infecciones bacterianas: tuberculosis, brucelosis. - Infecciones parasitarias: leishmaniasis.

B. TECNICA. B. MATERIAL.

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- Guantes estériles. - Gasas estériles. - Material para anestesia local. - Material para punción ósea. - Povidona iodada. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Tubos de presión negativa con heparina, sin conservantes. Tubos de hemocultivo (lisiscentrigugación). C. TOMA DE MUESTRAS. Localización. La punción se realiza fundamentalmente en el esternón (alternativas válidas: cresta ilíaca, apófisis vertebrales y en niños meseta tibial). Descontaminar la piel según el método ya descrito. Previa anestesia local, fundamentalmente en adultos, se realiza la aspiración estéril de la médula ósea. El volumen obtenido no debe ser inferior a 1ml. D. TRANSPORTE. Mantener a temperatura ambiente para favorecer la coagulación. Enviar rápidamente at laboratorio, puede conservarse varias horas a temperatura ambiente, siempre que la toma haya sido realizada de forma absolutamente estéril.

18. OTRAS INVESTIGACIONES EN SANGRE Y SUERO. A. INDICACIONES. -Serología. -Detección de antígenos bacterianos (H. influenzae, serotipo B, S. pneumoniae, S. agalactiae...) víricas (VIH, hepatitis B..) o fúngicas (C.albicans, Aspergillus, spp...). -Niveles de antimicrobianos. -Título bactericida o inhibitorio sérico. -Amplificación genética (PCR). B. MATERIAL. -Guantes estériles. -Gasas estériles. -Tubos de presión negativa estériles. -Alcohol etílico o isopropílico al 70%. -Povidona íodada. -Sistema de toma de sangre para tubos de presión negativa.

C. TOMA DE MUESTRAS. Procesamiento semejante al del hemocultivo. El tubo debe contener anticoagulantes o conservantes. Recoger entre 8 y 10 ml de sangre, en niños de 3 a 4 ml. En Recién nacidos y lactantes se puede emplear, si no es posible la venipuntura, extracción capilar, en cuyo caso el volumen mínimo será de 0,5 ml. D. TRANSPORTE. Mantener a temperatura ambiente para favorecer la coagulación. Enviar rápidamente al laboratorio, puede conservarse varias horas a temperatura ambiente, siempre que la toma haya sido realizada de forma absolutamente estéril.

19. INVESTIGACION DE MICROORGANISMOS ESPECIALES. 19.1 ANAEROBIOS. La mayoría de las infecciones por bacterias anaerobias son oportunistas y de origen endógeno, es decir, están producidas por la propia flora cutáneo-mucosa del hospedador. Por esta razón, las muestras se tomarán siguiendo procedimientos que eviten su contaminación por esta flora autóctona. En caso contrario sería imposible en la mayoría de las circunstancias, diferenciar los agentes etiológicos de los microorganismos componentes de la flora. Como estas infecciones son generalmente mixtas habrá que investigar además la presencia de anaerobios y/o facultativos. A. TIPOS DE MUESTRAS. Son muestras válidas cualquier fluido o tejido procedente de localizaciones habitualmente estériles. En general, no son válidas las tomas superficiales (tabla). B. MATERIAL NECESARIO. - Material de cura esteril. - Material quirúrgico estéril. - Suero fisiológicos estéril. - Alcohol etílico o isopropílico al 70%. - Povidona yodada. - Anestésico local. - Camilla ginecológica. - Espéculos estériles. - Ultrasonidos o TAC.

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MUESTRAS VALIDAS Y NO VALIDAS PARA EL ESTUDJO DE BACTERIAS ANAEROBIAS (I) LOCALIZACION • • •

Sistema Nervioso Central

• • Cabeza y Cuello

• •

Pulmones

• • • • • • • • •

Aparato Circulatorio

MUESTRAS ADECUADAS Aspirado de abscesos o empiema subdural. Biópsia quirúrgica. Hisopos obtenidos en una intervención y transportados en un medio para anaerobios. LCR (habitualmente no es necesario su procesamiento anaerobio). Aspirado de abscesos o colecciones previa desinfección. Biopsia quirúrgica. Hisopos obtenidos en intervención quirúrgica y transportados en un medio para anaerobios. Aspiración transtraqueal. Aspirado pulmonar percutáneo. Líquido de toracotomía. Muestras tomadas con broncoscopio con cepillo protegido. Hisopos obtenidos en una intervención y transportados en un medio para anaerobios. Sangre Líquido pericárdico. Tejido de válvula cardíaca. Suero (toxina botulínica).

MUESTRAS INADECUADAS

•

Hisopos transportados en un medio para

• •

Hisopos faríngeos o nasofarín. Otros materiales superficiales tomados con hisopos (gingivales, bucales, óticos, etc.)

• • • •

Esputo. Esputo inducido. Aspirados endotraqueal. Exudados de traqueostomía (salvo los obtenidos en el momento de realizarlos.) Muestras broncoscópicas no protegidas. Lavado bronquial. Lavado broncoalveolar normal.

• • •

MUESTRAS VALIDAS V NO VALIDAS PARA EL ESTUDIO DE BACTERIAS ANAEROBIAS (II) LOCALIZACION

MUESTRAS ADECUADAS • •

Abdomen

Estómago e intestino delgado

• • • •

Aspiración percutánea de líquido abdominal previa desinfección. Aspiración del contenido de abscesos, quirúrgica o percutánea (previa desinfección) con control TCA o ultrasonidos. Biopsia quirúrgica. Hisopos obtenidos en una intervención quirúrgica y transportados en un medio para anaerobios. Bilis obtenida quirúrgicamente. Sólo para: a. Síndrome del asa ciega. b. Síndrome de mala absorción.

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MUESTRAS INADECUADAS Hisopos para aerobios Tomas superficiales con hisopos.

c. Intoxicación botulínica. Intestino grueso

Vías urinarias

•

Heces sólo para cultivo o demostración de toxinas C. difficile, C. botulinum, o C. perfringens (toxina o recuento en intoxicación alimentaria).

• •

Orina aspirada por punción suprapúbica. Nefrostomía.

Heces. Efluentes de ileostomía. Efluentes de colostomía. Orina por micción. Orina por sondaje.

MUESTRAS VALIDAS Y NO VALIDAS PARA EL ESTUDIO DE BACTERIAS ANAEROBIAS (III) LOCALIZACION Aparato genital femenino

MUESTRAS ADECUADAS • • • • • • •

Líquido peritoneal obtenido por culdocentesis, laparoscopia. Aspirado endometrial obtenido por succión o por un colector protegido (sistema Pipelle o Accu Culshure) previa desinfección. Contenido de abscesos obtenido por aspiración. Biopsia quirúrgica. Hisopos obtenidos en una intervención quirúrgica y transportados en un medio para anaerobios. Dispositivos intrauterinos sólo para búsqueda de Actinomyces spp. y Eubacterium nodatum. Hisopos vaginales sólo para diagnóstico de vaginosis bacteriana (gram no cultivo) o para demostrar en medios selectivos la presencia de Bacteroides del grupo fragilis en endometritis.

Hueso

• •

Aspiración profunda a través de la piel. Biopsia quirúrgica.

Articulación

•

Aspiración percutánea de líquido articular.

•

Cultivo y enumeración de C. perfrngens en toxi-infecciones alimentarias. Cultivo y/o demostración de toxina de C. botulinum.

Alimentos

•

MUESTRAS INADECUADAS • Hisopos vaginales. • Hisopos cervicales.

•

Material superficial y obtenido con hisopos.

MUESTRAS VALIDAS Y NO VALIDAS PARA EL ESTUDIO DE BACTERIAS ANAEROBIAS (IV) LOCALIZACION • • • Tejidos blandos

• •

MUESTRAS ADECUADAS Aspiración percutánea de heridas abiertas, úlceras y abscesos. Biopsia quirúrgica. Aspirado profundo de fístulas y heridas profundas con geringuilla y catéter pequeño. Tejidos de úlceras o heridas obtenidas por raspado (con cureta). Hisopos de la base de úlceras descontaminadas y transportados en un medio para anaerobios (es el procedimiento menos deseable).

Para la recogida de muestras: - Jeringuillas, agujas, sondas pequeñas. - Curetas. - Broncoscopio. - Cateter telescópico.

MUESTRAS INADECUADAS

•

Material superficial de la piel, mucosas, úlceras, escaras, heridas o fístulas.

- Sistema de aspiración intrauterino (Sistema Pipelle o AccuCulShure). - Hisopos de transporte preferentemente para anerobios. - Sistema de transporte:

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· Agujas con protector. · Sistemas para transporte de líquidos en anaerobiosis. · Sistema para transporte de hisopos en anaerobiosis. · Recipientes para recogida de orina con tapón de rosca. · Tubos estériles de tapón de rosca o de vacío. · Placas de Petri. · Sistemas de anaerobiosis en bolsas. · Jarras de anaerobios. C. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA. Aspiración: Es el mejor método por su sencillez y facilidad; se emplea para obtener fluidos (abscesos cerrados, empiemas, liquidos orgánicos y cavidades cerradas como senos, oído medio, etc) y a veces tejidos. Habitualmente se realiza con jeringuilla y aguja. En ocasiones directamente con jeringuilla, bien porque el material a recoger es escaso o porque la zona donde se realiza está cerca de lugares críticos. En la aspiración de fístulas o abscesos profundos abiertos se emplea un catéter conectado a la jeringuilla. Métodos especiales son aspiración por punción transtraqueal, o lavado broncoalveolar protegido mediante broncoscopio con cateter telescópico en muestras respiratorias o sistemas protegidos para la aspiración intrauterina. La aspiración percutánea requiere una desinfección previa como la descrita en la toma de hemocultivos. En los abscesos pulmonares o intraabdominales, se dirigirá mediante ultrasonidos o TAC y la punción pericárdica se controlará por electrocardiografía. Esta técnica también es adecuada para obtener muestras de celulitis, úlceras, escaras o abscesos abiertos y heridas superficiales. En estos casos se realiza a través de la piel íntegra de las proximidades, siendo en procesos no supurados, a veces es necesario inyectar uno o dos ml de suero fisiológico estéril y reaspirar. La aspiración a través de mucosas (incluido cuello uterino) requiere limpieza previa y desinfección con povidona iodada un minuto. En las fístulas y abscesos profundos abiertos se desinfecta la piel de alrededor, como se ha descrito, y la parte externa de la lesión con Povidona yodada, una vez retirada esta se aspira en profundidad con un catéter.

La aspiración de pus y otros fluidos (bilis, líquido peritoneal, etc.), se puede hacer en el curso de un acto quirúrgico, pero hay que evitar la contaminación por la flora de localizaciones próximas. Las biopsias y muestras tisulares: Son también muy adecuadas para el aislamiento de bacterias anaerobias. Se tomarán muestras de tejidos que manifiesten signos de infección. A parte de las biopsias hay que incluir los raspados, el cepillado broncoalveolar tomado con broncoscopia y catéter telescópico y los sistemas protegidos para la aspiración intrauterina. El raspado se emplea para recoger muestras de heridas o abscesos superficiales y úlceras. Se recomienda hacer una limpieza los días previos a la toma con apósitos, húmedos y secos. Al realizar esta se desinfecta con Povidona iodada diluida al 50% con suero fisiológico, que se elimina posteriormente con suero fisiológico estéril. El tejido se toma de la base. Hisopos: Es el método menos descable sólo se utilizará cuando no se pueda emplear uno de los anteriores. Se emplearán preferentemente hisopos comerciales libres de oxígeno. Se debe realizar con sumo cuidado, pues con este procedimiento la probabilidad de contaminación con los componentes de la flora normal es mayor. Además presenta los inconvenientes de permitir recoger escasa cantidad de muestra, que fácilmente se deseca por la deshidratación del algodón, las bacterias se adhieren a las fibras y no permite la realización de una tinción de Gram de calidad. El uso de hisopos para hacer tomas de zonas habitualmente estériles en el transcurso de cirugía no plantea otros problemas que los derivados de sus limitaciones y el evitar la contaminación por la flora de zonas próximas. En heridas, úlceras y abscesos superficiales se seguirán las normas dadas para el raspado. Su empleo en fístulas y abscesos profundos abiertos debe desaconsejarse pero en caso de emplearse se seguirán las normas descritas para este tipo de tomas empleando la aspiración profunda. Sangre: Se seguirán las normas generales dadas para realizar los hemocultivos. Se evitará que penetre aire en la inoculación de sangre. Sólo debe realizarse hemocultivo específico cuando se sospeche una bacteriemia por anaerobios. Probablemente debe realizarse rutinariamente en Servicios

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donde la bacteriemia por anaerobios es frecuente (Cirugía abdominal y ginecológica especialmente). Algunos anaerobios crecen en los hemocultivos ventilados utilizados para detectar bacteriemias por anaerobios y facultativos. D. VOLUMEN DE LA MUESTRA. La mayor posible pues así se preserva la viabilidad de las bacterias. Muestras líquidas: enviar un volumen de 1 a 10 ml. Cuando se empleen tubos de tapón de rosca procurar llenarlos al máximo. Tejidos: Si es posible mayor de 1 cm³. Con los hisopos se recogeri la máxima cantidad de exudado posible. E. TRANSPORTE. Las muestras se remiten rápidamente, evitando el contacto con el oxígeno y la desecación. Así se impide la disminución de la viabilidad. Las distintas especies tienen diferente sensibilidad al oxígeno, aunque las más frecuentes y resistentes a los antimicrobianos (Bacteroides del grupo fragilis) muestran bastante resistencia. En general se mantienen mejor en los exudados purulentos que en los no purulentos porque en su composición entran numerosos elementos químicos reductores. Se conservan horas en muestras grandes tanto líquidas (> 2ml) como tisulares, porque en ellas se dificulta la difusión del oxigeno. Tanto para estas como especialmente para las más pequeñas se han diseñado sistemas que evitan el contacto con el oxigeno y la desecación: 1. Viales y tubos con atmósfera anaerobia y base de agar para mantener la humedad. En el agar se incluye un indicador de anaerobiosis. Los tubos son de tapón de rosca y se emplean para los hisopos que se introducen en la profundidad del agar, evitando la difusión del oxígeno. Una vez roto el palillo del hisopo el frasco se cierra rápidamente. Los líquidos se inoculan una vez desinfectado el tapón de goma de los viales, cuidando no introducir aire. 2. Tubos para el transporte de hisopos en las que una vez introducidos se genera una atmósfera anaerobia. 3. Tubos con atmósfera anaerobia y un medio de transporte prerreducido. Los líquidos se inoculan previa desinfección de la parte central del tapón que es de goma. Los tejidos e hisopos se introducen desenroscando el tapón y abriendo el frasco, en estas muestras es importante mantener vertical el frasco pues los gases empleados para conseguir la atmósfera son

más pesados que el aire, y así se impide la penetración de este manteniendo el estado de reducción. 4. Bolsas de plástico flexible para conseguir una atmósfera anaerobia. Se cierran con un sistema térmico o con un sistema de pinzas. Dentro se consigue una atmósfera anaerobia mediante un sistema catalítico, y se comprueba con un indicador que cambia de color con las modificaciones de potencial de óxido reducción. Es útil para el transporte de placas de Petri o en cualquier recipiente de tapón de rosca que se cierre una vez conseguida la anaerobiosis para evitar que se vierta el contenido. Muestras líquidas: Aunque durante años se ha recomendado el uso de jeringuillas para su obtención eliminando el aire y clavando la aguja en un tapón de gasa, hoy se desaconseja el empleo de este sistema como método de transporte. El riesgo de pinchazos y el peligro de derramar el contenido han llevado a adoptar esta recomendación, en caso de tener que utilizarse se tapará una vez ajustado con una aguja estéril tapada con un correspondiente protector. En la actualidad se aconseja eliminar el aire tapando la aguja con una goma estéril impregnada en alcohol para eliminar el riesgo de aerosoles, cambiar la aguja por otra estéril e inocular el contenido en uno de los siguientes contenedores: 1. Si es abundante (>1 ml) y se quiere un método barato; en un tubo estéril de vacío o con un tapón de rosca, cuidando que el contenido inoculado llegue cerca del tapón y manteniendo la posición vertical para evitar la oxigenación. 2. Si se prefiere, el contenido es escaso, o el transporte va a dilatarse, se inocula previa desinfección en un vial para transporte de muestras liquidas para el estudio de anaerobios. La ausencia de cambio de color en el indicador presupone la correcta inoculación. Tejidos: 1. Los tejidos (biopsias y raspados) se enviarán en tubos de tapón de rosca, viales para transporte de anaerobio de tejidos , y si son de gran tamaño, en placas de Petri o recipientes para recogida de orina. En cualquier caso los tejidos no deben ponerse en contacto con formol o cualquier sustancia. 2. Los tubos que no contengan una atmósfera anaerobia y las placas de Petri, especialmente si son muestras de pequeño tamaño, se colocarán en bolsas de plástico con una atmósfera anaerobia, los tapones

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de rosca se cerraran una vez conseguida esta. Los recipientes para la orina se pueden transportar en jarras para anaerobios. 3. Los tejidos aspirados se transportan inoculándolos en tubos o viales para transporte de anaerobios. 4. Los cepillos protegidos tomados por broncoscopia se colocaran si se quiere buscar anaerobios en tubos con caldo prereducido que además sirve de diluyente. Hisopos: Deben colocarse en uno de los sistemas comerciales para el transporte de muestra para el estudio de anaerobios, siguiendo el procedimiento previamente descrito. Las muestras se mantendrán a temperatura ambiente hasta su procesamiento, la refrigeración disminuye el número de microorganismos viables porque incrementa la difusión del oxígeno. Solamente hemocultivos y LCR se mantendrán en estufa. Las muestras se procesarán en las dos horas siguientes a su recogida. Si se dilata el tiempo o si las muestras son muy pequeñas se deberá usar un sistema de transporte adecuado. No obstante, muestras líquidas voluminosas, especialmente purulentas o grandes muestras tisulares, conservan la viabilidad de los anaerobios mas tiempo. En los sistemas de transporte específicos, las bacterias se conservan varios días. 19.2 MICOBACTERIAS. 1. NORMAS GENERALES. Deben mantenerse las normas generales correspondientes a las tomas habituales y observar en cada caso las peculiaridades que se indican para cada una de las muestras obtenidas. Los envases empleados serán estériles y de cierre hermético. No se añadirá a la muestra ninguna sustancia conservadora ni antiséptica. Se mantendrá protegida de la luz y el calor. La temperatura ideal para su conservación es de 4ºC. En todo momento se adoptarán las medidas necesarias para evitar que las muestras contaminen el ambiente o las personas. 2. MUESTRAS RESPIRATORIO.

DE

ORIGEN

2.1 ESPUTO. A. MATERIAL NECESARIO - Envase estéril de boca ancha y hermético. - Suero fisiológico estéril y nebulizador.

B. TECNICA DE OBTENCION DEL PRODUCTO. Enjuagar la boca con agua destilada estéril o preferentemente salina. Obtener el esputo tras una expectoración profunda, preferentemente matinal. De no producirse expectoración espontánea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones de suero fisiológico estéril (15 ml. durante 10 minutos), siendo muy útil además realizar un drenaje postular o fisioterapia respiratoria. C. NUMERO DE MUESTRAS. Tres muestras obtenidas consecutivos.

en

días

D. VOLUMEN MINIMO. 2-10 ml. E. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Envio inmediato al laboratorio. Si no es posible, conservar en el frigorifico a 4ºC. F. OBSERVACIONES. Las muestras deben ser recogidas antes del inicio del tratamiento o en su caso es recomendable suspender cualquier tratamiento antimicrobiano de 3 a 5 días antes de tomar la muestra. Las muestras que sólo contengan saliva no deben ser aceptadas. 2.2 JUGO GASTRICO. En niños pequenos o en pacientes que no expectoran y tragan sus esputos, puede realizarse una aspiración gástrica tras un periodo de ayuno de unas 8 horas. Volumen mínimo 50 ml. Debe remitirse y procesarse a la mayor brevedad posible. Los lavados gástricos no son recomendables por ser con frecuencia negativos, contaminados, con micobacterias sin interés médico, molestos, y dolorosos para el enfermo. 2.3 PUNCION TRANSTRAQUEAL. Según técnica señalada en el apartado de toma de muestras del tracto respiratorio inferior. 2.4 MUESTRAS RESPIRATORIAS OBTENIDAS POR FIBROBRONCOSCOPIA. Según técnica señalada en el apartado de la toma de muestras del tracto respiratorio inferior para muestras obtenidas a través de: .Broncoaspirado.

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.Cepillado bronquial telescopado. .Lavado broncoalveolar. .Biopsia transbronquial.

por

carácter

2.5 ESCOBILLAJE LARINGEO. Indicado en enfermos en los que no es posible la expectoración espontanea ni inducida. 2.6 MUESTRAS OBTENIDAS POR ABORDAJE PERCUTANEO. Obtención de perenquirna pulmonar por métodos señalados en el apartado de la toma de muestras del tracto respiratono inferior. 2.7 LIQUIDOS Y BIOPSIAS PLEURALES. Recogida esteril por toracocentesis o pleuroscopia. Envio y procesamiento inmediato. Las biopsias pueden enviarse en un tubo que contenga 0,25 ml. de agua destilada estéril. 3. ORINA A. MATERIAL NECESARIO. - Envase estéril de al menos 200 ml. de capacidad, de boca ancha y cierre hermético.

Recoger con hematóforo o bien tomar de un tampón y diluir posteriormente, si es posible en los dos primeros días del ciclo. 4.2 BIOPSIA. De endometrio.- Debe tomarse tanto de la cara anterior del útero como de la cara posterior, y no de una sola. Cervical. 4.3 ESPERMA. 4.4 BIOPSIA TUMORACIÓN.

DE

NODULO

O

5. OTRAS MUESTRAS PARA ESTUDIO DE MICOBACTERIAS. 5.1 MUESTRAS OSTEOARTICULARES. - Líquido articular y sinovial. - Secuestros óseos. - Abscesos fríos. 5.2 HECES. 5.3 LIQUIDO ASCITICO. 5.4 MUESTRAS EN LINFADENITIS. - Biopsia de ganglios. - Abscesos fríos. 5.5 LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO.

B. TECNICA DE OBTENCION DEL PRODUCTO. Recogida por micción estéril de la primera orina de la mañana y si es necesario de la 2ª y 3ª, hasta alcanzar al menos 100-150 ml. En cada micción se recoge toda la orina desechando en el WC sólo los primeros mililitros. C. NUMERO DE MUESTRAS. Tres muestras obtenidas consecutivos.

en

días

5.6 MUESTRAS DE TEJIDOS BLANDOS. - Abscesos. Lesiones cutáneas nodulares o ulceraciones. 5.7 PROCESOS GENERALIZADOS. Extraer 5 ml de sangre en tubo al vacío y enviar al laboratorio lo antes posible. Realizar de 3 a 5 extracciones en días consecutivos. 6. SUERO PARA DETERMINACION DE ANTICUERPOS. Toma de sangre para obtener al menos 2 ml de suero.

D. VOLUMEN MÍNIMO. l00 ml. E. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Envío inmediato al laboratorio. Si no es posible, conservar en el frigorifico a 4ºC. F. OBSERVACIONES. Lavado minucioso de los genitales como se indica en el apartado de la toma de muestra para urocultivo. Es recomendable suspender cualquier tratamiento antimicrobiano de 3 a 5 días antes de la toma. 4. MUESTRAS GENITALES. 4.1 SANGRE MENSTRUAL.

7. FROTIS PARA EL DIAGNOSTICO DE M. LEPRAE. Habitualmente deben realizarse frotis de la piel de las regiones afectadas frotis de la piel de fosas nasales, realizando un escobillaje profundo o lavado nasal. Ocasionalmente puede realizarse toma de linfa de lóbulo de la oreja, punción ganglionar, punción esternal, etc. 19.3 HONGOS. A. MATERIAL NECESARIO. - Recipiente estéril hermético.

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- Placas de Petri estériles. - Lanceta, bisturí, espátulas, pinzas de depilar, tijeras, cortauñas, tijeras corvas y finas estériles. - Torundas o escobillones estériles. - Líquido de transporte. Suero fisiológico adicionado de penicilina (500 U/ml.) y de estreptomicina (500 mcg/ml.) o cloranfenicol (500 mcg/ml.). - Cinta celulósica transparente adhesiva. - Portaobjetos limpios. - Tubos estériles. - Jeringas y agujas estériles. - Solución salina estéril. - Medio de Sabouraud-cloranfenicol en placas. B. REQUISITOS. Como medida general limpiar la piel con alcohol etílico o isopropílico al 70%. Antes de hacer la toma es necesario asegurar que no haya sido aplicado ningún producto antifúngico por vía local o general, al menos en los cuatro días precedentes. C. TECNICA DE LA OBTENCION DEL PRODUCTO. Se ha de realizar según la zona afectada y el diagnóstico clínico: 1. ESCAMAS. 1. En el caso de las lesiones cutáneas secas, se raspan las escamas con la ayuda de una lanceta, o mejor de un bisturí, sobre todo en la periferia de la lesión, zona donde el hongo generalmente tiene mejor vitalidad ya que los hongos se desarrollan de modo centrífugo a partir del punto de inoculación. Si la lesión es pequeña se raspa en su totalidad. Las escamas se hacen caer en una placa de Petri. 2. En el caso de la pitiriasis versicolor, en la que el hongo está localizado en las células epidérmicas superficiales, se aplica sobre la lesión un fragmento de cinta adhesiva transparente, se tira enérgicamente, y se la adhiere sobre un portaobjetos. 3. En el caso de lesiones cutáneas rezumantes se hace la toma con un escobillón estéril, humedecido con solución salina fisiológica. 2. CABELLOS Y PELOS. Se eligen los cabellos o pelos parasitados, si es preciso con la luz de Wood, ya que ciertos cabellos afectados son fluorescentes. Los cabellos enfermos (rotos o contorneados) deben ser arrancados del folículo piloso. Recoger el material en una placa de Petri estéril

3. FRAGMENTOS DE UÑA Y TEJIDO PERIUNGUEAL. 3.1 MICOSIS UNGUEALES. Se elige la zona donde se ha de hacer la toma: la base de la uña, surco periungueal, en caso de onixis por Candida o la extremidad de la misma en el caso de onicomicosis por dermatofitos. Hay que coger las escamas por debajo de las unas introduciendo un bisturí a lanceta en el lecho subungueal anterior, que suele estar despegado, raspando pacientemente hasta llegar a la zona dolorosa, donde extraeremos el material de mejor calidad. Posteriormente se cortan con una tijera fina y curva fragmentos de la uña afectada. El material obtenido se recoge en una placa de Petri. 3.2 PERIONIXIS. En caso de lesiones supuradas de perionixis, se extrae el pus mediante presión y se recoge con un escobillón estéril. 4. EXUDADOS DE MUCOSAS. La toma a nivel de mucosas se realiza por raspado con el borde romo del bisturí a escobillón estéril, y si el examen no se realiza precozmente, se agregan de 1 a 2 ml. de suero fisiológico adicionado del líquido de transporte reseñado, excepto cuando se sospeche de nocardiosis o actinomicosis. Hacer frotis del exudado y al misma tiempo si es posible, sembrar en Sabouraudcloranfenicol con otro escobillón, sobre todo cuando han de enviarse las muestras a un laboratorio distante. 5. EXUDADOS DE ULCERAS. En las úlceras de piel y mucosas, la toma se realiza raspando con bisturí los bordes y fondo de la misma, poniendo especial interés en los bordes, para obtener escamas dérmicas, así como las costras a porciones vegetantes si las hubiera, ayudándose con las pinzas. En todas las lesiones ulcerosas o vegetantes es muy útil la biopsia que debe tratarse como se señala posteriormente. 6. MUESTRAS OFTALMOLOGICAS. En caso de raspado corneal, obtener escamas a exudados debiendo la muestra ser sembrada directa e inmediatamente en Sabouraudcloranfenicol en placa de Petri. 7. PUS DE ABSCESOS.

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Elegir los abscesos cerrados, pues en los abiertos la contaminación bacteriana masiva puede dificultar el diagnóstico. La toma se realiza por punción en la zona fluctuante. Siendo recomendable utilizar jeringa con aguja gruesa, transportándolo en la misma jeringuilla al laboratorio. 8. PUS DE FISTULAS. En caso de lesiones supurativas fistulizadas: Actinomicosis, Nocardiosis, Micetomas, Maduromicosis, etc., se procura recoger la mayor cantidad posible de exudado, por expresión de los trayectos fistulosos, dejando caer en tubo estéril. Es muy importante la recogida de gránulos expulsados a través de la fístula, en cuyo caso pueden recogerse con apósitos y ser depositados en placa de Petri estéril. 9. ESPUTO, MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR. Limpiar la cavidad bucal con una solución de lugol u otro desinfectante. Enjuagar con solución salina. Seguir la técnica igual a la empleada para el diagnóstico bacteriológico, siendo preferibles las muestras obtenidas por fibrobroncoscopia. Es recomendable enviar al laboratorio lo antes posible o conservar en frigorífico a 4ºC. 10. HECES. Se recogen en recipiente estéril, y hermético. En caso de emplearse escobillón, se añade el líquido de transporte indicado. 11. SANGRE 11.1 SERODIAGNOSTICO. Para el serodiagnóstico, se extraen 10-20 ml. de sangre en un tubo estéril, y se recoge el suero, añadiendo 1 a 2 gotas de una solución merthiolato sódico al 1%., o de nitruro de sodio al 5%, por cada ml. de suero, para prevenir la contaminación bacteriana en caso de ser transportada a un laboratorio distante. 11.2 HEMOCULTIVOS. Igual que la empleada para el diagnóstico bacteriológico. Pueden emplearse hemocultivos especificos y sistemas de lisis centrifugación, que mejoran el rendimiento. 12. OTROS LIQUIDOS BIOLOGICOS. Líquido cefalorraquídeo, médula ósea, líquido pleural, orina, etc. Se realiza con igual técnica que la empleada para el diagnóstico bacteriológico.

13. BIOPSIA DE TEJIDOS U ORGANOS. La biopsia es uno de los procedimientos más seguros para el diagnóstico de una micosis interna. La pieza de biopsia se divide en 2 fragmentos: uno se coloca en suero fisiológico o formol al 10% y se envía para estudio anatomopatológico y el otro, destinado a ser cultivado en Microbiología, se introduce en tubo estéril con suero fisiológico o agua glicerinada al 25%, agregando líquido de transporte excepto si se sospecha una nocardiosis o actinomicosis. D.OBSERVACIONES Debido a la creciente patología producida por hongos oportunistas es muy importante extremar las condiciones de asepsia necesarias para una correcta toma que evite las posibles contaminaciones por hongos saprofitos y/o aerovagantes. 19.4 PARASITOS. A. MATERIAL NECESARIO: - Recipiente (orinal o similar) lo más amplio posible. - Recipiente estéril de boca ancha, a ser posible con cucharilla. B. OBTENCION DEL PRODUCTO. En los tres días previos al estudio parasitológico, el enfermo seguirá una dieta en la que: * No podrá tomar: medicamentos, papilla de bario, patatas, verduras, legumbres y frutas. * No podrá tomar: pan tostado (no integral), pastas, arroz, huevos, higado y sesos. En algunos casos es preferible y necesario administrar un purgante, con el fin de aumentar la posibilidad del hallazgo de parásitos. Será un purgante salino, como sulfato de sodio o fosfato y carbonato de sodio; no deben usarse aceites minerales o compuestos de bismuto o magnesio, ya que las gotas o cristales procedentes de ellos pueden enmascarar los parásitos o confundirse con trofozoitos. Con una cucharilla se recogerá una pequeña cantidad de heces recien emitidas y se enviarán en un recipiente estéril con tapa de rosca. Cuando macroscópicamente se hayan visto formas compatibles con parásitos en el año o en las heces, se recogerán en el recipiente y se añadirá una pequeña cantidad de suero fisiológico.

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C. VOLUMEN DE LA MUESTRA. Es suficiente un volumen de heces similar a una cucharada de café (2-4 g). Un estudio parasitológico completo debe constar de tres muestras recogidas en días sucesivos, ya que la expulsión de parásitos puede ser intermitente. D. TRANSPORTE. Si las muestras tardaran mucho en ser examinadas, deberán ser mantenidas a temperatura ambiente o ligeramente frescas y nunca en estufa o nevera, a cuya temperatura se destruyen muchos parásitos. Pero si el retraso va a ser grande, para preservar huevos, larvas o quistes, se deben mezclar las heces con algunos de estos productos que evitan su destrucción: 1. Formol al 5-10%; se mezcla un volumen de la muestra con tres del formol así diluido. 2. Fijador PVA (alcohol de polivinilo); también se mezclan tres volúmenes de PVA por volumen de la muestra fecal. 3. Solución MIF (solución de mertiolatoyodo-formol), que preserva tanto trofozoitos como quistes, y es el método más recomendado. 4. Fijador PAF (fenol-alcohol-formol). En el caso de gusanos adultos a anillos de tenias, el envío debe hacerse previa separación de las heces en solución fisiológica. Dentro de las parasitosis destacamos, por sus características especiales la investigación de oxiuros y amebas.

F. INVESTIGACION DE AMEBAS INTESTINALES. La observación de las heces requerirá que éstas sean siempre muy recientes, por lo que el transporte debe ser inmediato. En caso de abscesos de posible etiología amebiana, se aspiraran con jeringa y aguja, siguiendo la mayor asepsia. Se recomiendan dos muestras, correspondiendo la última a la pared del absceso. Enviar inmediatamente al laboratorio. Para investigación serológica, enviar 5 ml de sangre en un tubo, sin anticoagulante. Si fuera necesario, sepárese el suero y conservarlo congelado a -20º.

E. INVESTIGACION DE OXIUROS, TEST DE GRAHAM. En la parasitación por Enterobius no se buscarán los huevos en las heces sino en los márgenes del año, que es donde la hembra va a depositarlos. Para ello se puede utilizar: 1. Un pedazo de celofán (22 x 22 mm), montado en la extremidad de una varilla de cristal y mantenido en posición por una goma elástica. Se frotan los márgenes del ano con el celofán, y en el laboratorio este se extiende sobre un portaobjetos, con ayuda de una gota de suero salino o sosa decimonormal, para examinarlo al microscopio. 2. Un trozo de cinta adhesiva de celulosa sobre la región anal al acostarse; se deja durante toda la noche y se quita por la mañana. El método más útil es la técnica de Graham, que consiste en el empleo de un depresor de lengua (madera, plástico, etc.), de 7-8 cm de longitud por 1,5 cm de anchura, en uno de cuyos extremos se coloca la cinta de papel adhesivo transparente con la cara engomada hacia fuera, a sea, contraria al depresor (fig 1 y 2). Por la mañana, antes de levantarse el explorado, se separan las nalgas y se hace presión hacia ambos márgenes (fig 3 y 4), para que en la cara engomada queden adheridos los huevos. La cinta adhesiva se coloca sobre un portaobjetos con la cara engomada hacia el cristal, y se envía al laboratorio en un sobre o envuelto en varias capas de papel.

19.4.2 NALES.

PARASITOS

EXTRAINTESTI

1. PARASITOS UROGENITALES. 1.1 TRICHOMONIASIS. Son muestras adecuadas para su estudio: orina, exudado uretral y exudado vaginal. Se recomienda no hacer lavados vaginales ni tener relaciones sexuales en las 48 horas previas a la recogida de la muestra. Exudado vaginal: Se introducirá un espéculo sin lubricante y con una torunda estéril se recogerá el exudado de la zona donde sea más abundante. Debe enviarse al laboratorio antes de 15 minutos.

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Exudado uretral: Introducir una torunda estéril unos 2 cm en la uretra, girarla y extraerla. La muestra se enviará al laboratorio antes de 15 minutos. La muestra se recogerá preferentemente antes de la primera micción de la mañana. Orina: Se recogerá la primera orina de la mañana. Se seguirá la misma técnica que para el urocultivo, pero en este caso se recogerán en el recipiente estéril los 10 primeros milímetros de orina, desechando el resto. La muestra debe enviarse al laboratono inmediatamente. No debe refrigerarse. 1.2 OXIUROSIS VAGINAL. Suele ser una complicación de la parasitación intestinal, por lo que deben investigarse los huevos en vulva y ano conjutamente. Investigación de oxiuros en vulva: Con un papel cello montado sobre una espátula de madera (ver test de Graham en las parasitosis intestiriales), se pegará varias veces sobre los labios menores y el introito vulvar. Adherir el papel cello en un portaobjetos de vidrio. Investigación de oxiuros en ano: Debe acompañar a la técnica anterior cuando se sospeche una oxiurosis vaginal. Los portaobjetos no requieren medidas especiales de conservación hasta su llegada al laboratorio. 2. PARASITOS VESICALES. 2.1 ESQUISTOSOMIASIS. Son muestras adecuadas: orina, biopsia de la mucosa vesical. Biopsia de la mucosa vesical: La realizará un especialista bajo cistoscopia. El material obtenido se enviará inmediatamente al laboratorio dentro de un recipiente estéril con una pequeña cantidad de suero salino. Orina: Enviar la orina de 24 horas sin conservantes. También puede servir una muestra de orina aislada si se recoge la porción final de la micción después de un esfuerzo moderado (subir escaleras, etc), o tras masaje prostático. La muestra deberá enviarse al laboratorio lo antes posible en un recipiente estéril. 2.2 FILARIASIS. (Wuchereria bancrofti). Recoger 10-20 ml. de orina en un recipiente estéril y enviarlo rápidamente al laboratorio para su procesamiento. 3. PARASITOS EN SANGRE Y TEJIDOS. 3.1 PALUDISMO. A. MATERIAL NECESARIO. - Portaobjetos limpios conservados alcohol en una mezcla de alcoliol-éter.

en

- Lancetas estériles desechables. - Gasas estériles. - Alcohol al 70%. - Tubo para suero de 5 anticoagulante.

ml.

sin

B. OBTENCION DEL PRODUCTO. Se obtendrá una muestra de sangre por punción digital o por punción venosa. Punción digital: Desinfectar la superficie del dedo con una gasa humedecida en alcohol. Pinchar con una lanceta estéril. La primera gota de sangre se limpiará con un algodón y las gotas subsiguientes se recogerán sobre varios portaobjetos para hacer las extensiones. Punción venosa: Extraer 5 ml. de sangre en un tubo estéril sin anticoagulante. De esta manera se pondrán algunas gotas en portaobjetos para realizar las extensiones. El resto se guardará para serología. Extensiones finas: La técnica es similar a la utilizada en hematología. Se colocará una gota de sangre en un porta, y con la ayuda del borde de otro portaobjetos se extenderá hasta formar una película fina en la que puedan verse microscópicamente hematíes aislados. La extensión debe tener un mínimo de 2 cm. Gota gruesa: Poner una gota grande de sangre en el centro de un portaobjetos limpio. Con la esquina de otro portaobjetos se irá extendiendo la sangre con un movimiento de rotación, hasta obtener un tamaño aproximado de una moneda. Dejar secar y enviar al laboratorio. C. VOLUMEN DE LA MUESTRA. En el período febril enviar tres extensiones finas y una gota gruesa. En el período sin fiebre enviar una extensión de gota gruesa y 5 ml de sangre en un tubo sin anticoagulante para serología parasitaria (sólo valido para estudios de prevalencia o para diagnóstico de paludismo antiguo o crónico). Momento de la extracción: En el período febril cualquier momento es bueno. Deben empezar a obtenerse las muestras tan pronto como se sospeche esta enfermedad para no demorar el diagnóstico. 3.2 FILARIASIS EN SANGRE. Investigación de microfilarias de Wuchreria bancrofti Burgia nialayi, Dipetaloneina pertans y Mansonella ozzardi., Son muestras adecuadas para su estudio: Punción digital: Deberá realizarse en el laboratorio, ya que requiere su estudio inmediato. Se recogerán 2-3 gotas sobre un

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portaobjetos para su examen en fresco. Las primeras gotas son las mas ricas en el caso de las microfilarias linfáticas. Punción venosa: Recoger 5 ml. de sangre en un tubo sin anticoagulante, y otros 5 ml. en un tubo con anticoagulante (preferentemente EDTA o citrato). Las muestras deben enviarse inmediatamente al laboratorio. En caso de demora, la muestra con anticoagulante puede conservarse en nevera. Serología: Obtener por punción venosa 5 ml. de sangre sin anticoagulante y separar el suero. Algunas microfiliarias tienen una periodicidad nocturna, por lo que se recomienda realizar dos extracciones, una a medio día y otra a media noche. 3.3 FILARIAS EN TEJIDOS. Son muestras adecuadas para su investigación el tejido subepidérmico, biopsia dermoepidérmica y las biopsias ganglionares. Biopsia sub-epidérmica: La muestra ideal es una biopsia sin sangre de la zona que queda inmediatamente por debajo de la epidermis hasta las papilas dérmicas. La forma de obtener la muestra es haciendo 45 escarificaciones poco profundas con una hoja de afeitar o de bisturí. Debe enviarse al laboratorio inmediatamente en una pequeña cantidad de suero salino (0,2 ml). Otra forma sencilla de recoger la muestra es la siguiente: con una aguja fina se introducirá muy superficialmente y se levantará un poco la piel. Con ayuda de una hoja de afeitar o de bisturí se cortará justo por debajo de la aguja, obteniéndose pequeños fragmentos de piel, que deben enviarse inmediatamente en suero salino. Las zonas preferibles son: región glútea, escápula y pantorrilla. Biopsia dermo-epidérmica: Con un bisturí, cortar un pliegue cutáneo o un cono de piel. Enviar la muestra rápidamente al laboratorio en un tubo con una pequeña cantidad de suero salino. Biopsia ganglionar: Obtención quirúrgica siguiendo una técnica aséptica. La muestra debe enviarse lo antes posible al laboratorio en un recipiente estéril. Inmunología parasitaria: 1. Intradermorreacción con antígeno de Dirofilaria immitis sólo disponible en laboratorios especializados. 2. Serología parasitaria: obtener 5 ml. de sangre por venopunción y esperar el suero. 3. Test de Mazzoti: regudización de la sintomatologia tras la administración de 1/81/4 de comprimidos de Dieticarbamacina.

3.4. TRIPANOSOMIASIS. El diagnóstico se basa en la demostración de los parásitos en muestras de sangre, médula LCR, ganglio, miocardio y otros tejidos afectados. Sangre periférica:Obtener sangre sin anticoagulantes por punción digital o venosa preparando las siguientes extensiones: 1.1 extensión para visión directa: poner una gota sobre portaobjetos y tapar con un cubre. Envío inmediato al laboratorio para su observación. 2.2 extensiones finas (igual técnica que para el paludismo). 3.1 extensiones finas (igual técnica que para el paludismo). 4. Obtener 5 ml. de sangre en un tubo sin anticoagulante para técnica de concentración centrifugado. 5. Obtener 5 ml. de sangre con anticoagulante para leuco-concentración (técnica de Hothi-Sang). Nota: las muestras de sangre son útiles en la fase agua tanto en las trypanosomiasis americana como africana. 6. Cuando no se disponga de medios de cultivo adecuados (NNN, Steiner, ect), enviar 5 ml. de sangre para cultivo. Biopsia o aspirado ganglionar: Obtención de la muestra por punción aspiración de la piel previamente desinfectada, o por biopsia ganglionar. La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio en un recipiente estéril. Las muestras más adecuadas son los ganglios cervicales que se encuentran hipertrofiados o excesivamente reducidos. Médula ósea: Obtener un aspiratorio y enviarlo inmediatamente al laboratorio en la misma jeringa o en un tubo estéril (útil en la fase aguda). LCR: Recoger asépticamente la máxima cantidad posible de líquido y enviarlo rápidamente al laboratorio. Esta muestra es útil en fases tardías de la Tripanosomiasis africana (T. gambiense y rhodesiense). Chancro de inoculación: Util en fases tempranas de T. cruzi. La muestra se obtendrá por escarificación del chancro (muestra subepidérmica igual que para microfilarias). Envio inmediato al laboratorio en un tubo con una pequeña cantidad (0,2 ml.) de suero fisiológico. Serología: Puede realizarse en muestras de suero y LCR (sólo se dispone de estas técnicas en un laboratorio especializado en Medicina Tropical). 3.5 LEISHMANIASIS.

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Leishmaniasis cutánea: Introducir suero salino estéril con jeringa y aguja por debajo del lecho de la úlcera inyectando y absorbiendo varias veces para desbridar el tejido. Recoger el material obtenido en la jeringa y enviarlo al laboratorio lo antes posible. Cuando se disponga de brocas dentales estériles es preferible utilizar la técnica de Griffitt y Dutz, introduciendo la broca por debajo de la lesión y emulsionando el material obtenido al retirarla en una pequeña cantidad de suero salino. Leishamaniasis mucocutánea: Realizar biopsia de piel asépticamente y enviarla inmediatamente al laboratorio para su procesamiento (examen microscópico y cultivo). Leishmaniasis visceral (Kala-azar): Son muestras adecuadas para examen microscopio y/o cultivo: -Biopsia esplénica: la más rentable y pelilgrosa. -Biopsia de la médula ósea. -Biopsia hepática. -Biopsia ganglionar. Estas muestras se enviarán inmediatamente al laboratorio en un recipiente estéril. Diagnóstico serológico de las leishmaniasis: Enviar 5-10 ml. de sangre en un tubo estéril sin anticoagulante. La muestra deberá enviarse rápidamente al laboratorio. Cuando no sea posible, se separá el suero en un tubo y se congelará a -20ºC(congelador de nevera) hasta su procesamiento. La serología es útil en la leishmaniasis mucocutánea y visceral. Intradermorreacciones (prueba de montenegro): Inyección intradérmica de 0,1 ml. de antígeno (promastigotes de Leishmania muertos por calor) y lectura de los resultados a las 48 horas. No es de utilidad en Kala-azar activo. 3.6 TOXOPLASMOSIS. 1. Serología parasitaria:Obtener por punción venosa 5 ml. de sangre y enviar al laboratorio rápidamente en un tubo sin anticoagulante. Cuando haya demora en el envío se debe separar el suero que se mantendrá congelado a -20ºC hasta su procesamiento. 2. Biopsia ganglionar: Examen anatomopatológico de la muestra. 3. Tejidos de autopsia: Limitar el estudio a cerebro, retina, músculo y miocardio. 3.7 TRIQUINOSIS.

1. Serología parasitaria: Enviar 5 ml. de sangre en un tubo sin anticoagulante. En caso de demora, separar el suero y congelarlo. 2. Biopsia muscular: Preferentemente de músculo deltoides. Enviar rápidamente para su estudio histológico. 4. PARASITOS PULMONARES 4.1 PNEUMOCYSTIS CARINIL Son muestras adecuadas: Biopsias pulmonares, aspirados transtorácicos, cepillados bronquiales, lavados brocoalveolares o lavados bronquiales. El esputo expectorado, excepto en el caso de pacientes con SIDA, no suele contener suficiente número de organismos para su detección, lo que hace muestra inadecuada que no se procesa en la mayoría de los laboratorios. En niños muy pequeños pueden recogerse las secreciones respiratorias mediante aspiración laringofaríngea por sonda nasal. Las secreciones, lavados, cepillados y/o biopsias, se enviarán inmediatamente en un recipiente esteríl. 4.2 QUISTE HIDATIDICO. 1. Serología parasitaria: Enviar 5 ml. de sangre en un tubo estéril sin anticoagulante. En caso de demora, separar el suero y conservando congelado a -20ºC. 2. Aspiración del quiste:Sólo debe hacerse in vitro, sobre quistes extraídos mediante cirugía. Recoger el barro hidatídico (arenilla). Debe enviarse rápidamente para su examen microscópico. 4.3 DUELTAS RESPIRATORIAS Y LARVAS DE NEMATODOS. Paragonimus westermani, larvas de Ascaris, Strongyloides stercolaris, Uncinarias 1. Serología parasisteria: 5 ml. de sangre del modo habitual. 2. Esputo: El primer esputo de la mañana obtenido por expectoración. 19.5 VIRUS. Las muestras recomendadas para el aislamiento de los distintos virus son: Adenovirus: hispo faríngeo, hisopo conjuntival, orina, muestras de necropsia. Herpes simple: líquido vesicular, hisopo faríngeo, LCR. Varicela-zoster: líquido vesicular, LCR. Citomegalovirus: orina, sangre, hisopo buscal, biopsias de necropsia. Enterovirus: Heces, LCR. .Polio.

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.Coxsackie A y B (algunos tipos). Rubeola: hisopo faríngeo y nasal, LCR orina. Influenza: hisopo faríngeo. V. respiratorio sincital: hisopo faríngeo. Sarampión: sangre, hisopo faríngeo, orina. Parainfluencia: hisopo faríngeo. Parotidis: hisopo bucal, LCR, orina. Sólo puede insertarse el aislamietno de virus en la fase aguda de la enfermedad. Pasada ésta se recomienda el diagnóstico serológico. A. MATERIAL NECESARIO Y OBTENCION DEL PRODUCTO. El material necesario y la forma de recogida de la muestra es similar a la de los productos destinados a cultivo bacteriano. B.TRANSPORTE. Los medios más idóneos son: -Medio de Eagle con 2% de suero fetal de ternera. -Medio comercial "Vir Tran". Con pocas excepciones (V. respiratorio sincitial,) las muestras deben mantenerse refrigeradas durante su transporte. Cuando sean pocas horas, sirve un "termo" o una bandeja con hielo. Para más horas, si es posible, se usará nieve carbónica, tras asegurarse de que la muestra está en un recipiente hermético, a ser posible doble. Dada la fragilidad de muchas especies víricas fuera de la célula, cuando no sea posible inocular el producto al lado del paciente deberán seguirse las siguientes instrucciones en su conservación y transporte: Muestras de faringe, nasales y tracto respiratorio, enviar la muestra en torunda con medio de transporte. Vesículas: recoger en capilares de cristal o si se puede con jeringa y aguja fina. Los capilares se ponen en contenedores cerrados y el contenido de las jeringas en un frasco con medio de transporte. Las torundas son menos útiles y si se usan deben enviarse con medio de transporte. Costras de varicela: coger la costra con pinzas y transportar en seco en frascos con cierre hermético. LCR: enviar en un recipiente estéril con tapa de rosca. Heces: enviar en medio de transporte o en una mezcle de glicerol y solución salina a partes iguales. Torundas rectales: enviar en medio de transporte o en glicerol-salino. Sangre: obtenida por venopunción o punción digital, puede enviarse completa o mandarse el suero una vez separado.

Biopsias y muestras de autopsia: transportar en recipientes con medio de transporte Nunca en formol.

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Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: Juan J. Picazo Antonio Fuertes Ortiz de Urbia Pilar León Rega Antonio Orduña Domingo Mª Teresa Jiménez de Anta

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INDICE Introducción Marcadores serológicos para el diagnóstico Hepatitis A Hepatitis B Hepatitis D Hepatitis C Hepatitis E Diagnóstico de Ia Infección 1.Hepatitis aguda Criterios de interpretación en pacientes ADVP Marcadores adicionales en la hepatitis aguda NANBNC 2.Hepatitis crónica 3.Marcadores serológicos de replicación en el seguimiento de tratamientos 4.Interpretación de patrones atipicos para marcadores de infección por

HBV

Reactividad aislada para anti-HBc Reactividad para HBsAg en ausencia de anti-HBc total Reactividad aislada para anti-HBs en individuos no vacunados Coexistencia de HBsAg y anti-UBs

Situaciones particulares 1.Embarazo/Neonato 2.Convivientes con pacientes con hepatitis 3.Donantes de sangre y/o órganos 4.Personas con riesgo de infección por virus de las hepatitis Personas con riesgo ocupacional Pacientes con riesgo de hepatitis víricas Personas pertenecientes a grupos con prácticas de riesgo 5.Control de vacunación de haptitis B Esquemas de diagnóstico e interpretación de los marcadores más frecuentes 1.Marcadores en presencia de clínica de hepatitis aguda 2.Cualificación de hepatitis B aguda 3.Hepatitis B de evolución crónica 4.Hepatitis aguda actual o recienternente pasada con anti- HCV (+)

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2. SEROLOGÍA DE LAS HEPATITIS VÍRICAS 1993 INTRODUCCION El conocimiento de las distintas formas de hepatitis viral ha mejorado de forma espectacular en los últimos años. En la actualidad conocemos al menos cinco virus responsables de este cuadro clínico, que presentan una epidemiología y unas posibilidades evolutivas diferentes. El número de personas infectadas en el mundo es dificil de establecer, pero sabemos que se trata de cientos de millones. Algunos de los casos evolucionaran a formas crónicas y eventualmente a cirrosis o carcinoma hepatocelular. La existencia para el caso de la hepatitis A y de la hepatitis B (y por lo tanto para la hepatitis D) de vacunas eficaces e inocuas nos hace pensar que la incidencia de estas infecciones debiera cambiar en el futuro. Por otra parte, se han abierto para casos muy concretos algunas posibilidades terapéuticas que habrá que evaluar. Por todo ello, resulta del mayor interés el establecimiento de un diagnóstico exacto del tipo de infección viral, que precise incluso el estadío de la enfermedad y que permita tomar la decisión terapéutica en el individuo y preventiva en la comunidad, realizando el diagnóstico apropiado. Los avances en este campo, con el conocimiento de los marcadores virales (productos del virus o anticuerpos específicos frente a las partículas víricas) ha permitido el diagnóstico preciso de unas enfermedades por otra parte indistinguibles clínicamente.

MARCADORES SEROLOGICOS PARA EL DIAGNOSTICO HEPATITIS A El virus produce casi siempre enfermedad aguda, sin cronificarse, y menos del 1% desarrolla forma fulminante. El virus se encuentra en las heces durante el período de incubación, manteniéndose hasta dos semanas después del inicio de la clínica. Su detección con fines diagnósticos no se emplea rutinariamente. ANTI-HAV IgM Siempre es positivo en el inicio de la sintomatología clínica, manteniéndose positivo hasta los 3-6 meses de ese comienzo, por lo que se utiliza como

marcador de infecci6n aguda por el virus. El antígeno viral es detectado solamente en el hígado y tampoco se utiliza con fines diagnósticos. ANTI-HAV IgG Su presencia demuestra contacto previo con el virus. Se mantiene positivo durante muy largos períodos de tiempo. HEPATITIS B La evolución clínica de la hepatitis B puede ser muy variable, desde una infección asintomática, anictérica, que ocurre en la mayoría de los casos, hasta una enfermedad aguda, que en algunas ocasiones Se complica evolucionando hacia la cronicidad, la cirrosis o a la forma fulminante fatal. Además, se ha comprobado a través de evidencias epidemiológicas una estrecha relación de esta enfermedad viral con el carcinoma hepatocelular. La presencia en suero de ciertas proteínas virales y de los anticuerpos a que dan lugar, se modifican a lo largo del tiempo en estrecha relación con la evolución biológica de la enfermedad; por ello su determinación cualitativa y cuantitativa puede servirnos para evaluar la situación actual y el pronóstico futuro de la infección viral. La apropiada interpretación de los marcadores serológicos permitirá en primer lugar diagnosticar la infección en el enfermo, en segundo lugar realizar un pronóstico fiable con y sin tratamiento y en tercer lugar conocer la susceptibilidad en el individuo sano. ANTIGENO DE SUPERFICIE: HBsA El HbsAg, se sintetiza en el citoplasma del hepatocito, independientemente de la capside. Debido a que la célula hepática fabrica un exceso de estas estructuras, una parte es liberada a la sangre pudiendo ser detectada. Este antígeno se produce y se encuentra en el citoplasma del hepatocito y en la sangre durante el periodo de incubación, la fase aguda de la enfermedad y en el estadío crónico. Si la evolución es favorable, desaparecerá a los 3 ó 6 meses de la enfermedad. Por el contrario, el mantenimiento de títulos elevados durante más de 6-8 semanas, o si no existe una disminución significativa de su título en el primer mes de la enfermedad es indicio de

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mal pronóstico y de evolución a la cronicidad. La positividad de este marcador más allá del sexto mes de la infección, define la situación clínica de hepatitis crónica. ANTICUERPO anti-HBs Es el indicador de recuperación de la enfermedad, último marcador en aparecer, haciéndolo generalmente a los tres meses de evolución de la enfermedad. Persiste durante mucho tiempo, neutralizando al virus y confiriendo protección. En los individuos vacunados es el único marcador presente. ANTICUERPO anti-HBc Se trata del primer anticuerpo que aparece en la enfermedad, siendo ya detectable con los primeros síntomas de la enfermedad en la fase aguda y en la crónica. El hallazgo aislado puede significar igualmente infección pasada o curada dada la larga persistencia de estos anticuerpos en el suero. Su positividad confirmada y en solitario no asegura la protección frente a la enfermedad. La positividad de anticuerpos de la clase lgM frente a este marcador (Anti-HBc IgM), se interpretó corno indicador de infección aguda reciente. Hoy se sabe que no sólo existe lgM especifica frente al "core" en las fases agudas sino que también es detectable en los casos de enfermedad crónica con replicación viral y lesión hepática, aunque la concentración de esta clase de anticuerpos es menor que la encontrada en las fases agudas. En estos casos las tasas encontradas fluctúan en relación con el grado de lesión hepática. Algunos reactivos comerciales tienen recortada la sensibilidad del test para que únicamente presente reacciones positivas en casos de forma aguda. La persistencia de anti-HBc IgM es variable pudiéndose alargar hasta 12 - 18 meses, con títulos decrecientes, en los casos de enfermedad aguda autolimitada. ANTIGENO e: HBeAg Este antígeno es detectable en la mayoría de los enfermos que se encuentran en la fase aguda y en algunas formas de enfermedad crónica en las que histológicamente se corresponde con hepatitis crónica activa. Su mayor valor clínico se funda en su excelente correlación con la presencia de replicación viral y viremia. La sangre de los enfermos HBeAg (+) debe pues considerarse como

infecciosa. Su estudio es obligatorio en todos los sueros HBsAg (+). La mayoría de los pacientes con este antígeno tienen entre 105 y 108 Equivalentes de genoma por mililitro de suero (g.E/mL). Su desaparición en el curso de una hepatitis aguda o crónica suele indicar buena evolución y posiblemente una seroconversión a antiHBe con curación o paso a un estado menos agresivo de la enfermedad. Existen casos en los que esta seroconversión, si persiste la replicación viral, supone un peor pronóstico de la enfermedad (variantes preCore menos). En algunas ocasiones, este marcador debe ser manejado junto con antiHBe y DNA-HBV para poder valorar la respuesta inmune frente a las proteínas del virus y la viremia ya que por sí sólo no permite predecir con certeza la presencia o no de replicación viral. ANTICUERPO anti-HBe La aparición de anticuerpos anti-HBe en el curso de una infección aguda indica generalmente buena evolución y una baja infectividad del paciente. En la mayoría de los casos es detectable poco antes de que desaparezca HbsAg, pudiendo encontrarlo positivo durante varios años después de la infección. En los casos de hepatitis crónica en los que coexiste con HBsAg suele indicar escasa actividad replicativa de la enfermedad viral, coincidiendo casi siempre con diagnósticos histológicos de hígado "normal"' (portador asintomático) o hepatitis crónica persistente. En otros casos de evolución crónica, como se comentó anteriormente, la seroconversión a anti-HBe no supone una mejoría ni clínica ni histológica ya que persiste la replicación viral (DNA UBV positivo) y la enfermedad no se detiene. Generalmente este tipo de evolución coincide con cuadros histológicos de hepatitis crónica activa y/o cirrosis. DNA VIRAL LIBRE: HBV-DNA La detección de DNA viral libre en el suero mediante hibridación no ha sido hasta ahora una técnica de rutina, a pesar de tratarse de un marcador muy sensible tanto de la presencia del virus como de su actividad replicativa. El HBV-DNA es positivo en un elevado número de pacientes HBeAg positivos. Su positividad se correlaciona también de una forma muy directa con el HBcAg hepático y presenta la ventaja de que su determinación no precisa biopsia. En la actualidad existen métodos comerciales muy sensibles, rápidos y sencillos que

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permiten detectar el DNA del HBV libre en el suero. Recientemente, la PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) está introduciéndose como técnica altenativa. HEPATITIS D (DELTA) ANTIGENO DELTA (HDAg) Aparece fugazmente en sangre en la primoinfección, por lo que en cualquier caso su utilidad clínica es muy limitada. En la forma crónica, la viremia es intermitente. ANTICUERPOS ANTI-DELTA IgM (AntiHD IgM) Después de la aparición del antígeno, surge el anticuerpo lgM que se mantiene positivo a bajos títulos durante un tiempo limitado en el caso de evolución favorable persistiendo su positividad a títulos altos en los casos que evolucionan a la cronicidad. ANTICUERPOS ANTI-DELTA IgG (Anti-HD IgG) Es de aparición más tardía, manteniéndose positivo durante largos períodos de tiempo por lo que su detección indica solamente contacto con el virus. RNA VIRAL (HD-RNA) La positividad por técnicas de hibridación o PCR indica presencia del virus. HEPATITIS C ANTICUERPOS ANTI-HCV Para su detección se emplean antígenos sintéticos o recombinantes, dado que el virus no ha podido ser visto ni cultivado hasta el momento. Su aparición puede retrasarse mucho (incluso hasta un año), aunque recientes sistemas diagnósticos que emplean varios antígenos virales permiten detecciones más precoces, por lo que la negatividad de esta prueba no descarta la infección. Su aparición indica contacto con el virus. Los resultados deberán ser confirmados ya que pueden ser debidos a reacciones inespecíficas. ANTI-HCV: PRUEBAS CONFIRMATORIAS Emplean diferentes antígenos adsorbidos sobre tiras de nitrocelulosa. Su interpretación es diferente dependiendo de la prueba y antígenos emplecados. La presencia de dos bandas se interpreta como resultado positivo, la ausencia de bandas como negativo y la presencia de una sola banda como resultado indeterminado.

RNA VIRAL (HCV-RNA) Dado que la viremia puede ser escasa, su detección se realiza mediante pruebas de amplificación genómica (PCR u otras). Su positividad indica presencia del virus. Su negatividad no descarta la infección dado que la viremia es intermitente. HEPATITIS E Se están actualmente comercializando pruebas que detectan antígeno y anticuerpos específicos.

DIAGNOSTICO DE LA INFECCION 1. HEPATITIS AGUDA Marcadores de rutina: HAV: anti-HAV IgM HBV: HBsAg y anti-HBc IgM HCV: anti-HCV HDV: anti-HDV IgM (en pacientes ADVP) Criterios generales de interpretación: - La presencia de anti-HAV IgM asociada a hepatitis aguda es diagnóstica de infección aguda por HAV. - La presencia de HBsAg y anti-HBc IgM asociada a hepatitis aguda es diagnóstica de infección aguda por HBV. Dado que antiHBc IgM puede estar presente a bajo nivel en pacientes crónicamente infectados por el HBV, el criterio puede conducir a error cuando se trata de pacientes en alto riesgo de infección por agentes de transmisión parenteral. En este caso, el diagnóstico de la enfermedad aguda o crónica dependerá del tiempo de evolución de la enfermedad. - La presencia simultánea de anti-HDV IgM y anti-HBc IgM asociada a hepatitis aguda se considera diagnóstica de coinfección aguda por HBV y HDV. La presencia de anti-HDV IgM y HBsAg en ausencia de antiHBc IgM debe tomarse como indicativa de sobreinfección por HDV en un portador crónico de HBV. Con muy baja frecuencia, puede ocurrir que dicha sobreinfección haga disminuir transitoriamente la concentración de HBsAg en suero a niveles no detectables, originando un patrón de reactividad aislada para anti-HDV IgM. En estos casos, se recomienda determinar HDAg en suero y anti-HBc total, así como realizar seguimiento para HBsAg y anti-HDV total. En cualquier caso, y dada la situación epidemiológica actual en nuestro país, no

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parece recomendable la búsqueda rutinaria de la infección delta, salvo en pacientes ADVP. - Sólo la seroconversión para anti-HCV puede tomarse como criterio fiable para establecer un diagnóstico de infección aguda o reciente por HCV. Utilizando la tecnología disponible en la actualidad, dicha seroconversión suele retrasarse mas de tres meses respecto al comienzo de los sintomas, por lo que el diagnóstico requiere el estudio de muestras de seguimiento, al menos hasta el sexto mes. No se ha demostrado que la detección de anti-HCV IgM sea de utilidad en el diagnóstico de la hepatitis C aguda. El estudio de la respuesta de anticuerpos frente a distintos antígenos derivados del genoma viral no ha permitido identificar patrones de reactividad asociados exclusivamente a infección aguda o a replicación viral. Criterios de interpretación en pacientes ADVP Las tasas de seropositividad para HBV (antiHBc total) y HCV (anti-HCV) en individuos ADVP no seleccionados superan, en nuestro país, el 80%. Entre los individuos ADVP crónicamente infectados por HBV (positivos para UBsAg), la seropositividad para HDV (anti-HDV total) se aproxima, asimismo, a dicho porcentaje. Así, es frecuente que estos pacientes se hallen crónicamente infectados por uno o más de dichos agentes en el momento de sufrir un episodio de hepatitis aguda, resultando imposible en la práctica precisar su etiología. En la mayoría de los casos, sólo un conocimiento preciso del estado inmunitario del paciente para estos agentes previo a la presentación del episodio de hepatitis aguda puede permitir una interpretación de la serología ajustada a la realidad, de acuerdo a los criterios generales de interpretación antes expuestos. Marcadores adicionales en la hepatitis aguda NANBNC Una vez descartados los agentes anteriormente expuestos, se recomienda investigar la posibilidad de que el episodio de hepatitis aguda responda a infección primaria por Citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV) ó Coxiella burnetti, determinando los siguientes marcadores en suero: anti-CMV IgM (diagnóstico de primoinfección por CMV); IgM frente al antígeno de la capside del EBV (anti-VCA IgM, diagnóstico de primoinfección por

EBV); IgM frente al antígeno fase II de Coxiella burnetti ó titulación de anticuerpos frente a dicho antígeno por fijación del complemento (títulos 1:128 indican infección aguda). En el caso de la hepatitis E, queda pendiente conocer la situación epidemiológica en nuestro país, aunque datos preliminares indican una incidencia muy escasa, por lo que en estos momentos su búsqueda quedaría limitada a viajeros procedentes de zonas endémicas. 2. HEPATITIS CRONICA Marcadores de rutina: HBV: HBsAg y anti-HBc total. HDV: atiti-HDV total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg). HCV: anti-HCV. Criterios de interpretación: - La presencia de NBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crónica es diagnóstica de hepatitis B crónica. La presencia adicional de anti-HDV total indica infección crónica doble por HBV y HDV. - La presencia de anti-HCV asociada a hepatitis crónica es altamente indicativa de hepatitis C crónica, aunque no permite establecer, en términos estrictos, un diagnóstico seguro. La detección de RNA viral en suero mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ayuda a establecer el diagnóstico, pero un resultado negativo aislado no lo descarta, ya que la viremia es intermitente en muchos casos. Dado el alto costo de los métodos de confirmación de anti-HCV y vistos los altos porcentajes de confirmación que se obtienen en los pacientes con hepatitis crónica que resultan reactivos para anti-HCV en las pruebas de cribado, se considera que una recomprobación del resultado positivo mediante un segundo método de cribado que utilice antígenos obtenidos por una tecnología diferente, es suficiente para establecer la presencia de anti-HCV en pacientes con hepatitis crónica. 3. MARCADORES SEROLOGICOS DE REPLICACION EN EL SEGUIMIENTO DE TRATAMIENTOS Muestra basal: HBV: HBeAg, anti-HBe, nivel de DNA viral. HDV: RNA viral y anti-HDV IgM HCV: RNA viral. Seguimiento:

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HBV: Aclaramiento de HBeAg y HBsAg, seroconversión para anti-HBe y anti-HBs, niveles de ADN viral (en función de los resultados iniciales). HDV: Aclaramiento de RNA viral. HCV: Aclaramiento de RNA viral al menos en tres muestras seriadas. No se considera que la caracterización inicial y el seguimiento de los patrones de reactividad para anticuerpos frente a distintos antígenos derivados del genoma del HCV sea de utilidad para el seguimiento serológico de los pacientes con hepatitis C crónica, por lo que no se recomienda realizar estas determinaciones. 4. INTERPRETACION DE PATRONES ATIPICOS PARA MARCADORES DE INFECCION POR HBV - Reactividad aislada para anti-HBc (ausencia de HBsAg y anti-HBs). Patrón frecuente al estudiar individuos con prácticas de riesgo (10-25%). Responde a reacciones inespecíficas ligadas a componentes séricos no identificados sensibles a agentes reductores ó, más frecuentemente, a respuesta inmune incompleta frente a una infección previa por HBV. Sólo muy rara vez se asocia a infección crónica con muy baja ó nula expresión de HBsAg. La confirmación de especificidad se basa tan sólo en la búsqueda de anti-HBc mediante una técnica de formato distinto (p.c., EIA indirecto para confirmar resultados obtenidos por EIA competitivo). La detección de anti-HBe respalda también la especificidad del resultado. Aún así, la positividad aislada de anti-HBc no garantiza inmunidad a la reinfección, por lo que no se debe tomar como criterio de exclusión para la vacunación. -Reactividad para HBsAg en ausencia de anti-HBc total. Patrón discretamente frecuente si se utilizan métodos de detección de HBsAg de sensibilidad inferior a 0.3 ng/ml (0.03 UPE/ml) (1-6%), independientemente de la población que se estudie. La confirmación de especificidad se basa en la realización de ensayos controlados de neutralización con anti-HBs de título alto. Puede responder a los siguientes motivos: a. Reacción inespecífica, mediada por anticuerpos contra inmunoglobulinas de ratón, cuando se utilizan métodos de EIA con doble anticuerpo monoclonal (muy

infrecuente). La reactividad no es neutralizable por anti-HBs. b. Momentos muy tempranos de la infección aguda por HBV. La reactividad es neutralizable por anti-HBs, se acompaña de HBcAg y anti-HBc IgM y se sigue de seroconversión para anti-HBc total. c. Inmunotolerancia extrema a la infección por cepas normales del HBV, que determina la ausencia de respuesta inmune humoral. La reactividad es fuerte, neutralizable por anti-HBs (puede requerir dilución) y se acompaña de presencia de HBeAg y DNA viral en suero. Ocurre con cierta frecuencia en individuos infectados "intra útero" y en pacientes con inmunodepresión extrema. d. Infección crónica por cepas del HBV defectivas en la expresión del transactivador de transcripción (proteína X, HBeAg). La reactividad es débil (puede no detectarse en ocasiones), persiste en el tiempo y sólo se acompaña de anticuerpos contra la polimerasa viral y niveles de DNA viral en suero detectables únicamente mediante PCR. Hasta la fecha, sólo se han descrito algunos casos asociados a un brote de hipertransaminasemia en un grupo de pacientes hemodializados. e. Infección por una hipotética variante del HBV, conocida como HBV tipo 2 (HBV2), que no presentaria protección cruzada con las cepas salvajes del HBV. La reactividad es débil (sólo detectable, en general, por métodos de sensibilidad inferior a 0.4 ng/ml), neutralizable por anti-HBs y de carácter transitorio, desapareciendo habitualmente a las 2-3 semanas de seguimiento, sin originar seroconversión para anticuerpos anti-HBc ó anti-HBs. El HBeAg es negativo y, en ocasiones, el DNA viral circulante se detecta mediante hibridación molecular DNA viral circulante a concentración inferior a 20 pg/ml (20-30% de los casos), aunque dicho DNA se puede detectar mediante PCR en la mayoria de los casos. Se han descrito varios cientos de casos, procedentes de Senegal, EEUU, Taiwan, Francia, España, Belgica y Nueva Zelanda. La mayoría de los pacientes eran asintomáticos, aunque algunos presentaron elevaciones discretas en los niveles de transaminasas. El fenómeno puede presentarse en forma de brotes epidémicos discretos y localizados. - Reactividad aislada para anti-HBs en individuos no vacunados. Patrón poco frecuente (0.1-0.5%), que no se asocia a ninguna población definida. La especificidad se confirma, en principio, mediante

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neutratización controlada por HBsAg. Responde en muchos casos a reacciones inespecíficas, mediadas por una IgM capaz de unirse al HBsAg. Alternativamente, podría responder a inmunización por HBV inactivo, a infección antigua con pérdida de anti-HBc ó a respuesta inmune incompleta frente a la infección. Se ha documentado la existencia de infecciones agudas por HBV en individuos que presentaban este patrón serológico, por lo que no debe tomarse como base para predecir la inmunidad a la reinfección. - Coexistencia de HBsAg y anti-fiBs. Patrón relativamente frecuente en pacientes con hepatitis crónica y en individuos asintomáticos de alto riesgo, en especial ADVPs. La especificidad se confirma mediante los correspondientes ensayos de neutralización para ambos marcadores. En pacientes con hepatitis crónica, las reactividades son fuertes y persistentes, pueden responden a infecciones sucesivas por cepas de HBV de distinto subtipo, mediadas por tolerancia inmunológica ó por infección por variantes defectivas en la expresión del determinante común "a" del HBsAg y en algunos casos de pacientes en tratamiento con Interferón, en los que se detecta seroconversión para anti-HBs sin que se haya producido el aclaramiento del HDsAg. En pacientes asintomaticos y sin lesiones hepaticas, la reactividad para HBsAg suele ser débil y transitoria, habiendose tomado como posibles infecciones por HBV2 en pacientes previamente positivos para anti-HBs (inmunes a HBV). La administración de gamma-globulina específica en pacientes HBsAg positivos puede igualmente originar transitoriamente este patrón.

SITUACIONES PARTICULARES 1. EMBARAZO/NEONATO 1.1. Hepatitis B La transmisión vertical del VHB de madre portadora de HBsAg a su hijo recién nacido tiene lugar en más del 80% de los casos cuando la madre es HBeAg positiva y en el 20% cuando la madre es anti-HBe positiva. De éstos, más del 85% se volverán portadores crónicos de VHB. El niño se puede infectar en el útero, o más frecuentemente en el momento del parto o en el periodo neonatal. Control materno

Existe un protocolo general de control de las infecciones en la embarazada que entre otras trata del control de la hepatitis B. Por tanto se recomienda el seguimiento de dicho protocolo, que se basa en la determinación de HBsAg. Esta determinación se ha de llevar a cabo sistemáticamente como una prueba más durante uno de los controles que se realicen en el tercer trimestre de embarazo. Si la mujer no ha sido controlada durante el embarazo, la determinación de HBsAg ha de ser realizada tan pronto como sea posible antes o después del parto con el fin de proceder a la profilaxis del recién nacido en el caso de que la madre resultara ser portadora del VHB. En cualquiera de los casos un HBsAg positivo indica infección actual por el VHB debiendose seguir el protocolo general de diagnóstico de las hepatitis B. Control de hijo de madre portadora Si al niño se le ha realizado la profilaxis antiVHB (vacuna y gammaglobulina anti-VHB) en las primeras 24 horas después del nacimiento, la protección conseguida es suficiente en la práctica totalidad de los casos. En los hijos recién nacidos de madres portadoras, el retraso en la realización de la profilaxis anti-VHB aumenta la probabilidad de infección por VHB. Cuando se considere que la profilaxis anti-VHB ha sido insatisfactoria, debe ser realizado un control serológico tres meses después del nacimiento determinando los niveles de antiHBs. Si el niño fuera anti-HBs negativo debe realizarse la determinación de HBsAg. 1.2. Hepatitis C No está claro si la hepatitis C tiene un mecanismo de transmisión vertical ya que los datos existentes en la literatura son contradictorios. En cualquiera de los casos esta vía de transmisión parece ser poco eficiente. Dada la no existencia de medidas profilacticas eficaces y la baja prevalencia de HCV en la población general y por tanto en las mujeres embarazadas, no se considera necesario la investigación sistemática de anti-HCV en la embarazada. Sin embargo, sí parece conveniente realizar un seguimiento serológico de los niños nacidos de madre diagnosticada de hepatitis C. Teniendo en cuenta la transferencia transplacentaria de IgG anti-HCV, y la persistencia de los anticuerpos maternos durante al menos 6 meses después del nacimiento, el diagnóstico de hepatitis C en

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el niño durante este período se puede hacer demostrando la presencia del RNA vírico. 2. CONVIVIENTES DE PACIENTES CON HEPATITIS 2.1. Hepatitis A En el momento actual no parece necesario un control especial de los mayores de 30 años que convivan con pacientes diagnosticados de hepatitis A ya que los estudios seroepidemiológicos muestran una prevalencia de anticuerpos anti-HAV superior al 90%. Unicamente en los convivientes que presentaran manifestaciones clínicas sugerentes de hepatitis, se sospecharía una hepatitis A, siguiéndose en ellos el protocolo general de diagnóstico de las hepatitis víricas. 2.2. Hepatitis B Los convivientes de individuos infectados por HBV, constituyen un grupo de alto riesgo a la infección por este agente debido a la eficacia de la transmisión intrafamiliar del HBV. Por ello, es conveniente investigar la existencia de portadores de HBsAg y en función de los resultados continuar con el protocolo general de diagnóstico de la hepatitis B. 2.3. Hepatitis C Los estudios realizados hasta el momento parecen indicar que la difusión intrafamiliar del HCV es poco relevante, por lo que no se consideran necesarios los estudios sistemáticos entre los convivientes. 3. DONANTES DE SANGRE Y/O ORGANOS En estos casos se recomienda seguir los protocolos generales para donantes de sangre u órganos en los aspectos referidos a las hepatitis víricas. 3.1. Donantes de sangre Las pruebas a realizar serán HBsAg y anticuerpos anti-HCV. La positividad en alguna de estas pruebas obligará a la aplicación del protocolo general de las hepatitis víricas. 3.2. Donantes de órganos Se determinará sistemáticamente, y como mínimo, la presencia de HBsAg y anticuerpos anti-HCV. En el caso de que se decida el transplante de un órgano procedente de un paciente HBsAg positivo a un receptor HBsAg positivo es necesario determinar previamente en el donante la presencia de anticuerpos anti-HDV totales.

4. PERSONAS CON RIESGO DE INFECCIÓN POR VIRUS DE LAS HEPATITIS. Además de las personas pertenecientes a grupos sociales con elevada prevalencia de hepatitis víricas o procedentes de zonas con alta endemicidad (turistas, emigrantes, viajeros, etc.), en las que se realizarían las pruebas correspondientes a la hepatitis vírica prevalente, determinadas profesiones, enfermedades y hábitos o prácticas constituyen un riesgo de infección por alguno o varios de los virus de las hepatitis superior al de la población general. 4.1. Personas con riesgo ocupacional 4.1.1. Personal sanitano, cuidadores de centros para disminuidos psiquicos y personal de centros penitenciarios. Hepatitis B: Se aconseja un control periódico anual determinando HBsAg en aquellas personas que no hayan sido vacunados frente al VHB o en las que la respuesta a la vacunación haya sido insuficiente. En las personas vacunadas pertenecientes a este grupo se recomienda seguir el protocolo de control post-vacunal (ver mas adelante). Cuando ha existido un accidente de riesgo de hepatitis B en una persona no vacunada es necesario llevar a cabo un control serológico de hepatitis B (HBsAg), procedióndose a la realización de la profilaxis específica anti-VHB sin esperar el resultado de las pruebas serológicas. Si la persona que sufrió el accidente de riesgo resultara ser HBsAg positiva se incluiría dentro del protocolo general de diagnóstico de las hepatitis B. Si por el contrario resultara ser HBsAg negativa se realizará el control serológico post-vacunal conforme al protocolo de control de la vacunación. Si el accidente de riesgo de hepatitis B ha tenido lugar en una persona vacunada se recomienda un control cuantitativo anti-HBs si este estudio no se hubiera realizado en el último año, o si el nivel de anti-HBs detectado en el último control hubiera sido inferior a 100 mUI/mL. Hepatitis C: El riesgo de transmisión de la hepatitis C por accidente de riesgo es bajo encontrandose el porcentaje de seroconversiones entre un 2 y un 5%. Por ello es conveniente determinar la presencia de anti-HCV en los controles que se realicen inmediatamente después del accidente y al mes y a los tres meses si el primer control resultó ser negativo.

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4.1.2. Cuidadores de centros infantiles. Constituyen un grupo de riesgo para la hepatitis A, en particular aquellas personas recién incorporadas al centro que no la hayan sufrido previamente. 4.2. Pacientes de riesgo de hepatitis víricas - Pacientes sometidos a diálisis o receptores habituales de sangre o hemoderivados. Se aconseja el estudio sistemático y periódico (trimestral) de HBsAg en los pacientes no vacunados o malos respondedores, y de anti-HCV en los caracterizados previamente como seronegativos. - Pacientes con deficiencias psíquicas. Estos pacientes presentan una prevalencia elevada de hepatitis B por lo que se aconseja la investigación de HBsAg en los pacientes no vacunados. 4.3. Personas pertenecientes a grupos con prácticas de riesgo Incluyen este grupo ADVP, presos, homosexuales, grupos de alta promiscuidad, pacientes de E.T.S. etc. La elevada prevalencia de infección por HBV, HDV y HCV en particular entre pacientes ADVP y presos aconsejan la realización sistemática de HBsAg y antiHCV. Por otra parte, aunque la transmisión sexual del HCV es poco eficiente, conviene determinar anti-HCV en pacientes con alta promiscuidad ya que estos grupos presentan una prevalencia de anti-HCV muy superior a la de la población general. 5. CONTROL HEPATITIS B.

DE

VACUNACION

DE

Dado el alto porcentaje de éxito tras la inmunización que se obtiene con las vacunas actuales, se aconseja la realización de controles de vacunación solamente en individuos de alto riesgo, en los que la infección por alguno de estos agentes pudiera ocasionar un problema grave añadido a su situación particular, tal como hemodializados, receptores de hemoderivados, convivientes y personal sanitano. En el momento actual, se considera que un individuo esta protegido contra la infección por HBV si se le detectan niveles de antiHBS iguales o superiores a 10 UI/L después de ser vacunado. En las situaciones particulares de especial riesgo antes señaladas, la realización de controles anuales de anti-HBs y/o la administración de nuevas dosis de vacuna si los niveles de anti-HBs son inferiores a 100 UI/L puede ser una medida a valorar en cada caso. En la población en general, convivientes de portadores y personas pertenecientes a grupos con prácticas de riesgo, no se recomienda la realización de controles pre ni post-vacunales. Individuos en riesgo: 1.- Recién nacidos de madres portadoras de HBsAg: Se recomienda hacer un control post-vacunal de anti-HBs cuantitativo tres meses después de finalizar el protocolo de vacunación. 2.- Pacientes de riesgo para hepatitis víricas (hemodia1izados, receptores habituales de hemoderivados, pacientes VIH (+), etc.) y personas con riesgo ocupacional: Se considera conveniente hacer un control post-vacunal realizando una determinación cuantitativa de anti-HBs un mes después de la última dosis de vacuna.

ESQUEMA DE DIAGNOSTICO E INTERPRETACION DE LOS MARCADORES MAS FRECUENTES TABLA 1 MARCADORES EN PRESENCIA DE CLINICA DE HEPATITIS AGUDA* HAV HBV HCV INTERPRETACION Anti-HAV IgM HBsAg Anti-HBc IgM Anti-HCV HEPATITIS AGUDA POR PERFIL + HAV DE + HCV (Tabla 4) DIAGNÓSTICO Posible HCV** ó NANBNC + + HBV (Tabla 2) * La combinación de positividades de estos marcadores hará el diagnóstico de infecciones mixtas. Dado que la seroconversión puede retrasarse es conveniente repetir este marcador pasados 30/45 ** días.

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TABLA 2 CUALIFICACION DE HEPATITIS B AGUDA (con anti-HBc IgM (+)) Menos de 6 meses de evolución HBsAg Anti-HBc HBeAg Anti-HBe Anti-HDV INTERPRETACION + + + Alta replicación viral PERFIL Baja replicación viral. + + + DE Pociblemente buena evolución CUALIFICACION* Baja replicación viral Hepatitis B y D** + + Buena evolución*** + + +/+/+ Confección Delta * La curación se definirá con la aparición de anti -HBs a títulos superiores a 10/20 mUI/mL. ** Especialmente indicado en individuos adictos a drogas por via parenteral (ADVP). *** Aunque posiblemente desarrolle el estado de portador asintomático. TABLA 3 HEPATITIS B DE EVOLUCION CRONICA Más de 6 meses con HBsAg (+) y anti-HBc (+)

PERFIL DE CUALIFICACION Hepatitis B

HBeAg +

Anti-HBe -

+

-

-

+

+ Anti-Delta IgM PERFIL DE CUALIFICACION Hepatitis D

+ -

HBV-DNA* +

INTERPRETACION Replicación viral No replicación viral Posible seroconversión a anti-HBe en poco tiempo Replicación viral Infección por variante + pre-core menos. Generalmente mala evolución Portador asintomático Portador asintomático Anti-Delta IgG INTERPRETACION Sobreinfección ó +/enfermedad crónica Delta Probable curación de la + infección Delta

* Determinado por Hibridación ó PCR. La determinación de antígeno Delta puede ayudar a cualificar la infección Delta, pero tiene escaso ** rendimiento práctico. TABLA 4 HEPATITIS AGUDA ACTUAL O RECIENTEMENTE PASADA CON ANTI-HCV (+)

PERFIL DE CUALIFICACION Hepatitis C

PRUEBAS CONFIRMATORIAS Positivas Negativas Indeterminado

INTERPRETACION Según clínica: Hepatitis aguda/crónica/curada* Posible hepatitis NANBNC Confirmar con otras pruebas

* En estos casos la detección de RNA viral puede confirmar el diagnóstico.

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Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: José Romero Vivas

Emilio Bouza Santiago Elena Loza Fernández de Bobadilla Ana Planes Reig Adelaido Rodríguez Cobacho

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INDICE INTRODUCCION CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS BACTERIEMIAS. ETIOLOGIA DE LAS BACTERIEMIAS. DIAGNOSTICO DE LAS BACTERIEMIAS. OBJETIVOS. TECNICAS DEL HEMOCULTIVO. INDICACIONES. METODOS. EXTRACCION. PROCEDIMIENTO. 1.Recepción de frascos de hemocultivos en el laboratorio. 2.Ventilación de los frascos aerobios. 3.Temperatura y período de incubación. 4.Procesamiento inicial. 5.Inspección y procesamiento diario. 6.Procesamiento de los hemocultivos positivos. INFORMACION DE LOS RESULTADOS. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS. SISTEMAS AUTOMATICOS DE LECTURA. CASOS ESPECIALES. METODOS CUANTITATIVOS. MICROORGANISMOS ESPECIALES. Micobacterias Leptospiras. Leishmanias. PACIENTES CON INFECCION POR VIH. ESTADISTICA. CONTROL DE CALIDAD. RECOMENDACIONES. BIBLIOGRAFIA

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3. HEMOCULTIVOS 1993 INTRODUCCION Definimos como bacteriemia la presencia de bacterias en la sangre que se pone de manifiesto por el aislamiento de éstas en los hemocultivos. La bacteriemia es una complicación grave de las infecciones bacterianas, con importantes implicaciones pronósticas, que se presenta en general en pacientes hospitalizados. El término fungemia se utiliza para designar la presencia de hongos en la sangre, de forma análoga a como hemos definido bacteriemia. La mayoría de las fungemias son causadas por levaduras como Candida y Criptococcus y tienen las mismas implicaciones y metodología diagnóstica que las bacteriemias por lo que las describiremos de forma conjunta. Septicemia o sepsis son expresiones que se emplean a menudo para denominar el sindrome clínico con el que se manifiestan las bacteriemias, independientemente del resultado de los hemocultivos. Por ello, resulta bastante confuso y preferimos no utilizarlo en esta revisión. La bacteriemia y la fungernia se producen cuando la multiplicación y llegada de microorganismos a la sangre supera la capacidad del sistema reticuloendotelial para elirninarlos. La invasión del torrente sanguineo se produce desde un foco de infección extravascular, a través de los capilares o de las vías linfaticas, o desde un foco intravascular como en la endocarditis. La diferenciación entre bacteriernias continuas como aquellas en que los microorganismos estan llegando constantemente a la sangre y bacteriemias intermitentes, en las que se encuentran en la sangre de forma discontinua, es difícil de establecer y no tiene interés en la práctica. La bacteriemia y la fungernia tienen implicaciones pronósticas importantes ya que se asocian a una elevada mortalidad que oscila entre el 20 y 40%. El descenso de ésta se encuentra claramente relacionado con la administración de un tratamiento antibiótico adecuado lo más precozmente posible. Por ello, el aislamiento de un microorganismo en los hemocultivos es trascendente porque establece el diagnóstico etiológico de la bacteriemia y permite conocer la sensibilidad del microorganismo causal a los antimicrobianos. La aplicación de una buena metodología para la extracción y procesamiento de los hemocultivos debe perseguir: 1. - El

aislamiento de todos los microorganismos productores de bacteriemia. Para ello deben tenerse en cuenta sus diferentes requerimientos nutricionales, temperatura y atmósfera de óptimo crecimiento y período de incubación. 2.- La deteccición precoz de la presencia de bacterias en sangre de forma que las modificaciones del traramiento que ello conlleva se puedan realizar con la mayor rapidez. 3.- La diferenciación, en la medida de lo posible, de los casos de verdadera bacteriernia de aquellos en los que la positividad se debe a un inadecuado procedimiento de extracción y procesamiento de la muestra. 4.- La identificación precisa de los agentes causales de la bacteriemia y su sensibilidad a los antimicrobianos. CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS BACTERIEMIAS. La incidencia de la bacteriemia depende de la población estudiada y oscila entre 5 y 30 casos por cada 1000 pacientes hospitalizados. Se presenta a cualquier edad y están especialmente predispuestos a padecerla los pacientes con graves enfermedades de base y los sometidos a maniobras que causan alteraciones de los mecanismos generales y locales de defensa frente a la infección. La bacteriemia puede ser una complicación de infecciones localizadas como infección urinaria, infecciones respiratorias, etc., puede deberse a la irrupción directa de los microorganismos en el torrente cardiovascular como en el caso de pacientes adictos a drogas, portadores de catéteres intravasculares y sometidos a cirugía cardíaca, o bien la puerta de entrada puede ser inaparente. Las manifestaciones clínicas de las bacteriemias son muy variadas y van desde un cuadro febril, sin ninguna otra manifestación clínica, hasta el shock séptico con fracaso multiorgánico. ETIOLOGIA DE LAS BACTERIEMIAS. La mayoria de los microorganismos son capaces de invadir el torrente sanguíneo. La distribucición de los agentes causales de la bacteriemia y la fungemia ha variado en los últimos años y actualmente los microorganismos Gran positivos, especialmente estafilococos y enterococos, igualan o superan en frecuencia a los bacilos Gram negativos. Los motivos de este cambio no se han establecido con exactitud, pero se atribuyen

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a la utilización de antibióticos de amplio espectro, al uso generalizado de catéteres intravasculares, a la mayor supervivencia de enfermos graves, a la aparición de resistencia a los antimicrobianos en microorganismos como Sraphylococcus aureus o Enterococcusque pueden causar brotes de infección hospitalaria, a la mayor agresividad de la cirugía y a la utilización de maniobras terapéuticas invasivas. Por otra parte, el aumento de pacientes con neoplasias o infección por VIH, gravemente inmunodeprimidos, ha provocado la aparición cada vez más frecuente de bacteriemias causadas por agentes que en el pasado eran causa muy rara de infección (Corynebacterium,...) DIAGNOSTICO DE LAS BACTERIEMIAS. El diagnóstico definitivo de la bacteriemia se establece cuando se aísla el microorganismo causal en la sangre, mediante el cultivo de ésta. Además, la necesidad de realizar hemocultivos deriva de los siguientes hechos: 1.- El aislamiento de una bacteria en los hemocultivos aporta una valiosa información a la hora de elegir el tratamiento antimicrobiano adecuado. 2.- El hemocultivo no es una técnica costosa y su obtención no conlleva ningún riesgo para el paciente. 3.Las características clínicas de la bacteriemia y las situaciones en que puede presentarse son tan variadas que no permiten establecer un diagnóstico clínico con suficiente certeza. Todo ello obliga a mantener un alto índice de sospecha y extraer hemocultivos a muchos de los pacientes que ingresan en el hospital o que consultan por sospecha de infección. Existen dos datos que ilustran este hecho, por una parte, en el 14-25% de los pacientes hospitalizados se sospecha bacteriemia y se les extraen hemocultivos y por otra, en aproximadamente el 14% de los casos en los que se obtienen hemocuitivos se establece el diagnóstico de bacteriemia.

OBJETIVOS El hemocultivo tiene una importancia capital no solo porque establece con certeza el diagnóstico etiológico, sino también porque la identificación del microorganismo causal y el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos permite elegir el tratamiento más eficaz. Por ello, el diagnóstico de las bacteriemias, con un adecuado procesamiento de los hemocultivos, debe

ser una de las funciones más importantes del Laboratorio de Microbiología Clínica. En este documento se desarrollan las normas generales para el estudio microbiológico de las bacteriemias con el fin de que pueda servir de guía para el procesamiento de los hemocultivos en el Laboratorio de Microbiología y persigue los siguientes objetivos: 1.- Describir las normas de recogida de muestras de sangre para hemocultivos. 2.- Establecer el volumen de sangre, número de hemocultivos y medios de cultivo a utilizar. 3.- Definir la metodología para su procesamiento. 4.- Establecer una guía de interpretación adecuada de los resultados para que éstos proporcionen una información lo más rápida y útil posible.

TECNICAS DE HEMOCULTIVO INDICACIONES. Es imposible detallar todas las situaciones en que se deben extraer hemocuitivos, pero de una forma general las indicaciones más importantes son: 1.- Fiebre alta, especialmente si se acompaña de afectación grave del estado general para la que no existe una causa clara que lo explique y especialmente si se asocia con fracaso de órgano como distress, hígado de sepsis, etc. La información que aportan los hemocultivos es singularmente valiosa en pacientes en los que se sospecha endocarditis, con alteraciones valvulares o fenómenos periféricos característicos de esta entidad, y en neutropónicos que presentan fiebre. Existen pacientes en los que la bacteriemia puede cursar sin fiebre como es el caso de los neonatos o de pacientes ancianos, en los que esta se acompaña de deterioro de su situación general y, en ocasiones, de hipotermia. 2.- Estado de shock no explicado por causas hemodinámicas. 3.- Infecciones localizadas que pueden complicarse con bacteriemia como neumonía, pielonefritis, meningitis, infecciones intraabdominales, infecciones graves de la piel o tejido celular subcutáneo, etc. 4.- La presencia de leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con procesos hematológicos. MÉTODOS. Los métodos para el estudio microbiológico de los hemocultivos pueden ser

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cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos. Los cuantitativos permiten establecer el número de bacterias por ml. de sangre cultivada. La técnica que se sigue es la descrita por Schotmüeller y consiste en preparar placas de agar sangre mediante la mezcla de una muestra de sangre obtenida del paciento y agar nutriente. Este procedimiento es engorroso, necesita personal experto en la preparación del medio, que pueda realizarlo en el momento en que se sospecho la bacteriemia y se extraiga la sangre y no es válido para el aislamiento de bacterias anaerobias.Todo ello hace imposible el empleo rutinano de esta técnica en los laboratorios que reciben un elevado número de hemocultivos, por lo que se reserva al estudio de casos especiales en los que sea importante determinar el número de bacterias por ml. de sangre, como en las sepsis asociadas a catéter. En los métodos semicuantitativos se sigue un procedimiento de lisis centrifugación. Para ello, se realiza la extracción de sangre en un tubo "sistema vacutainer" con saponinas que rompen las células sanguineas. La sangre se centrifuga y el sedimento se siembra directamente en las placas de cultivo. Este método permite una valoración semicuantitativa por recuento de las colonias aisladas, consigue a menudo una identificación más rápida de los microorganismos causales y facilita la búsqueda de bacterias como micobacterias o Legionella al permitir seleccionar los medios de cultivo más adecuados para aislar dichos microorganismos. Tiene el inconveniente de que la manipulación de la muestra aumenta la posibilidad de contaminación y requiere un procesamiento individualizado con la consiguiente necesidad de personal de laboratorio. Los métodos cualitativos se realizan cultivando la sangre en frascos con medio líquido o bifásico y son los utilizados de forma rutinaria en la mayoria de los Laboratorios de Microbiología. En éstos el medio de cultivo debe examiniarse diariamente para detectar lo antes posible los signos de crecimiento bacteriano. En el procedimiento convencional este examen diario se realiza por inspección visual de los frascos y es el que describiremos en primer lugar en este documento. Existen otros procedimientos de lectura basados en la producción de C0² que facilitan aparatos automáticos. Estos se han ido incorporando a los Laboratorios de Microbiologia porque

detectan con rapidez el crecimiento bacteriano y facilitan el trabajo del personal de laboratorio. EXTRACCION. Las muestras de sangre para hemocultivos deben obtenerse por venopunción. El momento más adecuado para extraerlas debe coincidir con aquel en el que existe un mayor número de bacterias en sangre, lo que procede a la aparición de la fiebre. En muchos de nuestros hospitales la extracción se realiza cuando la temperatura aumenta por encima de 38,5ºC. La contaminación de los hemocultivos por microorganismos de la flora cutánea durante la extracción se evitará, en la medida de lo posible, con la adecuada preparación de la piel mediante una antisepsia adecuada. El procedimiento de extracción es diferente según los hospitales; mientras en algunos es responsabilidad de un equipo único, en otros depende del personal de enfermeria encargado de la asistencia del paciente. El microbiólogo vigilará el adecuado cumplimiento de las normas de extracción y realizará una labor de formación del personal encargado de esta tarea. 1.- Elección del punto de venopucción y asepsia de la piel. Antes de la extracción de cada hemocultivo se preparará el material necesario. Se utilizará una bandeja que contenga: antiséptico yodado (povidona, yodo u otro yodóforo), alcohol isopropílico al 70%, jeringas do 20 ml., agujas para venopunción, gasas y guantes estériles, esparadrapo, compresor de goma y frascos para hemocultivos aerobios y anaerobios. Cada una de las muestras de sangre se obtendrá de venopunciones diferentes y los puntos se seleccionarán previamente. Las venas del antebrazo son las que se utilizan generalmente para este fin. La extracción de la sangre no debe realizarse a través de catéter, salvo en los casos de sospecha de sepsis asociada a éste como se describirá en el apartado de casos especiales. La sangre arterial se ha recomendado para el diagnóstico de las endocarditis por hongos, pero no se han comprobado sus ventajas sobre la sangre extraida por venopunción. Se limpiarrá rigurosamente el punto elegido de la piel con alcohol isopropílico o etílico al 70% y posteriormente se extenderá sobre el mismo tintura de yodo al 1 ó 2% durante 30 segundos o povidona yodada durante 1 minuto. Es importante esperar a que el compuesto yodado se seque para que

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ejerza su acción oxidante y evitar tocar con los dedos el lugar de la venopunción, así como hablar o toser mientras se realiza la extracción. En pacientes alérgicos al yodo, la piel se limpiará dos veces con alcohol. Antes de realizar la extracción se limpiarán con un antiséptico los tapones de los frascos de hemocultivo. 2.- Extracción de la sangre. Se inserta la aguja en la vena elegida para extraer el volumen de sangre determinado (ver apartado volumen). Una ver terminado el procedimiento se quitará el compresor y se retirará la jeringa con la aguja de la vena. No poner algodón u otro material no esteril sobre la aguja en el momento de sacarla de la vena. Se inocularán los frascos rápidamente, para evitar la coagulación de la sangre en la jeringa, atravesándolos con la aguja en posición vertical. No es necesario cambiar la aguja para hacerlo. Es conveniente recordar que el vacío que incorporan los frascos succiona rápidamente el contenido de la jeringa. Se inoculará en primer lugar el frasco anaerobio evitando la entrada de aire. Si la vena se pierde durante la extracción, utilizar un nuevo equipo de aguja y jeringa. Retirar los restos de yodo de la piel y cubrir con una gasa estéril. La extracción de sangre se hará sin anticoagulante, excepto en los hemocultivos cuantitativos que se describirán en el apartado correspondiente. 3.- Dilución y volumen de la sangre. La dilución de la sangre es necesaria con el fin de neutralizar las propiedades bactericidas de ésta y el posible tratamiento antimicrobiano del paciente. Se recomienda una dilución 1/10. Diluciones superiores no son aconsejables aunque pueden ser aceptadas, sobre todo en el caso de los niños. El volumen de sangre a cultivar admitido en general para adultos es de 10 ml por extracción, aunque algunos autores recomiendan 20 ó 30 ml. En niños, especialmente recién nacidos y prematuros, de 1 a 5 ml. 4.- Número de hemocultivos y medios de cultivo. Es aconsejable extraer la sangre antes de comenzar el tratamiento antimicrobiano Se recomienda obtener 2 ó 3 muestras en 24 horas con un intervalo entre ellas superior a una hora. Sin embargo, generalmente se aceptan dos o tres extracciones separadas 30 minutos cada 24 horas. En casos de extrema urgencia como meningitis, shock séptico, etc. el intervalo puede reducirse. Los 10 ml. de sangre de cada extracción se

repartirán a partes iguales en dos frascos con tapón de goma con medios de cultivo aerobio y anaerobio. Existen numerosos tipos de frascos de hemocultivo, además de los referidos para el crecimiento de microorganismos aerobios y anaerobios. Destacan entre ellos los optimizados para pequeños volúmenes de sangre, útiles en pediatría, los medios con resinas que neutralizan los antibióticos que recibe el paciente, los selectivos para hongos, etc. que pueden ser utilizados en casos específicos. 5.- Etiquetado de los frascos y transporte. Los frascos se marcarán con una etiqueta en la que conste el nombre del paciente, el número de la cama y la hora de la extracción para identificar correctamente las parejas de frascos de cada una de las extracciones. Cada extracción se acompañará de un volante en el que consten, al menos, los siguientes datos: nombre y dos apellidos del paciente, fecha y hora de extracción, servicio de procedencia, número de cama, nombre del médico que realiza la petición, diagnóstico del paciente y tratamiento antibiótico previo. Los hemocultivos se enviarán inmediatamente al Laboratorio de Microbiología. Si no es posible, se incubarán en estufa a 35-37ºC. Si no se dispone de ésta, se dejarán a temperatura ambiente, nunca en nevera. PROCEDIMIENTO. En primer lugar, es necesario recordar que la sangre inoculada en los frascos puede contener microorganismos viables, incluidos el virus de la hepatitis o el VIH, lo que implica un riesgo de infección para las personas que los manipulan. En este sentido, existen en todos los hospitales normas de prevención en el manejo de sangre que deben ser seguidas de forma estricta y que muy someramente se podrían resumir en la utilización de guantes, batas, mascariflas desechables, campanas protectoras y en la no reinserción de las agujas en su capuchón original, arrojandolas a los envases preparados a tal efecto. 1.- Recepción de los hemocuitivos en el laboratorio. Los frascos de hemocultivo se enviarán al laboratorio acompañados del volante con los datos descritos. A su llegada, se comprobará la coincidencia de ambos. También es conveniente verificar la hora de extracción ya que los hemocultivos pueden

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haber estado incubados el tiempo suficiente para detectar crecimiento. En muchos de nuestros hospitales los hemocultivos extraídos durante la tarde y la noche se conservan en estufa hasta la mañana siguiente en que se reciben en el laboratorio. Se registrarán los datos del paciente y se numerarán los hemocultivos de acuerdo con las normas de cada laboratorio. Debe realizarse una hoja de trabajo para cada uno de los hemocultivos. 2.- Ventilación de los frascos aerobios. Los medios comerciales permiten el crecimiento de la mayoría de las bacterias y están provistos de vacío. En el caso de ciertos microorganismos aerobios como Pseudomonas, hongos, .. el crecimiento se acelera con la incubación en atmósfera aerobia. Por ello, se deben ventilar los frascos aerobios a su llebada al laboratorio para crear la atmósfera que facilete su crecimiento. La ventilación se hará en condiciones de esterilidad. Para ello se desinfectará el tapón del frasco con alcohol y posteriormente se introducirá una aguja estéril acoplada a una caperuza especialmente diseñada para la ventilación de los frascos. No olvidar que, en caso de existir crecimiento bacteriano, el aumento de la presión en el interior del frasco puede provocar que el líquido se proyecte al exterior con riesgo de contaminación para la persona que lo está procesando. 3.- Temperatura y período de incubación. La mayoría de los microorganismos que causan bacteriemia se detectan en los primeros 2 ó 3 días de incubación. Por ello, se recomienda incubar los hemocultivos durante un período de 5 a 7 días. La temperatura óptima de incubación es de 35 a 37ºC. Existen algunos microorganismos que necesitan un período de incubación más largo, como Brucella y bacterias de díficil crecimiento que causan endocarditis, como Haemophilus, Cardiobacterium, Eikenella, Kingella... También los hongos necesitan, cuando se sospecha la existencia de estos patógenos, la rutina más extendida es la de prolongar la incubación de los hemocultivos hasta 4 semanas. Los pacientes con infección por VIH pueden desarrollar bacteriemia por microorganismos con requerimientos especiales para su aislamiento, en cuyo caso se deben introducir algunas variaciones en este procedimiento que serán desarrollados en el apartado de casos especiales. 4.- Procesamiento inicial.

Los frascos aerobios y anaerobios de hemocultivos deben ser examinados diariamente durante el período que se mantengan en incubación. Para ello, se extraerán de la estufa con cuidado de no agiarlos para mantener el sedimento en el fondo con objeto de poder examinar el grado de turbidez del caldo. La inspección debe realizarse con buena iluminación, de forma ordenada y anotando el resultado en las hojas de trabajo. En la inspección visual, los signos macroscópicos que indican crecimiento bacteriano son la turbidez del caldo, la presencia de colonías bacterianas, la aparición de hemólisis o la producción de gas. En los medios bifásicos se buscarán colonias en la fase sólida. La primera inspección se realizará tras 1824 horas de incubación. Los frascos con signos macroscópicos de crecimiento se separarán para su procesamiento ulterior (apartado 5). En los hemocultivos sin estos signos, con el fin de detectar lo antes posible la presencia de bacterias, se puede realizar una tinción con naranja de acridina o un subcultivo ciego en medios sólidos. a.- Naranja de acridina.La tinción con naranja de acridina permite la visualización de bacterias mediante el examen de la muestra teñida en el microscopio de fluorescencia. Esta técnica es sencilla de realizar, proporciona una información rápida y se correlaciona con el aislamiento de bacterias en los subcultivos con una elevada sensibilidad y especificidad. La tinción con naranja de acridina se realizará de una muestra de los frascos aerobios de cada una de las parejas de hemocultivos sin signos macroscópicos de crecimiento bacteriano. La sangre de los frascos se obtendrá con jeringa y aguja según el siguiente procedimiento: después de limpiar los tapones de los frascos con alcohol de 70º, atravesar con una aguja, previamente conectada a la jeringa, el tapón del frasco en dirección vertical y aspirar el contenido. Tras ello se depositará una gota de sangre en un porta bien limpio, previamente rotulado con el mismo número que el hemocultivo. El resto del contenido de la jeringa se introducirá en un tubo estéril de 3 a 5 ml., rotulado también con el mismo número, que se cerrará herméticamente con tapón de rosca. La jeringa y la aguja se desecharán en un recipiente de paredes duras para residuos biocontaminados.

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Nunca se insertará de nuevo la aguja en el capuchón. La extensión realizada en la porta se tiñe con naranja de acridina y se examina en el microscopio de fluorescencia. En los casos en los que se visualice algún microorganismo, se realizará tinción de Gram y subcultivo de la muestra conservada en el frasco estéril, como se describe en el apartado 6 (Procesarniento de los hemocultivos positivos). b. - Subcultivo ciego. En los casos en que no se realice la tinción con naranja de acridina se hará un subcultivo ciego tras las primeras 18-24 horas de incubación. Para ello, se extraerá una muestra de los frascos de hemocultivos como se ha descrito en el apartado anterior y se sembrará en agar chocolate que se incubará a 35-37ºC, en atmósfera con 5-10% de CO² durante 72 horas. También se puede sembrar en una placa de agar sangre que se incubará en aerobiosis. Las placas se exarninarán diariamente para detectar lo antes posible el crecimiento de bacterias. Algunos autores siembran una estría de Staphylococcus hemolítico en la placa de agar sangre para favorecer el crecimiento de colonias satélites. No es necesario sembrar en anaerobiosis el subcultivo de 24 horas. El subcultivo ciego retrasa la información inicial respecto al naranja de acridina, pero permite obtener colonias aisladas en 24-72 horas por lo que el resultado definitivo no se demora. Esta técnica implica sembrar placas de todos los hemocultivos, lo que supone trabajo y aumento del coste. 5.- Inspección y procesamiento diario. Los frascos de hemocultivos aerobios y anaerobios se examinarán, mediante inspección visual, diariamente durante los 57 días que permanecen de forma ordenada, siguiendo el número de registro y se anotarán los resultados en la hoja de trabajo. Subcultivo de salida.Los hemocultivos que durante el período de incubación de 5-7 días no tengan signos de crecimiento bacteriano, se subcultivarán en medios sólidos de la misma manera descrita para el subcultivo ciego. Si no se obtiene crecimiento, se desecharán los frascos y las placas y los hemocultivos serán informados como estériles a los 5-7 días de incubación. En casos de sospecha de bacteriemia por microorganimos de dificíl crecimiento, tras estos primeros 5-7 días, se prolongará la incubación hasta completar 4 semanas. Durante dicho período, los frascos serán examinados mediante inspección visual 1 ó

2 veces por semana. Si no se observan signos de crecimiento se les realizará un subcultivo de salida al final del mencionado período de incubación y, si éste es negativo, se informarán como estériles a las 4 semanas de incubación y se desecharán definitivimamente. 6.- Procedimientos de los hemocultivos positivos. Los hemocultivos con signos de crecimiento bacteriano y aquellos en los que la tinción de naranja de acridina revele la presencia de microorganismos se procesarán para obtener la información más rápida y exacta posible sobre su identidad y sensibilidad a los antimicrobianos. En primer lugar se extraerá una muestra de todos los frascos con signos de crecimiento mediante jeringa y aguja siguiendo el procedimiento y las precauciones recogidas en el apartado de procesamiento inicial. De dicha muestra se realizará una extensión en un porta bien limpio, previamente rotulado con el número del hemocultivo, para efectuar una tinción de Gram y un subcultivo, independientemente del resultado del examen del Gram, en agar sangre, agar chocolate y agar sangre enriquecido que se incubarán en aerobios, 5-10% de CO² y anaerobios, respectivamente. El resto de la muestra de rosca se guardará en un tubo esteríl con tapón de rosca previamente rotulado. Las extensiones teñidas mediante la técnica de Gram se examinarán al microscopio óptico con 1.000 aumentos. El resultado de dicho examen se anotará en la hoja de trabajo, detallando todos aquellos datos que puedan ser de utilidad para determinar con la mayor fiabilidad posible la identificación presuntiva del microorganismo causal. Los siguientes ejemplos recogen la mayoría de los casos: A. Cocos Gram positivos en racimos, B. Cocos Gram positivos en parejas o cadenas. C. Cocos Gram negativos en parejas o cadenas. D. Bacilos o cocobacilos Gram negativos, E. Bacilos Gram positivos tipo Bacilus o Corynebacterium, F. Formas ramificadas, G. Levaduras, H. Tinción irregular, I. Pleomorfismo y J. Más de un tipo de microorganismo, como cocos Gram positivos y bacilos Gram negativos. Las muestras en las que se haya visualizado algún microorganimo en la tinción de Gram se sembrarán ulteriormente del tubo estéril en los medios adecuados según la información obtenida y se procesarán para obtener la identificación del

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microorganismo y su sensibilidad a los antimicrobianos (ver esquema). INFORMACION DE LOS RESULTADOS. La información de los resultados, preliminares o definitivos, se realizará con la mayor rapidez posible ya que de ella derivarán posiblemente cambios en el tratamiento que pueden ser vitales para el pronóstico del paciente. En primer lugar, se debe poder disponer del resultado del examen diario de cada hemocultivo. En segundo lugar, el resultado de la tinción de Gram se informará telefónicamente a los médicos que asisten al paciente y, si es posible, también por escrito. En tercer lugar, la identificación definitiva de los microorganismos aislados y el resultado de su sensibilidad a los antibióticos se enviará por escrito por los cauces más rápidos. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS. La interpretación óptima de los resultados de los hemocultivos requiere en general el conocimiento de la situación clínica del paciente, su enfermedad de base, los factores predisponentes a la infección y los tratamientos antimicrobianos que le han sido administrados. Ello obliga, en colaboración con el medico responsable de la atención clínica de dichos pacientes, a revisar la historia clínica, los hallazgos de la exploración física y los resultados de los examenes complementarios realizados. En ausencia de estas referencias clínicas, la interpretación de los resultados por parte del microbiólogo puede estar sujeta a errores, pero hay datos que pueden ayudarle como la identidad del microorganismo y el número de frascos de los que se ha recuperado. Por ejemplo, la presencia de un Staphylococcus coagulasa negativo, Streptococcus del grupo viridans, Corynebacterium, Propionibacterium o Bacillus en un solo frasco de una serie de tres hemocultivos supone a menudo la existencia de contaminación. SISTEMAS AUTOMATICOS DE LECTURA. En los últimos diez años se han desarrollado diferentes sistemas automáticos para la lectura de los hemocultivos con el fin de aumentar la sensibilidad y la rapidez en la detección del crecimiento bacteriano y agilizar el trabajo del personal encargado. Estos sistemas se basan en la detección del CO² que se produce en el crecimiento bacteriano por diferentes métodos, radiométricos,

fluorimétricos, espectrometría de infrarrojos, cambios del pH, etc. BACTEC fue el sistema automático inicialmente introducido que ha sido utilizado en mcuhos Laboratorios de Microbiología de centros hospitalarios. Su primer procedimiento de lectura fue el radiométrico, que utilizaba un sustrato marcado con carbono radioactivo (C14) que al ser metabolizado por las bacterias liberaba C0² marcado la medio. Su principal inconveniente era la eliminación de residuos radiactivos y ha quedado relegado para el cultivo de ciertos microorganismos como micobacterias. Actualmente, el sistema BACTEC detecta la presencia de CO² por un procedimiento de infrarrojos. Existe diferentes versiones de este sistema. La más conocida, BACTEC NR 660, consta de un ordenador que almacena los resultados, una estufa con un agitador y un módulo de lectura conectado a dos bombonas con una mezcla fija de gases previamente determinada por el fabricante. Este método detecta los niveles de C0² producidos por las bacterias en los frascos con medio líquido y los expresa como un índice de crecimiento al compararlos con los niveles de C0² en frascos de control. En general, un índice de crecimiento superior a 30 o un valor diferencial entre dos lecturas consecutivas superior a 15 es considerado como positivo. Estos parámetros pueden ser modificados por el usuario para conseguir una sensibilidad y especificidad óptimas. Este sistema utiliza un agitador para los frascos aerobios durante las primeras 24-48 horas, lo que aumenta la velocidad de crecimiento de los microorganismos. La lectura de los hemocultivos con el sistema BACTEC está totalmente automatizada. Los datos del paciente, la fecha y el número de frascos se introducen en el ordenador, que asigna a cada uno una posición en bandejas especiales. Los frascos que inicialmente tienen claros signos de crecimiento se separan y el resto se colocan el la posición marcada. Las bandejas con los frascos se depositan en el módulo de lectura, que permanecerá cerrado durante todo el proceso, y ésta es realizada por un cabeza móvil provisto de dos agujas que perforan los tapones de goma. Cada frasco es analizado por separado y es pinchado por dos agujas: una extrae el gas para examinar el nivel de C0² y la otra inyecta una mezcla de gases para mantener una atmósfera, aerobia o anaerobia, determinada. El ambiente dentro del módulo de lectura se mantiene estéril

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con una lampara de rayos ultravioleta y las agujas se esterelizarán después de cada éxtracción mediante el calor de una resistencia incandescente. Los primeros tres días se recomiendan dos lecturas diarias de los frascos aerobios para acortar el tiempo de positivización. El ordenador almacena los resultados de la lectura diaria de los hemocultivos durante todos los dias que permanecen en incubación. Cuando existe un índice de crecimiento superior a los niveles establecidos, el sistema informa ese frasco como positivo. Estos se recogen de la bandeja y se procesan mediante tinción de Gram y subcultivo de forma análoga a la descrita en el apartado anterior. Existen un 2% de falsos positivos, en los que se encuentra un indice de crecimiento elevado y no se consigue aislar ningún microorganismo. Se ha atribuido a la actividad de las células hemáticas y se ha descrito en el caso de pacientes con leucemias agudas. Ante la persistencia de lecturas elevadas se debe descartar la presencia de microorganismos de dificil crecimiento. Para ello se realizarán tinciones especiales y subcultivos a medios que permitan el aislamiento de dichos microorganismos. La sensibilidad del sistema BACTEC es elevada y está claramente establecido que no es necesario realizar subcultivos o tinción con naranja de acridina durante las primeras 24 horas ni antes de desechar los frascos, tras 5-7 días de incubación. Ello supone ahorro de personal y disminución del riesgo de contaminación debida a la manipulación de los frascos. Además, permite consultar los resultados diariamente mientras dura la incubación. Este sistema se ha mejorado en una última versión en la que las bandejas son introducidas mecánicamente de forma automática en el módulo de lectura. Sus mayores inconvenientes son su elevado coste, las averias mecánicas y la limitación de la gestión de datos que no admite información externa sobre la identificación de los microorganismos y su sensibilidad a los antimicrobianos y lo convierte en completamente nulo para el análisis estadístico de los resultados. Otros sistemas automáticos introducidos más recientemente eliminan prácticamente toda manipulación, realizan una monitorización de los frascos continua e ininterrumpida, algunos con agitación constante, y notifican inmediatamente los resultados positivos. Todos utilizan técnicas

no invasivas para la lectura por lo que no se necesitan bombonas de gases. BACTEC 9240 detecta el C0² y las variaciones de pH producidos por el crecimiento de los microorganismos por fluorescencia en fase sólida y VITAL en fase líquida, la llamada H.F.T. (Tecnotogía fluorescente homogénea),BACT/ALERT por colorimetria, ESP 128 monitorizando las variaciones de la presión y BIOARGOS por espectroscopia infrarroja. En todos ellos, excepto en el BIOARGOS, existe un detector para cada uno de los frascos que está en la base o en la parte alta del recipiente que aloja a cada uno de ellos. El BIOARGOS, por el contrario, utiliza un solo lector por el que pasan los frascos por medio de un brazo móvil. La sensibilidad y especificidad de estos sistemas en los primeros estudios comparativos parece similar a la del BACTEC tradicional, pero falta aún información para aclarar definitivamente su papel. Es conveniente resaltar el elevado coste de todos estos nuevos sistemas automáticos. Los siguientes aspectos deben tenerse en cuenta a la hora de decidir el sistema a utilizar para la lectura de los frascos de hemocultivos: 1.- Sensibilidad y especificidad. 2.- Rapidez de la detección de crecimiento bacteriano. 3.- Volumen y composición de los frascos. 4.- Capacidad del sistema. 5.- Mantenimiento. 6.- Ahorro de personal. 7.- Coste del sistema, incluido el gasto de las botellas de gases. 8.- Flexibilidad en la gestión de datos y versatilidad y sencillez del programa estadístico. CASOS ESPECIALES.

MÉTODOS CUANTITATIVOS Cada vez es más frecuente la canalización vascular de los pacientes ya sea con fines terapéuticos y/o diagnósticos y por lo tanto mayor la posibilidad de desarrollar una infección asociada a un catéter. Se estima que la bacteriemia asociada a un catéter se produce entre el 1 y el 8% de las cánulas utilizadas. Por otra pane, el 33% de las bacteriemias nosocomiales tienen este origen. En los pacientes policateterizados o portadores de catéter central para tratamientos prolongados o hemodiálisis en los que se sospeche que son foco de infección es posible hacer hemocultivos

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cuantitativos. Estos se realizarán a partir del catéter y al mismo tiempo por venopunción. Técnica: Se extraen de 4 a 7 ml. de sangre a través de cada catéter que se quiera estudiar y se introducen en un tubo que contenga anticoagulante, el óptimo es el SPS. Se transportará al laboratono rápidamente y se realizarán placas por el método de Schotmüeller. En cada uno de los tubos se especificará de forma muy clara la procedencia de la extracción. Se procede de la misma manera con la extracción por venopunción y a la vez se realiza un hemocuitivo convencional ya que la bacteriemia puede ser de muy bajo grado y no detectarse con el método cuantitativo, o no ser el catéter el foco de la bacteriemia. Las placas se incuban a 35-37ºC durante 5 días con lectura diaria. El procesamiento de los positivos es igual al de la técnica convencional descrita. Se considera que un catéter es foco de bacteriemia cuando se aisla la misma bacteria en los dos hemocultivos cuantitativos y el número de UFC/ml. aisladas en el del catéter es 4 veces superior al obtenido por venopunción.

MICROORGANISMOS ESPECIALES Micobacterias La sangre no es la muestra más adecuada para diagnosticar una micobacteriosis. No obstante, actualmente en pacientes portadores del VIH se ha observado que presentan micobacteriemia con relativa frecuencia, generalmente con muy poca sintomatología o muy inespecifica. En estos casos puede estar indicado investigar la presencia de micobacterias en sangre. Las técnicas mas apropiadas para ello son el Sistema Lisis Centrifugación y/o el Sistema BACTEC radiométrico utilizando los medios 12A y13A. Es posible también hacer una combinación de ambos: procesar la sangre por la técnica de lisis/centrifugación y sembrar después en los viales del BACTEC con el fin de acortar el período de incubación. Recientemente, otros autores recomiendan centrifugar el contenido de los frascos aerobio y anaerobio tras su incubación 5-7 dias y sembrar el sedimento obtenido en medios especificos para micobacterias. Leptospiras La leptospirosis es una infección aguda producida por espiroquetas del género Leptospira que se muestra a menudo con un amplio espectro de manifestaciones clínicas. Generalmente, el microorganismo

está presente en la sangre en la fase aguda, durante la primera semana de la enfermedad. Cultivo: Se realiza añadiendo de 1 a 3 gotas de sangre fresca del paciente a 5 ml. del medio de Stuart o a los medios semisólidos de Fletcher o Ellinghausen. Previamente a la inoculación de la sangre añadiremos suero fresco de conejo a una concentración del 14%. La incubación se hace en oscuridad, a 30ºC durante 28 días. Se examina una vez a la semana en campo oscuro una parte del cultivo para la observación de las formas espiroquetales y su movilidad. El examen directo de la sangre en campo osuro no es recomendable ya que pueden confundirse restos de hematíes con Leptospira. Ante la sospecha de leptospirosis es aconsejable determinar la presencia de anticuerpos específicos. Leishmanias En los países mediterráneos es frecuente la leishamaniasis, parasitosis del sistema mononuclear fagocítico causada por Leishamania donovani . Desde la aparición del sida, esta parasitosis ha aumentado en nuestro medio siendo una de las infecciones más frecuentes en este tipo de pacientes. El diagnóstico requiere la demostración de la presencia de Leishamania ya sea por examen microscópico, realizando una tinción de Giemsa, a partir de las muestras obtenidas de médula ósea, de una biopsia de bazo de una adenopatía o bien por cultivo. Cultivo: El medio clásico es el NNN, al cual hay que añadir una tercera parte de su volumen de sangre desfibrinada de conejo. Es algo engorroso de preparar y fácil la contaminación del mismo. Otros medios útiles son el medio Drosophila de Schneider al que se añade suero fetal bovino a una concentración del suero fetal bovino a una concentración del 30% o bien MEM (Eagle minimal esential medium) al que también se le adiciona suero fetal bovino. Se inoculan dos o tres gotas de la muestra por tubo de medio preparado y se deja a temperatura ambiente durante 1 mes. Lectura: Se realiza un examen microscópico del medio de cultivo colocando una gota entre porta y cubreobjeto al tercer día y una vez por semana.

PACIENTES CON INFECCION POR VIH. Cada vez es mayor el número de pacientes atendidos en los centros hospitalarios

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portadores del VIH, un alto porcentaje de los cuales son adictos a drogas por vía parenteral (ADPV) y, al mismo tiempo han aumentado considerablemente los enfermos con sida. Es bien conocido que el estado inmunitario de estos pacientes condiciona una elevada incidencia de infecciones oportunistas, estimándose en este grupo de población un índice de bacteriemia entre el 7,2 y el 30%, cuya etiología más frecuente es Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus auerus y Salmonella spp. Además, este tipo de enfermos presentan infecciones oportunistas diseminadas causadas por micobacteria, hongos o parásitos que pueden detectarse mediante hemocultivo. Así, son frecuentes las infecciones diseminadas por Mycobacterium avium, Criptococcus neoformans y Leishmania donovani y en nuestro país, donde la prevalencia de la tuverculosis es elevada, es habitual aislar Mycobacterium tuberculosis. Por lo tanto, es aconsejable notificar siempre al Laboratorio de Microbiología si un paciente es portador de VIH porque puede ser conveniente prolongar el período de incubación de los frascos aerobios o hacer cultivos especiales según la orientación diagnóstica del proceso infeccioso actual. ESTADISTICA. Con objeto de conocer en cada medio la incidencia y la etiología de la bacteriemia es aconsejable que, al menos una vez al año y preferiblemente cada mes, se recojan y ordenen los datos generados en el procesamiento diario de los hemocultivos. Se obtendrán la cifra total de hemocultivos procesados, el número de pacientes a los que corresponde, el número de hemocultivos positivos, diferenciando los verdaderos positivos de los contaminantes, la cifra de pacientes con bacteriemia, así como la incidencia de todas las especies aisladas. Si es posible, todos los datos mencionados se desglosarán por servicios, lo que permitirá valorar brotes epidémicos y la calidad de la extracción por el índice de contaminaciones de cada uno. CONTROL DE CALIDAD Los medios de cultivo y reactivos empleados en el procesamiento de los hemocultivos deberán cumplir las normas de control de cada laboratorio.

Control de los aparatos automáticos. En cuanto al aspecto técnico es muy importante respetar estrictamente las normas del fabricante. Falsos positivos. No deberán superar el porcentaje garantizado por cada sistema automático. Falsos negativos. Es conveniente comprobar con cierta regularidad que no sobrepasen el 0,5%. Una forma sencilla de hacerlo es realizando periódicamente subcultivo de salida a todos los frascos que hayan cumplido el período de incubación. Pseudobacteriemias. Ante un aumento de su incidencia se revisarán exhaustivamente los procedimientos de extracción y procesamiento de los hemocultivos. Eficacia. Para verificar la eficacia del procesamiento utilizado se aconseja inocular en un frasco, de forma confidencial, un microorganismo de difícil crecimiento como Haemophilus o Campylobacter.

RECOMENDACIONES 1.- La extracción de los hemocultivos seguirá unas medidas de asepsia muy rigurosas. Se informará periódicamente al personal encargado de la extracción de la importancia de los hemocultivos, de los problemas que conlleva la contaminación de esta muestra y de las normas a seguir para una adecuada recogida. Durante la extracción y el procesamiento de los hemocultivos se tomarán las medidas de protección adecuadas para evitar la adquisición de infecciones como hepatitis e infección por VIH. 2.- Se extraerán dos o tres hemocultivos por venopunciones diferentes, cada una con un volumen de sangre de 10 ml. que se repartirá a partes iguales en un medio aerobio y en un medio anaerobio. 3.- El frasco aerobio se ventilará y en el anaerobio se evitará la entrada de aire. 4.- Los frascos se incubarán lo antes posible en estufa de 35-37ºC. Nunca se mantendrán en nevera. 5.- Entre las 18 y las 24 primeras horas de incubación se realizará una lectura macroscópica de los frascos. A los que no tengan signos de crecimiento se les efectuará una tinción con naranja de acridina o un subcultivo ciego. Este procesamiento inicial no es necesario Si se utilizan aparatos automáticos de lectura basados en la detección de C0².

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ESQUEMA DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE HEMOCULTIVOS

COCOS Gram (+) En diplos o cadenas

En racimos

DNASA y/o coagulasa ntibiograma

Gram (-) Antibiograma en agar chocolate y CO2

Optoquina, bilis esculina CINa al 6,5% Antibiograma

COCOBACILOS Gram (-) Antiobiograma en agar chocolate y CO2

BACILOS Gram (+)

Gram (-) Pruebas bioquímicas de identificación Antibiograma

Coryneformes

Esculina Antibiograma en agar sangre

LEVADURAS Medios para hongos 6. - Los hemocultivos se incubarón 5-7 días salvo en los que se sospeche bacteriemia por microorganismos de difícil crecimiento en los que se extenderá la incubaci6n hasta 4 semanas. Durante la primera semana de

incubación los hemocultivos serán examinados diariamente, mediante inspección visual o leídos en los sistemas automaticos, para detectar lo antes posible signos de crecimiento bacteriano. Después

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de finalizado el período de incubación se realizará un subcultivo en métodos sólido, que puede evirarse si se utilizan métodos automáticos de lectura. 7.- En los hemocultivos con signos de crecimiento se realizará una tinción de Gram de cuyos resultados se informará lo antes posible al médico responsable de la asistencia al paciente. También se efectuará un subcultivo a medios sólidos para obtener colonias aisladas y pruebas de identificación y sensibilidad a los antimicrobianos. 8.- Si es necesario, se realizarán nuevas pruebas de identificación y sensibilidad a los antibióticos a partir de las colonias aisladas que serán informadas como resultados defintivos. 9.El microbiólogo realizará una interpretación de los resultados basada en la identidad del microorganismo, el número de cultivos positivos, las manifestaciones clínicas y el tratamiento antibiótico previo que haya recibido el paciente, lo que necesitará ser compartido con el médico responsable de la asistencia del paciente. 10.- Es necesario realizar controles de calidad de los medios de cultivo, de los reactivos y de los aparatos. La información derivada del análisis estadístico de los resultados orientará sobre la calidad de la técnica de extracción y del procesamiento y dará una információn valida sobre la incidencia y la etiología de las bacteriemias en cada hospital.

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Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: J. M. Echevarría Mayo

Alberto Delgado Iribarren Antonio Fuertes Ortiz Luis Guerra Romero Carmen Gutiérrez Villamayor José Luis Prieto Alonso

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INDICE

A.- Introducción B.- Consideraciones generales B.1.- Principales agentes infecciosos de transmisión vertical B.2.- Agentes a incluir ó excluir en el control serológico de la embarazada normal B.3.- Aproximaciones de laboratorio al control serológico de la embarazada B.4.- ¿Cuándo realizar el control serológico? B.5.- Infecciones no reconocibles mediante métodos serológicos: herpes simplex y estreptococo C.- Objetivos del control serológico de la embarazada D.- Recomendaciones generales D.1.- Virus de Ia rubeola D.2.- Toxoplasma gondii D.3.- Virus de Ia Hepatitis B D.4.- Treponema pallidum D.5.- Virus de la Inmunodeficiencia Humana E.- Resumen de recomendaciones Primera visita a la consulta de Tocología/Medicina General Revisiones de la gestante F.- Bibliografía seleccionada

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4. SEROLOGÍA DE LA EMBARAZADA 1993 A.- INTRODUCCIÓN Los agentes infecciosos que poseen la capacidad de transmitirse de la madre al niño durante el embarazo ó el periodo neonatal (agentes de transmisión vertical) constituyen una fuente importante de problemas de salud en los recién nacidos. El reconocimiento de este hecho ha impulsado el desarrollo de programas de prevención y control de dichas infecciones a nivel mundial. Entre las acciones concretas relacionadas con estos programas (campañas de vacunación y educación sanitaria, programas de diagnóstico etiológico de infecciones en el embarazo e infecciones congénitas, confección de registros de casos a nivel nacional, etc), el control serológico rutinario para presencia de anticuerpos ó antígenos específicos de ciertos agentes infecciosos en la embarazada normal ha sido una de las mas extendidas. En España, esta acrividad comienza a realizarse en algunos centros sanitarios a principios de la decada de los 80 y llega a generalizarse a partir del año 85. En la actualidad, forma parte de la rutina de la mayoría de los hospitales y centros de atención primaria del Estado Español.

B. CONSIDERACIONES GENERALES B.1.- Principales agentes infecciosos de transmisión vertical El Cuadro 1 recoge los principales agentes infecciosos humanos de transmisión vertical reconocidos hasta la fecha, divididos en tres grupos, de acuerdo a los mecanismos patogónicos que determinan la transmisión. En la infección congénita por el virus de la rubéola, así como en la infección congénita grave por citomegalovirus humano (CMV) y Toxoplasma gondii, la fuente de infección fetal es la viremia ó parasitemia que se produce en la mujer embarazada durante la primoinfección aguda, por lo que el riesgo de transmisión se asocia, única ó fundamentalmente, a ese momento. Por el contrario, en la infección congénita ó neonatal por virus de la Hepatitis B (VHB), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y Treponema pallidum, la fuente de infección para el feto ó el neonato reside, ante todo, en la sangre y otros fluidos orgánicos de la mujer que sufre una infección persistente ó crónica, por lo que el riesgo de transmisión existe mientras se mantenga dicha situación.

Por último, la infección neonatal por virus herpes simplex (VHS, generalmente el VHS tipo 2, VHS2) se produce a partir del virus presente en las lesiones cérvicovaginales características del herpes genital recurrente, producto de la recrudescencia del VHS latente en los ganglios sensoriales que inervan la mucosa genital. Así, sólo existirá riesgo de transmisión cuando la mujer experimenta la infección recurrente en los días previos al parto. En el caso del CMV, cuyos mecanismos de latencia y recurrencia nos son casi desconocidos, la infección congénita y neonatal ligada a infección recurrente se produce con frecuencia, aunque la mayoría de las veces carece de consecuencias importantes para la salud del neonato. No es posible precisar, en estos casos, cual es la fuente de virus ni identificar factores de riesgo para la transmisión ó la aparición de problemas importantes en el neonato. Por el momento, tampoco es posible predecir cuando una mujer embarazada seropositiva para estos herpesvirus va a experimentar una recurrencia de la infección latente. De acuerdo a este esquema, cada modalidad de transmisión plantea estrategias de prevención distintas y criterios diferentes para realizar el control serológico: 1. Las infecciones del primer grupo requerirán la detección de las mujeres susceptibles a la primoinfección (mujeres seronegativas para anticuerpos especificos) y la adopción de medidas que prevengan el contacto con el agente durante la gestación. Cuando sea posible, se procederá a la inmunización activa de la mujer, una vez finalizado el embarazo, con objeto de prevenir la infección en embarazos sucesivos. 2. Las infecciones del segundo grupo requerirán la detección de las mujeres persistentemente infectadas, utilizando los marcadores serológicos más adecuados a este fin, en cada caso. Las medidas a adoptar para prevenir la transmisión ó paliar sus consecuencias serán, también, específicas para cada agente. 3. Para prevenir las infecciones del tercer grupo, será necesario identificar a las mujeres que experimenten la recurrencia en el momento y lugar anatómico que supongan riesgo de transmisión. En el caso del VHS2, habrá que buscar presencia de virus en mucosa cervico-vaginal en los días inmediatos al parto, por lo que este control

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quedaría fuera del ámbito de la serología. En el caso del CMV, no es posible aún definir ninguna estratégia de prevención que pueda ser eficaz. Sí es importante decir que la detección de anticuerpos frente a estos dos virus no puede ofrecer ningún dato útil de cara a la prevención de infecciones asociadas a recurrencia. Sólo la detección de anticuerpos específicos frente al VHS2 podría ayudar a seleccionar a las mujeres embarazadas en las que un control de excrección de virus por via genital podria ser más eficaz, pero, por el momento, las técnicas serológicas disponibles no permiten realizar esta determinación en condiciones técnicas mínimamente adecuadas. B.2.- Agentes a incluir ó excluir en el control serológico de la embarazada normal En base a estas consideraciones, pensamos que es recomendable incluir en el control serológico de la embarazada los siguientes agentes: virus de la rubeola, Toxoplasma gondii, VHB, Treponema pallidum y VIH. Los cuatro primeros se investigarían rutinariamente en todas las mujeres embarazadas. Al tratar cada agente en concreto, se justificará y matizará más ampliamente su inclusión. Consideramos que la investigación de anticuerpos frente a CMV no es capaz de ofrecer datos útiles para la prevención y control de la transmisión vertical de dicho agente. Ya se ha razonado su irrelevancia en el caso de las infecciones recurrentes. De cara a las primoinfecciones, pensamos que la detección de mujeres seronegativas no ayudaria significativamente a evitar la transmisión vertical del agente, ya que: 1. El CMV es un agente ubicuo, endémico en la población y de alta prevalencia, cuyos mecanismos de transmision son múltiples y aún no bien conocidos. No es posible, por tanto, definir factores ó situaciones de riesgo que ayuden a establecer medidas preventivas de tipo higiénico-sanitario minimamente eficaces para las mujeres seronegativas. 2. Más del 50% de la población alberga la infección latente y excreta el virus con frecuencia en ausencia de sintomatología. Es, por tanto, imposible identificar eficazmente las posibles fuentes de infección en el entorno de la mujer embarazada seronegativa. 3. No se ha desarrollado aún ninguna vacuna eficaz para inmunizar contra la infección a las mujeres seronegativas

identificadas. Así mismo, no se incluyen en la lista de agentes recomendados el virus varicela-zóster (VVZ) y el virus de la Hepatitis C (VHC), en base a las signientes razones: a. La infección congénita por VVZ se ha documentado sólo en casos excepcionales. Los casos de transmisión neonatal se asocian siempre a infecciones sintomáticas en la embarazada y se tratan con éxito mediante terapia combinada de antivirales y gamma-globulina. En tanto no exista una vacuna recomendable para población general (la actual no se reconoce así), la estrategia debe basarse en diagnosticar los casos de varicela en embarazadas a término y aplicar la terapia neonatal adecuada. b. La transmisión vertical del VHC no ha sido aún totalmente aclarada. No se ha demostrado que la infección neonatal suponga un riesgo añadido de cronificación ni existe ninguna terapia que, a semejanza de la hepatitis B, prevenga la cronificación de la infección en el neonato. No existe, además, ningún método de laboratorio capaz de demostrar ó excluir claramente la infección crónica en los individuos seropositivos. Por último, se excluye también de la lista la Listeria monocytogenes, por entenderse que las determinaciones de anticuerpos frente a este microorganismo en las mujeres embarazadas sanas, aún cuando se ha venido realizando rutinariamente en algunos laboratorios, no conducen a ninguna conclusión útil para prevenir su transmisión. B.3.- Aproximaciones de laboratorio al control serológico de la embarazada Aunque cada agente presenta una problemática de laboratorio específica a la hora de realizar el control serológico de la embarazada, existen algunas consideraciones generales que, en función del tipo de información que se desee obtener, son comunes a distintos agentes y merecen ser comentadas aquí. Estas consideraciones son la base de la selección de marcadores serológicos y técnicas de laboratorio que se ha realizado para cada agente en concreto. 1. La actividad que analizamos es una actividad a desarrollar por laboratorios poco especializados. Las técnicas a aplicar deben ser, por tanto, sencillas y rápidas, no deben requerir instrumentación compleja para su realización ó lectura y deben ofrecer un resultado claro, fácil de interpretar y ajustado a la información

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que se desea obtener. Al mismo tiempo, deben satisfacer unos criterios de calidad mínimos a un costo reducido. 2. En la mayoría de los casos, un resultado cualitativo (positivo/negativo) va a ser suficiente para extraer la información que se necesita. La obtención de resultados cuantitativos puede dar lugar a mas errores, tanto en la própia obtención del resultado como en su interpretación, y suele requerir mayor complejidad técnica y presentar mayor costo, sin ofrecer ninguna información adicional de interés. 3. Algunos de los resultados que se obtengan en esta actividad pueden requerir la realización de pruebas adicionales de confirmación y, en ocasiones, una nueva extracción de muestra. Estas pruebas van a ser, en general, de mayor complejidad de realización e interpretación que las técnicas rutinarias básicas. El laboratorio primario debe contar con el apoyo de su Hospital de Area para resolver estos casos. B.4.- ¿Cuándo realizar el control serológico? Desde un punto de vista teórico, la prevención de la transmisión vertical de agentes infecciosos se alcanzaría con mayor eficacia si se determinara la situación concreta de cada mujer en edad fértil en relación a estos agentes antes de que se iniciara la gestación. La inmunización activa ó la aplicación de terapias especificas para eliminar la infección antes del embarazo facilitarían enormemente la prevención. Las dificultades prácticas que se plantean a la hora de acceder a la población a controlar no permiten, sin embargo, establecer esta pauta como rutinaria, aunque se recomienda seguirla siempre que sea posible. La primera visita de la embarazada a la consulta de Tocología se considera el momento más adecuado para la toma de muestra para estudio serológico de su situación respecto a los agentes considerados. La realización de estudios seriados sobre muestras tomadas en distintos momentos del embarazo no se considera de utilidad, en términos generales, y debe reservarse a situaciones muy concretas. B.5.Infecciones no reconocibles mediante métodos serológicos: herpes simplex y estreptococo B Coma ya se ha comentado antes, la infección neonatal por virus herpes simplex viene determinada por la recurrencia del virus en la mucosa cervical ó

vaginal de la mujer embarazada en los días que preceden al parto, y suele tener consecuencias muy importantes para la salud del recién nacido. La infección se previene eficazmente evitando el parto vaginal cuando la mujer presenta esta situación, mediante extracción del niño por cesarea antes de que se produzca la rotura de membranas. La detección de las mujeres en riesgo se realiza mediante detección de virus (aislamiento, shell vial ó detección directa de antígeno) en exudado cervical, en dos muestras tomadas a lo largo de las últimas cuatro semanas del embarazo: la primera, dentro de las dos primeras semanas y la segunda, lo más próxima posible al parto. En cualquier caso, se realizara inspección visual de la mucosa genital, buscando lesiones caracteristicas, en el momento del parto. La infección por VHS2 tiene una muy baja prevalencia en España, y el herpes genital recurrente es mucho menos frecuente en nuestro pais de lo descrito en otros paises occidentales. Por ello, se puede realizar una selección de las mujeres a controlar, en base a los siguientes criterios: 1. Antecedente conocido de herpes genital; 2. Antecedente conocido de infecciones genitales múltiples; 3. Seropositividad contrastada para anticuerpos específicos frente al VHS2, con tadas las reservas expresadas ariteriormente sobre la validez de los métodos de detección disponibles en la actualidad. Se ha demostrado que la administración intraparto de ampicilina intravenosa (2 g. iniciales y 2 g. cada 4-6 horas hasta el momento de dar a luz) es eficaz para prevenir la sepsis neonatal por estreptococo B. Existen dos métodos para seleccionar las mujeres en riesgo en las que se debe aplicar este tratamiento: 1. Realizar cultivos vaginales en todas las mujeres embarazadas durante el tercer trimestre de la gestación, para identificar a las portadoras. 2. Prescindir del cultivo y suministrar el tratamiento a las mujeres que presenten uno ó más de los siguientes factores de riesgo: a. Parto pretérmino (18 h.); c. Fiebre intraparto; d. Gestación múltiple; e. Antecedente de infección neonatal por estreptococo B en parto previo. En las condiciones actuates, pensamos que la aplicación de métodos de detección de VHS y estreptococo B a todas las mujeres embarazadas no es una rutina planteable a

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nivel general. Parece, sin embargo, muy recomendable aplicar los criterios de selección mencionados aquí y esforzarse en actuar sobre las mujeres en riesgo. Este proceder supondría, a buen seguro, una reducción significativa en la incidencia de estas infecciones neonatales.

C. OBJETIVOS DEL CONTROL SEROLOGICO DE LA EMBARAZADA El objetivo que persigue esta actividad es prevenir las consecuencias para la salud que se derivan de la transmisión vertical de ciertos agentes infecciosos. Dicha prevención se basa en dos puntos principales: 1. Detección de mujeres embarazadas susceptibles de sufrir infección aguda por algunos de estos agentes, al objeto de adoptar las medidas adecuadas para prevenir tal infección durante ese embarazo, así como, cuando ello sea posible, durante futuros embarazos. 2. Detección de mujeres embarazadas que sufren una infección persistente ó crónica por un agente capaz de transmitirse al feto ó al neonato, con el fin de adoptar medidas que prevengan la transmisión y/ó terapias específicas que eliminen o reduzcan el riesgo de que la infección tenga consecuencias graves para la salud del recién nacido. Es importante resaltar aquí que el diseño de esta actividad debe ajustarse lo mejor posible a los dos objetivos mencionados, sin pretender en ningún momento resolver con una estrategia de cribado rutinario problemas que se asocian a situaciones concretas en casos individuales. Así, el diagnóstico etiológico de infecciones agudas durante el embarazo requiere un planteamiento técnico absolutamente distinto, debe basarse en criterios de estudio e interpretación de resultados totalmente diferentes y no debe mezclarse nunca con la actividad que es objeto de este documento. Sólo para alguno de los agentes que se tratarán a continuación, que producen con alguna frecuencia infecciones agudas asintomáticas con alto riesgo de transmisión vertical, los resultados que se obtengan en el control serológico rutinario podrán tomarse como base para plantear estudios adicionales de diagnóstico etiológico de posible infección aguda en casos muy seleccionados; aún así, los resultados que se obtengan en estos estudios adicionales rara vez seran concluyentes. Olvidar esta idea sólo genera inseguridad en la

interpretación de resultados, incertidumbre y angustia en las pacientes, problemas con la tecnología y gasto innecesario. Los métodos de laboratorio para detección de anticuerpos y antígenos específicos en suero presentan la suficiente sencillez y uniformidad como para llevar esta actividad preventiva a la población general de embarazadas, si bien no cubren todos los problemas relacionados con la transmisión vertical de agentes infecciosos. En el presente documento, nos limitaremos a analizar los problemas abordables desde el campo de la serología, dejando a un lado aquéllos que requieren otras aproximaciones técnicas que consideramos difícilmente asumibles para la mayoría de los centros de asistencia primaria.

D. GENERALES

RECOMENDACIONES

D.1.- VIRUS BE LA RUBEOLA La prevalencia de anticuerpos anti-rubeola en la población española de mujeres adultas se sitúa, en general, por encima del 90%, alcanzando hasta el 98% en algunas áreas geográficas. La inmunización frente al virus de la rubeola, incluida en el programa de vacunaciones de la OMS, tiene por objeto la erradicación de la Rubeola Congénita a nivel mundial, en base a la protección individual de las futuras gestantes y a la limitación de la circulación del virus como factor de protección para las mujeres seronegativas, no vacunadas ó que experimentaron fracaso vacunal. Aunque esta actuación bastaría, en sí misma, para prevenir los casos de rubeola congénita, sin necesidad de actuar individualmente sobre las mujeres embarazadas, existen razones que aconsejan continuar, al menos temporalmente, con el control rutinario de anticuerpos anti-rubeola en las mujeres embarazadas en España: 1. La vacunación frente a rubeola no se introduce en España en forma sistemática hasta 1980, y hasta 1985 no se alcanza una cobertura vacunal superior al 80%. Una parte todavía importante de las mujeres españolas en edad fértil no han sido vacunadas nunca frente a la rubeola. 2. Con una cobertura vacunal teórica (dosis de vacuna triple vírica repartidas ó vendidas) del 97% en 1989, La reducción estimada de casos de rubeola en ese año fue del 82% con respecto a 1982. A nivel estatal, la rubeola sigue, sin embargo, presentando su típico patrón estacional de circulación. Además, en algunas Comunidades Autónomas se han regisirado

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brotes epidémicos que, tras un período de drástica reducción, han restaurado tasas de incidencia superiores a la registrada en 1982 (Galicla, 1990). No hay, por tanto, evidencia de que la limitación en la circulación del virus sea suficiente como para proteger eficazmente a las mujeres seronegativas en edad fértil. 3. Al no existir un Registro Nacional de Casos de Rubeola Congenita, similar al establecido hace casí dos décadas en Estados Unidos ó el Reino Unido, no se puede disponer de una valoración directa de la repercusión del prograrna de vacunación sobre la enfermedad que se pretende controlar. La pauta recomendada para el control de anticuerpos anti-rubeola en mujeres embarazadas es la determinación cualitativa de anticuerpos totales ó IgG específica en suero tomado en la primera consulta. Se desaconseja expresamente la evaluación cuantitativa de resultados, ya que no proporciona ninguna información útil. La presencia de anticuerpos (cualquiera que sea su concentración) refleja contacto previo con el virus y por tanto, inmunidad a la reinfección haciendo innecesaria la realización de nuevos controles en embarazos sucesivos. Caso de utilizarse métodos cuantitativos es importante resaltar que, en una mujer sana, un título superior a la media "normal" no debe tomarse en absoluto como indicador de sospecha de infección aguda asintomática, que es un hecho extremadamente infrecuente en adultos. Las mujeres seronegativas deberán evitar, en lo posible, durante el embarazo la convivencia estrecha con niños no vacunados ó que sufran una enfermedad exantemática aguda, especialmente cuando se produzca en el propio hogar y en las épocas del año en que suele aumentar la circulación del virus (Abril-Junio). Cuando la mujer tenga, por su profesión, contacto diario con niños, se debe considerar La concesión de baja laboral como medida de protección, en función del riesgo. En relación a este problema, sería muy deseable la realización de pruebas de detección de anticuerpos y vacunación de seronegativas en todas las mujeres que vayan a iniciar cualquier actividad laboral que entrañe riesgo en un posterior embarazo, se desaconseja la utilización de gamma-globulinas, ya que, en caso de infección, deprimen el cuadro clínico pero no previenen eficazmente la viremia, por lo que la infección puede pasar desapercibida

al médico sin que el feto quede adecuadamente protegido. En ausencia de sintomatología clínica compatible con rubeola aguda durante el resto de la gestación, no se rocomienda realizar determinaciones de anticuerpos adicionales. La mujer seronegativa debe ser vacunada frente a rubeola en el postparto inmediato, ya que la administración de la vacuna esta contraindicada durante la gestación. Se recomienda que la mujer sea vacunada durante su estancia en el hospital, tomando medidas para evitar un nuevo embarazo en los tres meses sigujentes a la inmunización. Los métodos de aglutinación de partículas de latex recubiertas con antígenos del virus resultan muy adecuados para el trabajo rutinario. Para la selección del método, hay que basarse en evaluaciones técnicas que demuestren una sensibilidad suficiente y una escasa tendencia a los fenómenos de prozona, que pueden producirse en muestras con alta concentración de anticuerpos y requerirían el estudio por dilución de todas las muestras negativas. Los métodos automatizados ó semiautomatizados de enzimoinmunoanálisis (EIA), fluorinmunoanálisis (FIA) y enzimoinmunofluorometría (ELFIA) son adecuados para laboratorios que manejen números elevados de muestras/día. Los resultados cuantitativos que ofrecen algunas de estas técnicas sobre dilución única de muestra no suelen correlacionar bien entre sí y no deben ser considerados a ningún efecto. Desde un punto de vista teórico, la determinación de anticuerpos frente a rubeola debería realizarse antes de que se produzca el embarazo, lo que permitiría vacunar a las mujeres susceptibles antes de la gestación. Siendo conscientes de las dificultades prácticas que esto implica, recomendamos se siga esta paula cuando sea posible. Por último, una evaluación fiable de las campañas de vacunación y de su repercusión en la epidemiología de la rubeola congénita permitirá revisar en el futuro las pautas planteadas en estas recomendaciones y, eventualmente, eliminar la detección de anticuerpos antirubeola como prueba rutinaria en la embarazada normal, cuando la situación así lo aconseje. D.2- Toxoplasma gondii La prevalencia de marcadores serológicos de infección previa por T. gondii en la población española de mujeres en edad fértil se estima en torno al 50%.

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Aunque la persistencia de este parasito en tejido muscular está suficientemente documentada, así como su recurrencia en condiciones de inmunodepresión, sólo la primoinfección ha podido ser asociada claramente a transmisión vertical seguida de problemas de salud en el neonato. Aunque no se puede descartar que las recurrencias puedan jugar algún papel menor, pensamos que, a efectos prácticos, la actuación sanitaria sobre la población general de embarazadas debe centrarse en la prevención de las primoinfecciones en las mujeres seronegativas. El estudio serológico de anticuerpos contra T. gondii durante el embarazo está ampliamente extendido en España, pero, en nuestra opinión, la ausencia de una definición clara del objetivo a alcanzar, y de criterios claros de interpretación de resultados en función de dicho objetivo, hace que esta actividad rutinaria esté creando más problemas que beneficios. En la situación actual, el cribado de anticuerpos frente a T. gondii carece de algunos de los requisitos fundamentales exigibles a este tipo de actividades: no conocemos la tasa de infección en la población de gestantes; no están totalmente aclarados los mecanismos de transmisión en el hombre; en muchas ocasiones, no es posible identificar con precisión el momento de la infección primaria aguda, ya que la IgM específica puede ser detectable en suero durante meses, e incluso años, después de la misma, sin que existan marcadores alternativos que hayan demostrado ser eficaces para el diagnóstico diferencial. En caso de infección aguda confirmada, la propia evaluación de riesgos para el feto (que varia entre el 10 y el 70%, según las series) es muy problemática. El estudio de sangre fetal obtenida por cordocentesis no suele ser definitivo y supone un riesgo de pérdida fetal entre el 12%. En último extremo, la confirmación de la infección en el feto ha de hacerse por técnicas no accesibles al laboratorio primario (aislamiento en ratones ó cultivos celulares, amplificación de ADN mediante PCR), y solamente podría plantearse la interrupción voluntaria del embarazo si se detectaran anormalidades fetales por ecografía ó si se pudiera asegurar que la infección se produjo en los primeros estadios de la gestación. Por ultimo, nunca se ha demostrado satisfactoriamente, mediante un estudio controlado, que el tratamiento especifico en la mujer gestante

prevenga con eficacia los problemas asociados a la infección fetal. No obstante, aceptamos que la situación socio-sanitaria actual no hace posible recomendar la suspensión de esta actividad, planteamiento que está siendo seriamente considerado en algunos paises de nuestro entorno. No siendo posible, en la práctica, plantear la prueba antes de la gestación, recomendamos realizar detección cualitativa de IgG específica (EIA indirecto, IFI, látex) en la primera consulta y considerar cualquier resultado positivo que se obtenga en una mujer asintomática como evidencia de infección anterior al embarazo y, por tanto, de ausencia de riesgo de infección primaria aguda en este y en sucesivos embarazos. Se desaconseja expresamente informar por parte del laboratorio del título de IgG frente a T. gondii, ya que no proporciona ninguna base sóIida para tomar decisiones útiles y acertadas. Aunque la falta de información clínica sobre las pacientes puede comprometer en ocasiones al laboratorio, obligando a realizar la determinación de anticuerpos IgM, la dificultad de la interpretación de este dato y la sobrecarga de trabajo y costes que supone su obtención hacen desaconsejable esta práctica. Por ello, se recomienda exigir los datos clínicos necesarios y realizar la determinación de IgM especifica sólo cuando dichos datos así la aconsejen. En las mujeres seronegativas, se recomendarán medidas higiénico-sanitarias preventivas, tales como evitar el contacto con gatos, no comer carnes poco cocinadas, lavar las verduras y frutas y utilizar guantes en el manejo de gatos y para realizar trabajos de jardinerfa. Si en las sucesivas consultas se pudieran documentar sintomas ó signos compatibles con toxoplasmosis aguda, el caso será referido al Hospital de Area para realizar los pertinentes estudios de diagnóstico etiológico. Es posible que en un futuro cercano otras técnicas diagnósticas aporten nuevas ventajas al objetivo del control serológico de la toxoplasmosis en la embarazada. D.3- Virus de la Hepatitis B Actualmente, el estudio sistemático para presencia de antigeno de superficie del virus de la Hepatitis B (HBsAg) en suero está ampliamente aceptado como prueba rutinaria en la mujer embarazada, ya que la inmunoprofilaxis del recién nacido en casos de madres portadoras crónicas es muy

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eficaz en la prevención de la infección crónica neonatal. La doterminación de este único marcador sorológico se considera suficiente a efectos de cribado, siempre que se utilicen métodos de EIA con sensibilidad analítica inferior a 1 ng/ml. Los métodos de aglutinación de latex pueden ser hasta 100 veces menos sensibles, por lo quo sólo deben utilizarse en caso de que sea imposible realizar pruebas de EIA. Por razones de operatividad, se recomienda realizar la prueba sobre suero tomado en la primera consulta, aunque pueda argumentarse que, idealmente, deba realizarse durante el último trimestre de la gestación, lo más cerca posible del momento del parto. Sólo en las mujeres que presenten prácticas de alto riesgo (especialmente en las pacientes ADVP) se repetirá la prueba en el últirno trimestre de la gestación si el control inicial fue negativo. En caso de nuevo resultado negativo, se planteará la vacunación de estas mujeres una vez finalizada la gestación, si bien los datos actuales indican que no hay porqué tomar el embarazo como una contraindicación de la vacuna. Ante un resultado positivo, recomendamos realizar una nueva extracción y enviar la muestra al Hospital de Area para confirmar la existencia de infección crónica. En los casos confirmados, se procederá al tratarniento del recién nacido con vacuna y gamma-globulina específica, según las dosis recomendadas, en las primeras doce horas de vida. Aún cuando se impusiera la vacunación universal de recién nacidos frente a la hepatitis B con objeto de erradicar la enfermedad, la necesidad de realizar un tratamiento específico distinto en los niños nacidos de madres ponedoras exigirá no interrumpir el cribado rutinario de HBsAg en las mujeres embarazadas. Sólo un cambio profundo en la situación epidemiológica de esta infección, que en la actualidad presenta una incidencia de infección crónica entre el 0.5 y el 2% en población general en nuestro país, permitirá una eventual interrupción de esta actividad preventiva. D.4.- Treponema pallidum A pesar de la baja incidencia de esta infección en las gestanres de nuestro medio (menor, normalmente, del 0.5%), recomendamos su detección en base a la eficacia del tratamiento, la sencillez de ejecución y su bajo coste. Es conveniente realizar una prueba no treponémica en la primera consulta de la embarazada, siendo el RPR la mas utilizada en la

actualidad. Ante un resultado positivo, se ha de cuantificar y confirmar mediante una prueba treponémica (TPHA, FTA, etc). Si se confirma la infección por T. pallidum, se recomienda tratar el caso como una lúes secundaria, salvo si la embarazada es, ademas, seropositiva para VIH, situación en la que se precisa un abordaje diagnóstico y terapéutico más agresivo. Se aconseja realizar un seguimiento mensual ó bimensual hasta el final del embarazo para comprobar que no se produzcan aumentos en el título de RPR. Se recomienda, asi mismo, la vigilancia serológica del neonato. En caso de que la paciente sea seropositiva frente al VIH, se recomienda tratar siempre al recién nacido. D.5.- Virus de Ia Inmunodeficiencia Humana La transmisión vertical es una vía claramente establecida de transmisión del VIM. La recomendación más ampliamente aceptada es realizar determinación de anticuerpos en la mujer gestante cuando existan prácticas de riesgo. Sin embargo, los datos recientes demuestran que la identificación de la embarazada con prácticas de riesgo, presentes ó pasadas, puede fallar, bien porque ésta no se identifica como adicta a drogas por via parenteral ó no es consciente del riesgo de la transmisión heterosexual por contactos sexuales previos con individuos seropositivos. Por ello, puede ser conveniente ofrecer esta prueba en el control serológico de la gestación. Es importante que esta oferta se acompañe del consentimiento informado de la embarazada y de una adecuada información sobre la transmisión del virus. La implantación definitiva de este cribado serológico en un Area de Salud debiera precederse de un estudio tipo prueba anónima no relacionada u otro que informe de la seroprevalencia existente, ya que en muchas zonas de nuestro país tal implantación no va a ser, probablemente, necesaria. El estudio se realizará mediante métodos de EIA ó mediante métodos rápidos (dot-EIA, etc), aplicando una técnica deconfirmación (Western-blot ó similar) a las muestras reactivas. Las pruebas se realizarán en muestra de suero tomada en la primera consulta de la embarazada. Dada la trascendencia de un informe positivo, se recomienda verificar los resultados en una segunda extracción, enviando la muestra al Hospital de Area para confirmación unicamente en aquellas pacientes seronegativas que presenten prácticas de

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riesgo persistentes se repetirá periódicamente la determinación, teniendo siempre en cuenta que se ha descrito transmisión en casos que presentaban resultados indeterminados en Western-blot. E.- RESUMEN DE RECOMENDACIONES Primera visita a la consulta de Tocología/Medicina General 1.- Historia clínica y exploración física Incidir sobre antecedentes de: - Enfermedad febril ó exantemática reciente - Hepatitis aguda ó crónica - Herpes genital - Infecciones genitales múltiples - Contacto estrecho reciente con pacientes con enfermedad exantemática - Contacto profesional con niños - Vacunación previa frente a rubeola y hepatitis B - Determinación previa de anticuerpos frente a rubeola y Toxoplasma gondii - Prácticas de riesgo para la infección por VIH Descartar presencia de: - Exantema, con ó sin fiebre - Adenopatías (cualquier localización) - Lesiones compatibles con herpes genital - Lesiones compatibles con sífilis (cualquier estadio) 2.- Determinaciones analíticas - Determinación cualitativa de anticuerpos (IgG) frente a rubeola y Toxoplasma gondii para identificación de seronegativas. - Determinación cualitativa de antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (HBsAg). - Determinación cualitativa de anticuerpos frente a antígenos no treponémicos relacionados con el Treponema pallidum. - Cuando se conozca ó se sospeche la existencia de prácticas de riesgo para adquisición de la infección por VIH, se ofrecerá a la paciente la determinación cualitativa de anticuerpos frente al VIH. 3.- Actuaciones Rubeola a. Un resultado positivo se tomará como prueba de inmunidad a la reinfección y evidencia suficiente de protección para el feto. b. Vacunación post-parto en mujeres seronegativas. c. Se prescindirá de esta determinación cuando la mujer documente una determinación positiva previa. Toxoplasmosis

a. Un resultado positivo se tomará como prueba de inmunidad a la reinfección y evidencia suficiente de protección para el feto. b. Se prescindirá de esta determinación cuando la mujer documente una determinación positiva previa Hepatitis B a. Un resultado negarivo se interpretará como excluyente de infección aguda ó crónica por VHB. b. Las mujeres que presenten reactividad en la prueba se citarán para nueva extracción, enviándose la muestra para confirmación al Hospital de Area o de referencia. Confirmada la positividad del HBsAg, debe completarse el resto de los marcadores y realizar el estudio clínico oportuno y de búsqueda de contactos susceptibles de ser vacunados. Sífilis a. Las muestras reactivas se someterán a estudio de anticuerpos frente a antígenos treponémicos. b. En caso de positividad confirmada, se aplicará la terapia especifica recomendada y el estudio de contactos. VIH a. Las mujeres que presenten positividad en la prueba se citarán para nueva extracción, enviandose una muestra para confirmación al Hospital de Area o al Laboratorio de Referencia. De confirmarse, se realizará el estudio y manejo clínico pertinente. b. La posible ampliación del estudio serológico frente al VIH a toda la población embarazada procedente de un Area Sanitaria concreta debiera precederse de un estudio de seroprevalencia de VIH en dicha población, así como del consentimiento informado de cada embarazada. Revisiones de la gestante Cuando exista por la historia clínica y/o la exploración física la posibilidad de una infección primaria aguda reciente por virus de la rubeola ó Toxoplasma gondii en mujeres previamente seronegativas, se enviará resumen de historia y muestras adecuadas al Hospital de Area, solicitando estudio de diagnóstico etiológico en relación al (los) agente(s) sospechado(s). De forma similar se procederá ante la sospecha de herpes genital, hepatitis aguda o sífilis activa.

F.- BIBLIOGRAFIA SELECCIONADA 1. Hanshaw JB, Dudgeon JA, Marshall WC . Viral diseases of the fetus and newborn. WB Saunders Co. Philadelphia, 1985.

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2. Echevarría C, Echevarría JM, Anda P, Rodriguez NI, Pérez Breña P, de Carlos S, de Ory F, León P, Nájera R. Infecciones congenitas y perinatales pot agentes viricos, Toxoplasma gondii y Treponetna pallidum. Estudio de 2.000 casos y análisis de 488 casos positivos. Med Cm 1987; 88:129-134. 3. Mateo JR, Sever JL. Perinatally acquired infections and screening. Curr Opin Obstet Gynaecol 1990; 2:662-667. 4. Prenatal screening for toxoplasmosis in the UK. Report of a Multidisciplinary Working Group. Royal College of Obstetricians and Gynaecologists 1992, ISBN o 902331 56 6. 5. Holliman RE, Johnson JD, Constantine C et at.. Dubculties in the diagnosis of congenital toxoplasmosis by cordocentesis. Br I Obstet Gynaecol 1991; 98:832- 834. 6. Lappalainen M, Koskela P, Hedman K, Teramo K, Ammala P, Hii[esmaaV, Koskiniemi M. Incidence of primary toxoplasma infections during pregnancy in Southern Finland: a prospective cohort study. Scand J Infect Dis 1992; 24:97-104. 7. Kumar ML, Dawson NV, McCullough AJ ci at.. Should all pregnant women be screened for Hepatitis B. Ann Intern Med 1987; 197:273-277.

8. Hoofangle IR. Towards universal vaccination against Hepatitis B virus. New Engi J Med 1989; 321:3333-1334. 9. Soulie JC, Larsen NI, Goudeau A et at.. The perinatal transmission of Hepatitis B virus in the Paris area. Ann Pediatr 1991; 38:595-601. 10. Musher D. Evaluation and management of an asymptomatic patient with a positive VDRL reaction. En: Remington IS, Schwartz MN eds. Current Clinical Topics in Infectious Diseases, 9:147-157. McGraw & Hill. New York, 1988. 11. Bindels PJ, Posima MI, Peerbooms PG et al.. Benefit of the serological screening program for siphilis in pregnant women in Amsterdam in the period 1985-1989. Ned Tijdschr Geneeskd 1991; 135: 1319 -1322. 12. Plan Nacional sobre SIDA. Criterios que deben presi-dir Ia detección de marcadores serológicos de Ia infección por VIH. Ministeno de Sanidad y Consumo. 1992. 13. Goldberg DJ, MacKinnon H, Smith R e al. Prevalence of MfV among childbearing women and women having termination of pregnancy: multidisciplinary steering group study. Brit Med j 1992; 304:1082-1089. 14. Barharacci M, Repke IT. Chaisson RE. Routine prenatat screening for HIV infection. Lancet 1991; 337: 709711.

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Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: Antonio Fuertes Ortiz de Urbina

Ignacio Calicó Bosch José M. Echevarría Mayo Carlos Lumbreras Bermejo F. Fernández de Ory José J. Rodríguez Otero

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INDICE Introducción. Objetivos. Agentes implicados. Evaluación en el pretrasplante. Pautas referentes al Donante. 1.Rutina microbiológica. 2.Rutina serológica. Pautas referentes al receptor. 1.Rutina serológica. Técnicas serológicas recomendadas e interpretación. Virus de la Hepatitis B. Técnicas recomendadas. Virus de la Hepatitis C. Técnicas recomendadas. Virus de la Inmunodeficiencia Humana Técnicas recomendadas. Citomegalovirus. Técnicas recomendadas. Virus Varicela-Zoster. Técnicas recomendadas. Virus Herpes simplex y Epstein-Barr. Toxoplasma gondii. Evaluación en el post-trasplante. Control del trasplantado sin evidencia de infección. Control del trasplantado con evidencia de infección.

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5. MICROBIOLOGÍA DEL TRASPLANTE 1993 INTRODUCCION En los últimos años el trasplante de órganos ha adquirido gran impulso en nuestro país, hasta el punto de que España es el primer estado del mundo en cuanto a índice de donaciones y también el primero en orden de trasplantes renales y hepáticos realizados por cada millón de habitantes Una vez superados tos grandes problemas técnicos del procedimiento quirúrgico, la experiencia ha demostrado que las amenazas más importantes de las que depende el éxito del trasplante son el rechazo y la infección. Además, también sabemos que se trata de problemas interrelacionados, de tal manera que la terapia inmunosupresora anti-rechazo favorece la aparición de infección y algunas infecciones potencian a su vez el rechazo. En general, puede afirmarse que no menos del 75% de los receptores de trasplante sufre complicaciones infecciosas que comprometen de algún modo el éxito del procedimiento e incluso la propia vida, por 10 que parece claro que los laboratorios de Microbiología pueden y deben desempeñar un papel decisivo en una situación en la que la infección desempeña un papel tan primordial.

OBJETIVOS La metodología aquí expuesta pretende ser una normativa básica sobre la conducta técnica correcta de los Laboratorios de Microbiología clínica en casos de trasplante. Los laboratorios de Hospitales en los que esta previsto iniciar un programa de este tipo podrán encontrar en esta guía una orientación razonablemente detallada sobre los ensayos -cuales y cuándo realizarlosmas apropiados para cada situación, y los que ya tienen experiencia previa pueden considerar la conveniencia de modificar sus protocolos para adaptarlos en lo posible a lo aquí descrito así cómo aportar dicha experiencia de cara a futuras modificaciones de la misma. Es obvio que se trata de unas normas orientativas, que evitan la mención expresa de marcas comerciales y que no pretende de ningún modo imponer la realización de determinados ensayos. Sin embargo, la opinión de la Comisión elaboradora es que lo que sigue es lo que un laboratorio debería intentar hacer si el Hospital decide embarcarse en un programa de

trasplante de órganos. Creemos que, si no se consigue capacitación suficiente para realizar las técnicas que se exponen a continuación (u otras similares), quizás fuera necesario plantearse la conveniencia de no realizar trasplantes, o, al menos, debería existir una conciencia clara de los riesgos médicos, éticos, e incluso legales en que se puede incurrir haciéndolos a pesar de todo.

AGENTES IMPLICADOS El tratamiento inmunosupresor necesario para evitar el rechazo del órgano trasplantado produce, como efecto desfavorable, una mayor predisposición a la infección. De hecho la intensidad del tratamiento inmunosupresor es un factor de riesgo fundamental en el desarrollo de complicaciones infecciosas. Además de la intensidad, la duración de la terapia inmunosupresora es la clave en la frecuencia y tipo de las complicaciones infecciosas en este grupo de enfermos. Aunque potencialmente cualquier microorganismo puede producir una infección en un paciente trasplantado, existe un grupo de patógenos que son responsables de la mayor parte de ellas y que son, por tanto, hacia los que deben ir dirigidos los métodos diagnósticos del Laboratorio de Microbiología. Durante las 3-4 primeras semanas tras la cirugía las infecciones en el paciente trasplantado están producidas en general por bacterias "hospitalarias" (Staphylococcus, Pseudomonas, Enterobacterias y Enterococcus fundamentalmente), cuyo patrón de resistencia a los antibióticos puede presentar variaciones importantes entre los diferentes centros. El inicio de estas infecciones suele provenir de la contaminación microbiana de los catéteres, de la infección de la herida quirúrgica, o aparato respiratorio (neumonía, especialmente en aquellos pacientes que requieren ventilación mecánica prolongada o en receptores de trasplante de pulmón) y, dependiendo del tipo de trasplante, de infecciones urinarias (trasplante de riñón), mediastinitis (trasplante de corazón o pulmón), abscesos intraabdominales (trasplante de hígado y/o páncreas) etc. Con menor frecuencia, pero con una mortalidad importante también pueden presentarse durante este período inicial infecciones

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fúngicas profundas, generalmente por Candida y Aspergillus, cómo cabe esperar en pacientes que necesitan dosis importantes de inmunosupresores o antibióticos de amplio espectro durante los primeros días después del trasplante. De las escasas infecciones virales que se producen en estas primeras semanas, la que tiene más relevancia clínica Es la producida par el virus Herpes simplex (VHS). Desde el final del primer mes y hasta aproximadamente el sexto, la intensidad de la inmunosupresión alcanza su máximo (por supuesto el nivel variará dependiendo de cada enfermo) y los pacientes están en riesgo de padecer infecciones típicamente producidas por patógenos "oportunistas". Entre ellos hay que destacar Citomegalovirus (CMV), Pneumocystis carinii, bacterias como Nocardia, Listeria y Mycobacterium y hongos como Aspergillus, Candida y Cryptococcus. El pronóstico de estas infecciones dependerá de un diagnóstico y tratamiento precoz, y en alguna de ellas, CMV y virus de Epstein y Barr (VEB), de la inmunidad o no del donante/receptor antes del trasplante. Aproximadamente después del sexto mes las infecciones esperables en el paciente trasplantado se parecen mucho a las del paciente normal. DC todas formas en este periodo también pueden manifestarse clínicamente secuelas de algunas infecciones adquiridas previamente (retinitis por CMV, Linfomas asociados al VEB e infección par los virus de las hepatitis B y C). En resumen, diremos que los agentes infecciosos implicados en la infección del paciente trasplantado son varios pero, con la experiencia acumulada a lo largo del tiempo, también es cierto que es rara la aparición de una infección absolutamente imprevista.

EVALUACION EN EL RETRASPLANTE Pautas referentes al Donante Muchos de los posibles donantes de órganos están previamente ingresados en el Hospital durante algún tiempo. En muchas ocasiones, y ante la posibilidad de obtener la donación, se solicitan rápidamente las determinaciones analíticas pertinentes y existe tiempo suficiente para realizarlas sin "urgencia". En otros casos el laboratorio es presionado con insistencia y ha de estar capacitado para realizar, en muy pocas

horas o minutos, las determinaciones necesarias sin las que el trasplante no puede realizarse. Fundamentalmente es a este último supuesto al que nos referiremos de forma principal. La posible transmisión, a través del órgano trasplantado de determinados agentes infecciosos de donante a receptor no significa que el transplante no pueda o no deba realizarse. Algunos de los microorganismos transmitidos con el órgano son perfectamente tolerados por el receptor o muy bien controlados por la terapéutica o la profilaxis. Con estas premisas se comprende que la investigación microbiológica en el donante ha de estar orientada no a una identificación exhaustiva y pormenorizada de microorganismos, sino, primero, a destacar la presencia de agentes infecciosos transferibles que puedan comprometer la viabilidad del injerto o la evolución normal del enfermo transplantado y, segundo, a obtener una información útil que permita predecir las posibles complicaciones que surgirán en el recpetor y, en ocasiones, decidir cual será el candidato más idóneo para que el transplante sea más "eficiente y seguro". En este sentido el futuro donante deberá ser sometido a una investigación rutinaria mínima que podrá ser ampliada dependiendo de las circunstancias concretas implicadas en cada caso. 1) Rutina microbiológica Desde el punto de vista bacteriológico y en pacientes que han estado hospitalizados durante días, suele ser suficiente con la información disponible hasta el momento en que se produce la donación y es raro tener que solicitar estudios adicionales. En el caso de trasplante de órganos no estériles (pulmón), puede ser conveniente una búsqueda de patógenos en las secreciones (bacterias, hongos, virus y parásitos) básicamente orientadas a poder establecer una profiláxis en el receptor. Como la rapidez es primordial, sería suficiente con la realización y observación de una tinción de Gram y Ziehl junto con alguna otra que permita descartar Pneumocystis y hongos además de un cultivo de rutina a evaluar posteriormente. Con estas técnicas se puede puede obtener rápidamente la información necesaria y de suficiente garantía como para abordar la intervención. La investigación de patógenos en el cultivo estaría dirigida principalmente a la búsqueda de Pseudomonas spp, Mycobacterias, Staphylococcus auerus, enterococos y hongos. De cualquier forma

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la conducta a seguir en estos casos no está suficientemente establecida ni su utilidad clínica definida. Cada caso será manejado de forma individualizada por cada laboratorio. Una fuente menor de posible infección son los patógenos que pueden contaminar los órganos sólidos estériles durante su manejo. La experiencia acumulada demuestra que suele tratarse de Bacilos Gram (+) no esporulados y estafilococos coagulasa negativo que en general representan una contaminación insignificante y sin trascendencia para el receptor . Por ello, parece que no es necesario realizar este tipo de muestreo siempre que el órgano haya sido manipulado correctamente y que el transporte del mismo se haya realizado con garantías. El mismo criterio deberá seguirse con respecto a las soluciones de perfusión para limpieza y mantenimiento o conservación. Es obvio que en el caso de los trasplantes de médula así como también en las donaciones de sangre y derivados todo este proceso no es necesario puesto que se realiza en condiciones asépticas. 2) Rutina serológica El trasplante de un órgano procedente de un donante infectado o portador seropositivo para determinados virus es el mecanismo más eficaz para su transmisión al receptor. Por esta vía, los virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), Hepatitis B y Delta (VHB y D ) y CMV infectan al receptor produciendo enfemedad en casi el 100% de los pacientes seronegativos. Otros cómo el Virus de la Hepatitis C (VHC), y VEB también son transferidos, pero su poder para producir enfermedad clínicamente significativa es menor. Lo mismo sucede con Toxoplasma gondii el cual merece una especial atención en el caso de un trasplante de órgano cardíaco a un receptor seronegativo. El método más sencillo y rápido para conocer la situación del donante frente a cada uno de estos agentes es el estudio serológico de una muestra que se obtendrá cuando se clasifica al paciente como posible donante. Cuatro son los estudios serológicos indispensables a realizar de forma inmediata en esta muestra ya que de su conocimiento se derivarán consecuencias muy importantes no solo para el donante, que podría ser rechazado como tal, sino también para el receptor. Estas pruebas están relacionadas con el VIH, VHB, VHC y CMV. El resto de las determinaciones de anticuerpos pueden

retratarse algunas horas pero siempre serán de una valía inestimable. Es suficiente con el resultado cualitativo. La positividad para los anticuerpos VIH excluyen la posibilidad de una donación. La negatividad de la prueba tiene un valor predictivo muy elevado e indica, con muy alta probabilidad, la ausencia de infección por lo que no se recomienda la realización de una prueba para la detección de antígeno p24 circulante. La detección del HBsAg del VHB es otra de las determinaciones necesarias para que el transplante pueda ser eficazmente manejado. Como se expondrá más adelante existen numerosas pruebas en el mercado para realizar esta determinación. La infección por el VHC a través del órgano no transplantado puede modificar de una manera importante el pronóstico del receptor susceptible por lo que también debe de ser investigado en el donante. Las pruebas disponibles en el mercado nos ofrecen la posibilidad de emplear para la detección de anticuerpos técnicas con antígenos recombinantes o sintéticos. Cualquiera de las dos son adecuadas para estudiar sueros o plasmas de posibles donantes. Dado que los datos aportados por la determinación de anticuerpos frente a CMV son muy útiles en cuanto al establecimiento o no de la profilaxis antiviral, recomendamos su realización inmediata. El estudio de anticuerpos frente a otros virus Herpes puede diferirse. Toxoplasma gondii merece una consideración especial en los casos de transplante cardíaco. La situación serológica del donante deberá ser conocida con prontitud para poder iniciar una posible profilaxis si el receptor fuese seronegativo. La prueba a emplear para esta determinación tendrá sensibilidad suficiente para clasificar al donante como seropositivo o seronegativo con seguridad. La muestra obtenida del donante deberá ser conservada y testada después, si se considera necesario, por los métodos de confirmación. El suero será congelado para poder utilizado en pruebas posteriores. Es importante recordar que, probablemente, este suero será el último que pueda obtenerse del donante. Pautas referentes al receptor En el momento en que un paciente es incluido en un programa de transplante debe iniciarse la realización de las determinaciones serológicas pertinentes de tal forma que cuando llegue el momento de

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la intervención todos los datos serológicos que importen sean conocidos. La ventaja de realizar las determinaciones serológicas a lo largo del programa se basa en que, sin el apremio del tiempo, podremos realizar las técnicas con sus protocolos más eficaces, confirmar los resultados en caso de dudas y obtener así altos valores productivos que nos permitan clasificar correctamente a los pacientes como seronegativos y/o seropositivos. Hasta que este momento llega, en ocasiones pueden pasar meses o años, la evaluación de los parámetros serológicos que fueron negativos o que puedan modificarse a lo largo del tiempo (VHB, VIH, etc.), deberán irse actualizando sin que exista una norma sobre la frecuencia con la que esto debe hacerse. 1) Rutina serológica La serología a realizar no difiere grandemente de la recomendada en el apartado referente al donante, es decir VIM, VHB, VUC, CMV resto del grupo Herpes y Toxoplasma. Como recomendación general suplementaria diremos que no es necesaria la repetición sistemática de pruebas con resultado positivo conocido ya que los nuevos datos no aportarán nada útil a lo que ya se conoce durante este período de espera del paciente (en un enferma seropositivo para CMV sólo obtendremos con la repetición una reiterada evidencia de su seropositividad ). En los pocos casos, justificados o no, en los que no haya sido posible conocer la situación serológica del receptor de forma programada y se solicite la analítica de forma urgente, se procederá de igual manera que con el donante realizándose pruebas serológicas frente al VHB, VIII, VHC y CMV. La muestra deberá guardarse congelada después de que los resultados hayan sido confirmados. En resumen diremos que en el pretransplante, tanto en el donante como en el receptor, son necesarias un mínimo de pruebas que fundamentalmente son la determinación del HBs-Ag, Anti-VHC, Anti-VIH y Anti-CMV. El estudio bacteriológico, micológico, etc. dependerá de cada situación.

TECNICAS RECOMENDADAS INTERPRETACION

SEROLOGICAS E

Virus de la Hepatitis B 1.- Estudio programado: Para clasificar correctamente al paciente es necesario conocer la situación frente a HBsAg, AntiHBc y Anti HBs. La negatividad de todos los marcadores o la positividad de AntiHBc en solitario se interpretará como individuo susceptible. 2.- Estudio Urgente: Se realizará como mínimo una prueba para HBsAg. El resultado clasificará a los pacientes como Positivos o Negativos. Técnicas recomendadas. Para el estudio del HBsAg se emplearán técnicas que alcancen sensibilidades de 0,2 nanogramos/mL. Esta sensibilidad es alcanzable con las pruebas de ELISA y MEIA siguiendo los protocolos de sus fabricantes. A pesar de la facilidad y rapidez de ejecución no son recomendables las técnicas de latex ya que con la mayoría de ellas pueden obtenerse resultados falsos positivos y negativos. Para Anti HBc y AntiHBs deben igualmente emplearse técnicas de ELISA. Virus de la Hepatitis C En cualquier circunstancia se realizará una prueba que ponga de manifiesto anticuerpos frente a antígenos del virus C. 1.- Estudio programado: Test de ELISA y confirmar cualquier resultado positivo con otra prueba serológica que tenga antígenos individualizados de obtención diferente. 2.- Estudio Urgente: No es posible la confirmación de un resultado positivo en este momento. En ambos supuestos el resultado positivo nos clasificará al paciente como infectado y capaz de transmitir la infección viral. Un resultado negativo indicará, en la mayoría de los casos, ausencia de contacto previo con el virus. Técnicas recomendadas. Idealmente se deberá escoger, para los estudios programados, un método ELISA de alta sensibilidad (antígenos recombinantes) que evite los falsos negativos mientras que, para los estudios rápidos es más conveniente primar la especificidad (péptidos sintéticos). En cualquier caso y dadas las caracterísiticas de la infección por este virus ambos tipos de pruebas, preferiblemente de última generación, se han mostrado útiles para la detección de anticuerpos y cualquiera de ellas puede ser empleada con garantías. (Para más

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información sobre el diagnóstico de las infecciones por estos virus remitimos a Procedimientos en Microbiólogía Clínica. Serología de las Hepatitis Virales). Virus de la Inmunodeficiencia Humana La determinación de los anticuerpos frente a este virus se puede realizar por cualquiera de las técnicas ELISA disponibles en el mercado. Se realizarán en suero o plasma. No son recomendables las determinaciones realizadas en otros fluidos o secreciones. 1.- Estudio programado: Todo resultado positivo será confirmado, mediante Western Blot u otro test de confirmación, antes de darse el resultado como definitivo. 2.- Estudio Urgente: No es posible la confirmación del resultado positivo en este momento. En ambos supuestos el resultado positivo nos clasificará al paciente como infectado. Un resultado negativo indica, en la mayoría de los casos y dado el alto valor predictivo de la prueba, ausencia de contacto con el virus por lo que no está indicada la investigación de antígeno. Técnicas recomendadas Para la determinación de anticuerpos el mercado pone a nuestra disposición pruebas indirectas (alta sensibilidad) y competitivas (alta especificiadad). El criterio de elección de una u otra es el mismo que para el virus de la hepatitis C. Los métodos rápidos basados en la tecnología de ELISA en papel son también muy útiles cómodos para pocas muestras aunque se deberá ser muy escrupuloso en su realización. (Para más información sobre el diagnóstico de las infecciones por este virus remitimos a Procedimientos en Microbiología Clínica. Diagnóstico microbiológico del Virus de la Inmunodeficiencia Humana) Citomegalovirus Dado que la gravedad de la infección por CMV en el receptor es menor si se trata de una reactividad que de una primoinfección lo fundamental de la realización de la serología frente a este virus es el poder clasificar a donante y receptor, siendo más importante el problema si el primero es seropositivo y el receptor seronegativo. Desde el punto de vista clínico es importante conocer este dato rápidamente. Un resultado positivo indica que el paciente ha experimentado una infección previa y que es portador del virus. El resultado negativo es expresión de susceptibilidad a la infección primaria.

Técnicas recomendadas En la actualidad existen reactivos de muy buena calidad que permiten la medida de IgG específica (ELISA indirecto, ELISA con antígeno marcado, Inmunofluorescencia indirecta convencional o automatizada) o de anticuerpos totales frente a CMV. Las técnicas con soporte de partículas de Latex son recomendables dada su sensibilidad, especificidad, facilidad y rapidez de realización. Virus Varicela-Zoster Es especialmente importante conocer el estado serológico en los niños candidatos a trasplante de médula ósea de cara a recomendar la vacunación en los seronegativos. En teoría un resultado positivo indica que el paciente ha experimentado una infección previa y que tiene el virus de forma latente. Un resultado negativo indica susceptibilidad a la infección primaria. Técnicas recomendadas En principio las técnicas más adecuadas (fluorescencia anticomplemantaria y tinción de anticuerpos de membrana con anticuerpos fluorescentes) no son aplicables en la gran mayoría de los laboratorios. Se pueden emplear métodos ELISA indirecto o IFI convencional o automatizada para la medida de IgG específica. Al igual que con CMV la aplicación de las técnicas de Latex ofrecen buenos resultados en muy poco tiempo. Hay que hacer notar que, excepto con las técnicas de referencia, es posible la aparición de reacciones cruzadas con otros herpes virus e incluso la obtención de algún falso negativo, por lo que se deberá ser cauto con la interpretación obtenida con estas técnicas. Virus Herpes simplex y Epstein-Barr Frente a ambos virus se medirá la presencia de IgG específica. Para Herpes simplex se empleará una prueba ELISA y para EB será suficiente conocer si existen anticuerpos IgG frente al antígeno de la cápside viral (medidos preferiblemente por IFI convencional). En ambos casos la presencia de anticuerpos es indicativo de contacto previo con el virus y por tanto posibilidad de reactivación. Toxoplasma gondii Como anteriormente se comentó su determinación es importante en el caso de los trasplantes cardíacos con donante seropositivo y receptor seronegativo. La

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determinación primordial será la detección de IgG específica y se basará en técnicas ELISA, aglutinación directa modificada (anticuerpos totales), inmunofluorescencia indirecta etc. No debemos de olvidar, fundamentalmente en España, la realización previa al trasplante de una prueba de Mantoux para evaluar el riesgo de enfermedad tuberculosa tras la introducción de la inmunosupresión.

EVALUACIÓN TRASPLANTE

EN

EL

POST-

Un paciente que recibe un órgano puede infectarse a través de la víscera donada, como consecuencia de la cirugía y por reactivación de patógenos latentes debido a la inmunodepresión. Un control exhaustivo de la mayoría de los patógenos que pueden intervenir en la infección no es probable que esté al alcance de todos los hospitales, sin embargo, es necesario ejercerlo para establecer de una manera rápida y precisa el diagnóstico etiológico de cualquiera de estas infecciones, evitar el rechazo del órgano, en ocasiones la muerte del paciente y acortar los días de hospitalización. En este momento es importante resaltar que, para poder evaluar correctamente a un enfermo trasplantado, es imprescindible disponer de una infraestructura que permita el cultivo de, como mínimo, VHS y CMV. Control del trasplantado sin evidencia de infección Primer mes: Se realizará un control bacteriológico de la herida quirúrgica, catéteres y sondas. Hemocultivos y urocultivos semanales. Investigación de CMV en sangre y orina a los 1, 15, y 30 días. Investigación de VHS en cavidad oral si hay lesiones sospechosas o se considera necesario. Del segundo al sexto mes: Investigar CMV en sangre y orina a los 45, 60, 90, 120 y 180 días. El valor clínico de la demostración de la viruria por CMV es, al menos, cuestionable por lo que su búsqueda se deja a criterio del laboratorio. El estudio serológico se orientará a investigar las primoinfecciones o reactivaciones subclínicas por CMV, VHS y VEB. En el trasplantado cardíaco el Toxoplasma gondii será uno de los patógenos importantes a vigilar. La serología se realizará en paralelo con una alícuota del suero obtenido antes del trasplante. La seroconversión o serorrefuerzo de IgG y/o la aparición de IgM específica frente a alguno

de estos agentes se interpretará como señal de infección activa. También se realizarán serologías para VHB y VHC en función de los resultados previos. Del sexto mes en adelante se recomienda repetir la serología del control anterior. Las condiciones técnicas serán las mismas. Transcurrido un año se deberá repetir la serología para VHB y VHC si los resultados obtenidos anteriormente lo aconsejan. Control del trasplantado con evidencia de infección Sospecha de infección bacteriana y/o fúngica: Dependiendo de la clínica del enfermo deberán hacerse hemocultivos, urocultivos, cultvos de secrecciones respiratorias de vías bajas o mejor lavado broncoalveolar y cepillado (tener presente la posibilidad de infección por Pneumocystis carinii, M. tuberculosis, Legionella y hongos). Si fuese pertinente se realizaría también cultivo de una biopsia pulmonar con los mismos criterios de búsqueda. Sospecha de infección por CMV: Se realizará un estudio de CMV en sangre y orina. Además, según la sintomatología del enfermo, se estudiará un lavado broncoalveolar y biopsias (pulmón, hígado, médula ósea, mucosa gástrica o duodenal, riñón). La combinación del cultivo con la investigación de antígenos tempranos (shell-vial) que nos aporta resultados en las primeras 20 horas es la práctica más seguida en los hospitales. La detección de antígeno en leucocitos, técnica que no necesita cultivo celular, parece prometedora y en algunos centros se ha convertido en la técnica de elección. La serología no aporta datos útiles para el diagnóstico en el momento de la infección. Sospecha de infección por VHS: Se investigará la presencia del virus en las lesiones mucocutáneas vesiculares mediante análisis del líquido vesicular o frotis de la úlcera. Según la patología del enfermo se estudiará la presencia del virus en aparato respiratorio mediante lavado broncoalveolar o biopsia. Aunque existen técnicas de inmunofluorescencia para la detección de antígeno en material infectado el cultivo es rápido pudiendo tener resultado en 24 horas. En la sospecha de infección sistemática, se realizará, además, serología en paralelo con alguna alícuota anterior aunque la sensibilidad es muy baja en el paciente inmunodeprimido. La seroconversión suele indicar infección

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activa, pero con frecuencia se observa tardíamente. Si existe clínica de meningoencefalitis se realizará también un estudio simultaneo de anticuerpos en suero y LCR y se calculará el índice de albúmina LCR/Suero. Un índice > de 0.8 con serología positiva en LCR se considerará positivo para valorar la producción de anticuerpos en LCR. Sospecha de infección por VEB, VHB y VHC: El método más sencillo de diagnosticar esta patologías es el estudio de marcadores serológicos. En lo que refiere al VEB, cualquier aumento significativo en el título de IgG anti-VCA o de anticuerpos frente al antígeno seropositivo antes del trasplante, se considerará indicativo de recurrencia o reinfección. En el caso de que el paciente fuera seronegativo, la presencia de IgM anti VCA o la seroconversión para IgC anti VCA o la seroconversión para IgG anti-VCA indicarán infección primaria. Para el diagnóstico de las otras infecciones, VHB y VHC, remitimos a Manual de procedimientos en Microbiología Clínica. Serología de las Hepatitis Víricas. Sospecha de infección por Toxoplasma: El diagnóstico microbiológico se basará en la serología (seroconversión de IgG y/o aparición de IgM si esta era negativa). La

sola detección de IgM sin seroconversión de IgG no es dato suficiente como para hacer el diagnóstico de infección activa puesto que este parámetro, por si sólo, tiene un bajo valor predictivo. Puesto que este protozoo crece en los mismos cultivos celulares que los utilizados para los virus, la siembra del material de biopsia puede dar resultados fiables. De todo lo anteriormente indicado se desprende que cuando el paciente ha sido trasplantado demanda una atención clínica importante y que parte de esa responsabilidad recae, directamente, en los laboratorios de Microbiología. Es claro que los problemas microbiológicos que se presentan antes del trasplante son, casi siempre, fáciles de solucionar. No ocurre lo mismo con los que emergen después de la intervención que, aunque son previsibles o esperados, exigen al laboratorio un trabajo altamente especializado. Tal como se dijo al principio, los comentarios y pautas anteriores pretenden ser únicamente una guía indicativa de la rutina básica para diagnóstico y vigilancia del paciente trasplantado. Cada hospital podrá disponer de diferentes posibilidades pero básicamente se han indicado las más usuales que se consideran mínimas para abordar con garantía el inicio de un programa de trasplantes.

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Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: Raul Ortiz de Lejarazu Leonardo

Ramón Cisterna Cáncer José María Eiros Bouza Amelia González López Mª Carmen Maroto Tomas Pumarola Suñe José Romero Vivas

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INDICE

1. Introducción 2. Objetivos 3. Pruebas Diagnósticas y Pruebas de Cribado de Anticuerpos VIH. 3.1. Características 3.2. Tipos de Técnicas Enzimoinmunoanálisis Aglutinación Pruebas de EIA de Membrana (Dot-Blot) Pruebas Fluorimétricas 4. Pruebas de Confirmación 4.1. Confirmación por Técnica de Western Blot 4.2. Confirmación por Técnica de Inmunofluorescencia Indirecta 4.3. Confirmación por Técnica de Radioinmunoprecipitación 5. Reacción de Amplificación Genómica por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en el Diagnóstico de la infección VIH. 6. Aislamiento Vírico en el Diagnóstico de la Infección VIH. 7. Identificación del Tipo de Infección VIH (VIH-1/VIH-2). 8. Marcadores Séricos Específicos de la Infección VIH. 8.1. Sistema Antígeno p24 - Anticuerpo p24. 9. Expresión de Resultados del Diagnóstico Serológico de la Infección VIH y de los Marcadores Específicos. 9.1. Pruebas de Diagnóstico. 9.2. Pruebas de Confirmación. 9.3. Marcadores Específicos de VIH. 10. Estrategias en el Diagnóstico Serológico de la Infección VIH. 10.1 Principios Generales. 10.2. Estrategia en la Donación de Sangre/Organos. 10.3. Estrategia en el Diagnóstico de la Infección VIH. Primoinfección VIH. Fase Asintomática de la Infección VIH. Fase Sintomática de la Infección VIH. Monitorización del Tratamiento Anti-retroviral. 10.4. Estrategia en Situaciones Especiales. Embarazo. Recién nacidos de Madres Portadoras. Accidentes con Riesgo de Exposición a VIH. En la Vigilancia de la Infección VIH. 11. Criterios Generales para la Realización de Pruebas VIH. 12. Disposiciones Legales. 13. Bibliografía Seleccionada.

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6. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR VIH 1998 1. INTRODUCCION Los virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y tipo 2 (VIH-l y VIH-2) han sido claramente identificados como la causa principal del sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Los VIH constituyen el prototipo de miembros del Género Lentivirus (tabla 1), perteneciente a la familia Retrovindac. El nombre del género alude al largo período de incubación que transcurre entre la infección y la enferrnedad, que puede incluso superar los 10 años. El genoma de VIH está compuesto por genes estructurales (env, pal y gag) responsables de la codificación de proteínas que formarán parte de la partícula viral y genes reguladores que codifican la expresión de proteínas con funciones moduladoras sobre algunas propiedades biológicas del virus y de la célula infectada. Las proteínas estructurales son las más frecuentemente empleadas en el diagnóstico serológico, bien en forma nativa y purificada o como péptidos sintéticos (PS) o péptidos recombinantes (PR) producidos en bacterias y otros microorganismos en los que se ha transferido parte del genoma de VIH. La acción patógena de VIH en el individuo infectado, resulta de la interrelación entre múltiples factores que influyen en el ciclo vital del virus en sí y en la respuesta inmune por parte del organismo. Aún persisten muchos interrogantes para tener una idea clara de los mecanismos de patogenicidad de VIH. Muy esquemáticamente, la infección por VIH se traduce en un estado de latencia y/o persistencia del virus en diversas estirpes celulares del organismo infectado (linfocitos, macrófagos, glia cerebral, células precursoras de la médula ósea, etc.). Con el transcurso del tiempo, la mayor parte de los individuos infectados desarrollarán signos y sintomas relacionados con la infección por VIH. De acuerdo con su sintomatología hay propuestos varios tipos de clasificación clínica para la infección por VIH, entre las cuales, la que reúne los criterios propuestos por la O.M.S. se recoge en la tabla 2. Las personas infectadas por VIH durante el estadío I son, las que en términos generales, se denominan portadores asintomáticos, aunque existe la posibilidad de que durante la primoinfección por VIH no aparezcan tampoco ni signos ni sintomas clínicos que hagan sospecharla. El

diagnóstico de la infección VIH tiene distintos objetivos, uno de ellos es el diagnóstico "per se" de personas que sospechan que pueden estar infectadas y requieren atención médica, consejo no directivo y educación sanitaria respecto a su estado. Otro de los objetivos del diagnóstico de VIH es la seguridad en las transfusiones, productos hemoderivados y donaciones de órganos de obligado cumplimiento en el ámbito territorial español. Finalmente, otros objetivos del diagnóstico de la infección VIH, son la aplicación en programas de vigilancia serológica de esta infección (estudios de incidencia y prevalencia, tendencias en grupos poblacionales, etc.) o en programas de investigación clínica, farmacológica, virológica e inmunológica. El método más comunmente empleado para el diagnóstico de laboratorio de la infección VIH se basa en técnicas serológicas que detectan anticuerpos del virus en el suero de las personas infectadas. De este modo se dispone de reactivos para pruebas que pueden ser automatizadas total o parcialmente y aplicarse a un gran número de sueros. Estas pruebas utilizadas para el diagnóstico de una persona individualizada, reciben el nombre de pruebas de diagnóstico de la infección VIH, pero también pueden utilizarse como un instrumento para desechar o rechazar productos sanguíneos o biológicos contaminados, en cuyo caso se denominan de cribado. Conviene subrayar, que la estrategia a emplear en el cribado rutinario es distinta a la utilizada para el diagnóstico individualizado de la infección VIH.

2. OBJETIVOS 1. Establecer la utilidad de cada una de las pruebas que se emplean para el diagnóstico serológico de la infección por VIH y valorar la significación de los resultados obtenidos. 2. Determinar los criterios para la elección de las pruebas para el diagnóstico y evolución de la infección VIH. 3. Recomendar estrategias de utilización de pruebas diagnósticas para el diagnóstico y evolución de la infección VIH en una persona, para la seguridad en donaciones y transfusiones y donaciones de órganos y para estudios epidemiológicos y de investigación.

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3. PUEBAS DIAGNOSTICAS Y PRUEBAS DE CRIBADO DE ANTICUERPOS VIH De forma conceptual, denominados pruebas diagnósticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona y pruebas de cribado cuando se aplican a un conjunto de muestras y su finalidad no es la diagnóstica. La eficacia de una prueba diagnóstica depende de su capacidad para señalar correctamente la presencia o ausencia de la enfermedad que se estudia. La aplicación de técnicas de cribado tiene como objetivo detectar la presencia de anticuerpos anti-VIH (Ac VIH) para evidenciar el estado de infección y su eficacia será tanto mayor cuanto menor sea el número de individuos/muestras infectados

que presenten un resultado falso negativo. Por lo tanto, su importancia radica en ser "un primer escalón" en el proceso diagnóstico de la infección. Ello implica un tipo de tecnología realizable por la mayoria de laboratoriso y aplicable a un número importante de muestras. 3.1. CARACTERISTICAS Sensibilidad, Especificidad y Valor Predictivo La sensibilidad (capacidad de la prueba para detectar la infección cuando la infección está presente) y la especificidad (capacidad de la prueba para detectar la infección cuando la infección está ausente) son los parámetros esenciales para valorar un test que vaya a ser empleado, y se completan con la expresión matemática de los valores predictivos (VP):

VP de un resultado positivo (VPP)= Número de verdaderos positivos ---------------------------------------------Número total de positivos de la prueba VP de un resultado negativo (VPN)= Número de verdaderos negativos ---------------------------------------------Número total de negativos de la prueba Este resultado se puede expresar por el cociente obtenido o en forma de porcentaje, multiplicando por cien las expresiones matemáticas anteriores. En general, a medida que la prevalencia de infección VIH es alta en una población dada (por ejemplo, ADVP), el valor predictivo positivo tiende a ser elevado y por el contrario el VPN disminuye. De forma inversa, cuando la prevalencia es baja el VPP tiende a ser menor y el VPN es elevado. La prueba de cribado ideal es aquella en la que los valores de sensibilidad y especificidad son de 100%, es decir, posee la máxima sensibilidad y nunca es negativa en los casos de infección. Actualmente, ninguna de las técnicas disponibles cumple esta condición y las causas son tanto biológicas como técnicas. Cuando el objetivo del cribado sea la seguridad en el control de productos biológicos (donaciones de sangre, semen, órganos, tejidos, ect.), el criterio de la máxima sensibilidad en el prioritario y deberá optarse por el tipo de técnica cuyo valor se aproxime más al 100%. Cuando el objetivo es el diagnóstico de la infección, el criterio de la máxima

especificidad es el prioritario; la estimación de la prevalencia en el contexto clínicoepidemiológico en el que se encuentra el paciente será importante para optar por pruebas más específicas con el fin de técnicas de confirmación más complejas y costosas. Sencillez de Ejecución Carazterísticas a tener en cuenta de modo que resulten asequibles para la mayoría de los laboratorios. Deberá ser suficiene una mínima dotación instrumental y unas buenas prácticas de laboratorio sujetas a los controles de calidad correspondientes. Lectura Sencilla Mejor si es objetiva y con expresión de resultados de forma cualitativa (positivo/dudoso/negativo). 3.2. TIPOS DE TECNICAS Enzimoinmunoanálisis La detección de Ac VIH con técnicas de EIA es el método más empleado en la actualidad. De ellas existen distintos principios en la detección de los anticuerpos (indirecto, competitivo, "sandwich" y captura). La progresiva calidad en la elaboración de los antígenos (Ag), hacen de

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este tipo de técnicas las más indicadas si las condiciones instrumentales del laboratorio lo permiten. Los términos 1ª, 2ª y 3ª generación se utilizan según la fuente del Ag y el formato de la prueba. Los ensayos de 1ª generación utilizan lisado viral obtenido en lineas celulares de linfocitos T humanos. Las reactividades inespecíficas debidas a anticuerpos contra el sustrato celular obligan, en general, a que estas técnicas utilicen diluciones elevadas de los sueros para evitar falsos positivos y dicho proceder disminuye la sensibilidad de estas pruebas. Poseen sin embargo una gran capacidad de captación de cualquier tipo de Ac VIH presente en la muestra. El formato de captura en el que el lisado viral es ligado por an anticuerpo monoclonal fijado a la fase sólida es mas específico que el indirecto. Las pruebas de 2ª y 3ª generación utilizan como Ag proteínas recombinantes (PR) o péptidos sintéticos (PS). Son muy sensibles y los resultados son más reproducibles, al utilizar un Ag más normalizado y purificado. Con los tes de 2ª y 3ª generación utilizan como Ag proteínas recombinantes (PR) o péptidos sintéticos (PS). Son muy sensibles y los resultados son más reproducibles, al utilizar un Ag más normalizado y purificado. Con los test de 2ª generación y formato competitivo se ha conseguido la especificidad más elevada. El tipo "sandwich" es utilizado en las pruebas de 3ª generación, que son actualmente las más sensibles, aunque su especificada es menor que la de los test de 2ª generación, extremos que deben ser obtenidos en cuenta a la hora de escoger una prueba. Existen reactivos comercializados con los Ag y formatos citados para la detección de Ac VIH-I y Ac VIH-1 +2. Para la detección específica de Ac VIH-2 solamente disponemos de EIA con PS o listado viral y formato indirecto. Aglutinación Estas pruebas están basadas en la aglutinación de Ag de VIH que previamente ha sido fijado a particulares susceptibles de aglutinar en presencia de suero que contenga Ac VIH. Este tipo de pruebas comenzarón a desarrolarse a mediados de los años 80 como alternativa a los EIA. Pueden utilizar partículas de gelatina o partículas de látex, y como Ag, lisado viral, PS o PR. Son técnicas de manejo muy sencillo, rápidas, de lectura visual, apenas requieren instrumentación y pueden adaptarse a un gran número de sueros.

Su sensibilidad parece comparable al EIA, pero su grado de especificidad es mucho menor. Son las técnicas indicadas para utilizar en laboratorios con escasa dotación instrumental o que manejan un número reducido de muestras. Pruebas de EIA de Membrana (Dot-Blot) En estas pruebas los Ac VIH se detectan por un método inmunoenzimático. El Ag está fijado a tiras de nitrocelulosa y está formado por PR o PS de uno o ambos virus. La mayoría de las pruebas rápidas de detección de anticuerpos emplean este principio. Tienen lectura visual y no requieren instrumentación y su sensibilidad y especificidad aún no están suficientemente evaluadas. Su ventaja y principal indicación es la posibilidad de identificación entre los dos tipos de virus y su mayor inconveniente es un elevado coste. Pruebas Fluorimétricas Han sido las últimas en incorporarse a la oferta diagnóstica (a partir de 1990). Los antígenos específicos están ligados a microparticulas y el indicador de la reacción es un fluorocromo que actúa como sustrato. La fluorescencia emitida durante la reacción es medida por un flurómetro. Tiene por tanto lectura objetiva y requiere un nivel de instrumentación similar a las técnicas de EIA. Dada su reciente introducción en el mercado, hay poca experiencia y aunque la posibilidad de automatización y el procesamiento de gran número de muestras son muy ventajosas, es necesario estudiar su sensibilidad y valorar el coste de incorporación las de forma rutinaria. En la tabla 3 se resumen las principales características de las pruebas comentadas.

4. PRUEBAS DE CONFIRMACION Estas pruebas tienen como objetivo confirmar los resultados obtenidos por las pruebas diagnósticas utilizando técnicas con fundamentos distintos y más específicos. Por lo general, se utilizan para la confirmación de sueros positivos, pero en determinados casos pueden emplearse para continuar sueros negativos, dada su mayor sensibilidad en muchos casos. Existen diferentes pruebas de confirmación, entre ellas, las más utilizadas son las basadas en la inmunoelectrotransferencia o Western Blot (WB), la inmunofluorescencia

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indirecta (IFI) y la radioinmunoprecipitación (RIPA) (tabla 4). 4.1. CONFIRMACION POR TECNICA DE WESTERN BLOT La técnica de inmunoelectrotransferencia, más comúnmente denominada "western blot" (WB), es una de las más ampliamente utilizadas para confirmar resultados positivos en las pruebas de depistaje de Ac VIH, ya que permite una discriminación puntual de las especificidades de reactividad de anticuerpos frente a las distintas proteínas del virus. Las tiras de nitrocelulosa en las que se han transferido las proteínas del virus contienen, generalmente, casi todas las proteínas estructurales del VIH, algunas proteinas precursoras de aquellas, y además otros antígenos celulares contaminantes que proceden de las células infectadas empleadas para la obtención del Ag vírico (tabla 5). Algunas tiras de WB comercializadas para VIH- 1 incluyen, además, algún péptido sintético, correspondiente a glicoproteínas específicas de VIH-2, a efectos de identificación de la infección VIH con una sola tira de reactivo. La técnica de WB consiste, básicamente, en la incubación de una de esas tiras con el suero problema durante un tiempo que oscila entre 2 a 4 horas hasta 18 horas, tras lo cual se revela la presencia de anticuerpos frente a las diferentes proteinas del virus mediante reacciones inmunoenzimáticas de distinta configuración dependiendo del fabricante. El resultado es la aparición de bandas coloreadas de mayor o menor intensidad, en el lugar de la tira de nitrocelulosa en el que están situadas las proteinas del VIH contra las cuales existen anticuerpos en el suero problema. Existen diferentes comercializaciones de la técnica que pueden variar en la carga y calidad del Ag presente en las tiras, tipo y método de revelado y tiempo de incubación con el suero. Dada la finalidad de esta prueba, los WB de tiempo de incubación largo (16-18 horas) deberían utilizarse en los casos de muestras especialmente conflictivas. La lectura e interpretación de los resultados por WB debe hacerse siguiendo unas pautas como las que se resumen en la tabla 6. En primer lugar, Se identificarán, por su posición en la tira, comparádolas con el control positivo, las bandas especificas de reactividad (gp160, gp120, p66, p55, p51, etc.), a continuación puede ser útil asignar un valor de reactividad a cada banda (2:

reactividad franca, 1: reactividad débil o dudosa, o: ausencia de reactividad) y anotarlo de forma individualizada. Aunque la técnica no es cuantitativa, el laboratorio puede, de esta forma, archivar los resultados de forma más detallada, aunque las tiras se hayan deteriorado o eliminado. La lectura automatizada debe realizarse por densitometría; los métodos de análisis de imagen por ordenador (scanner) precisan aun anteriores evaluaciones. Existen distintos criterios de positividad para el WB (tabla 7), de ellos parece el más adecuado el propuesto recientemente por la OMS que resulta el más sensible cuando se manejan sueros de muy variada procedencia poblacional. Adoptando este criterio un suero es considerado positivo cuando presenta reactividad al menos frente a 2 glucoproteínas de las tres que posee el virus (gp160, gp120 y gp4l). Los sueros negativos no deberán mostrar reactividad frente a ninguna de las proteínas presentes en la tira. Finalmente los sueros se denominan indeterminados por WB cuando, existiendo reactividad frente a una o más proteínas, no cumple el criterio de positividad adoptado. Los criterios de positividad más restrictivos se traducen en una falta de sensibilidad para confirmar sueros en sujetos positivos con signos o síntomas de enfermedad ligada a la infección VIH ya que en los enfermos de SIDA se produce una desaparición de las bandas correspondientes a p24, p31, y p55. Sin embargo, dichos criterios aplicados a población de bajo riesgo no hacen perder la serisibilidad al WB, que llega a ser del 100% sin merma de la especificidad. Con el WB pueden darse falsos negativos, posibilidad que debe tenerse en cuenta en individuos con factores de riesgo o signos de infección VIH y en casos de exposición reciente al virus. En los WB indeterminados se observan frecuentemente reactividades clínicas frente a una banda del core viral (p24, p55 y p66) y en otras ocasiones frente a componentes celulares contaminantes de las tiras de nitrocelulosa o epítopos no víricos que aparecen en el procedimiento de manufacturación del WB, permitiendo la exposición de zonas parcialmente desnaturalizadas de aquellas proteinas. Se han descrito WB indeterminados en personas con factor reumatoide, lupus eritematoso, bilirrubinemias elevadas, anticuerpos contra el sistema HLA y en pacientes hemodializados, y otras causas

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(tabla 8). En otros casos la indeterminación en el WB de VIH-1 puede ser causada por infección por VIH-2 u otros retrovirus (HTLVI, HTLV-II). En los sueros indeterminados, el seguimiento debe prolongarse al menos durante 6 meses para verificar si existe un cambio en el patrón de anticuerpos hacia la positividad o por el contrario desaparecen las bandas detectadas inicialmente. Las personas con resultados persistentemente indeterminados al cabo de 6 meses, en ausencia de factores de riego, síntomas o hallazgos clínicos compatibles con la infección VIH, deben considerarse negativas para Ac VIH. Sin embargo, no deberían donar sangre, plasma, semen u órganos y deberán ser informadas correcta y verazmente sobre el significado de su situación, ofreciéndoles disponibilidad clínica y sanitaria ante la posible ansiedad que pueda ocasionárseles. En algunos casos pueden estar indicadas nuevas entrevistas clínicas y un seguimiento mas prolongado en el que se incluyan otros análisis de confirmación (RIPA), evolución de la función inmune e incluso descartar una infección VIH en su pareja sexual, solicitando la cooperación y consentimiento de ésta. En conclusión, la técnica de WB es una prueba de confirmación que en el momento actual es fácilmente adaptable a laboratorios de equipamiento medio, que no tengan un excesivo número de muestras para confirmar y que requiere un cierto entrenamiento para su interpretación y lectura. 4.2. CONFIRMACION POR TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una técnica rápida, sencilla y de bajo coste, susceptible de ser empleada como primera técnica de confirmación en sueros con pruebas diagnósticas (EIA) claramente positivas y en poblaciones con factores de riesgo y sumamente útil para laboratorios que precisen confirmar gran número de sueros. La confirmación por esta técnica está basada en la demostración de anticuerpos frente a células infectadas por VIH, por este motivo, los resultados sólo pueden expresarse como positivos o negativos y no permite especificar de forma concreta otras reactividades. Como Ag se utilizan linfocitos humanos infectados y fijados sobre portaobjetos. Para evidenciar posibles reacciones entre

anticuerpos no específicos presentes en la muestra y el substrato celular utilizado es necesario incorporar como sistema de control células no infectadas. Si existe "doble reactividad" frente a las células que expresen Ag y las células control, el resultado es ilegible, dado que no puede atribuirse la positividad a los anticuerpos específicos pero tampoco descartar su presencia. La lectura se efectúa con microscopio de luz ultravioleta y los resultados dependen mucho de la calidad del microscopio y la experiencia del observador para identificar los patrones de fluorescencia citoplásmica y de membrana que corresponden a la presencia de anticuerpos específicos. El grado de subjetividad en la lectura y la dificultad en la normalización y control del Ag utilizado (distintas lineas celulares, fijación en portaobjetos en diferentes momentos de la infección celular, estado de conservación, etc.) afectan a la reproductibilidad de la técnica. Las células infectadas expresan gran cantidad de Ag correspondiente a distintos momentos de la infección celular, por lo que esta técnica detecta todo tipo de Ac VIH, pero precisa la existencia de niveles superiores a los detectados por el WB. En los reactivos comerciales el Ag es VIH-1 pero existe reactividad cruzada con VIH-2 por lo que no resulta útil para diferenciar los dos tipos de infección. Las diluciones seriadas del suero problema nos permiten expresar los resultados indicando el título obtenido. Esto es especialmente útil cuando se desea comparar niveles de Ac VIH, como es el caso de suero/LCR del mismo paciente cuando se sospecha infección VIH del SNC. El mayor rendimiento de la técnica se obtiene con muestras EIA positivas pertenecientes a personas con prácticas de riesgo. No es aconsejable utilizarla en la confirmación de hemodonaciones, en muestras con resultado EIA positivo débil ni en muestras de personas que están en un contexto epidemiológico de baja prevalencia, aunque las pruebas de cribado hayan sido claramente positivas. Los resultados IFI con patrones atípicos, reactividades inespecíficas o negativos con pruebas de cribado positivas, deberán procesarse con una segunda prueba confirmatoria generalmente WB.

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4.3. CONFIRMACION POR TECNICA DE RADIOINMUNOPRECIPITACION Esta técnica esta basada en la demostración de Ac VIH en el suero, que en presencia de proteinas víricas marcadas radioactivamente conduce a la formación de innunocomplejos. Es la técnica de referencia. La elaboración del Ag requiere condiciones de alta seguridad, ya que se realiza mediante cultivo del virus en línea celular de linfocitos humanos y posterior marcaje radioactivo. El virus complejo marcado se obtiene del sedimento celular (Ag con alta expresión de glicoproteínas y sus precursores) y del sobrenadante del cultivo, más rico en proteínas enzimáticas y codificadas por el gen gag. La reacción Ag-Ac es previa a cualquier a cualquier manipulación del Ag lo que, además de una elevada sensibilidad proporciona una gran especificidad. Los complejos proteína viral-anticuerpo específico son separados por técnicas electroforéticas según su peso molecular y se ponen en evidencia mediante la impresión del marcaje radioactivo en placa fotográfica, obteniendo un patrón de bandas similar al del WB. Dada la complejidad de la técnica, las condiciones obligatorias de seguridad biológica y de manejo de sustancias radioactivas y la manualidad de todo el proceso, esta técnica está reservada concretamente al ámbito de: 1.- Investigación de muestras problemáticas en las que no se pueda establecer diagnóstico de infeción mediante las técnicas convencionales de confirmación. 2.- En la elaboración de paneles de suero destinados a sistemas de control de calidad, tanto de reactivos como de "sueros patrón". 3.- En la diferenciación serológica con fines de investigación, de la infección VIH-1 y VIH-2 cuando las reactividades cruzadas den patrones mixtos en las técnicas de WB y Dot-Blot.

5. REACCION DE AMPLIFICACION GENOMICA POR REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN EL DIAGNOSTICO DE LA INFECCION VIH La base de este diagnóstico reside en la demostración de parte del genoma vírico a partir de muestras de sangre periférica. Existen ciertos casos en los que estas técnicas, basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) logran un diagnóstico más rápido y precoz de la infección VIH en situaciones en las que el

diagnóstico clásico serológico puede tardar en confirmarse: recién nacido de madres infectadas por VIH o con antecedentes de riesgo de infección VIH durante el embarazo y en sujetos con períodos ventana más largos del habitual. Otras situaciones en las que esta técnica o variantes de la misma pueden ser de utilidad son la demostración de infecciones por VIH-2 con serología no concluyente, infecciones dobles por VIH-1 y VIH-2 más recientemente la detección de mutaciones específicas asociadas a la resistencia a los antivíricos. El grado de estandarización de estas pruebas, así como la disponibilidad de reactivos es desigual. Existen reactivos comercializados para PCR diagnóstica de VIH-1 y no existen por el momento para VIH-2 o para el resto de indicaciones diagnósticas descritas en el párrafo anterior. Aunque esta técnica se ha mostrado en algunos casos superior al diagnóstico serológico, la falta de criterios internacionalmente aceptados para la validación de resultados discordantes con la serología, unido a las consideraciones anteriores hace su aplicación deba realizarse con una escrupulosa consideración del contexto clínico en cada caso individualizado.

6. AISLAMIENTO VIRICO EN EL DIAGNOSTICO DE LA INFECCION VIH El aislamiento del VIH sigue siendo hoy en día una técnica de referencia, aunque su empleo quede restringido a laboratorios bien equipados. Supone el cultivo del virus a partir de muestras clínicas que contengan virus libres o células infectadas. En la mayoría de los casos se utilizan linfocitos de sangre periférica separados mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Los linfocitos del paciente se cultivan a 37ºC en atmósfera de 5% de CO² en medios ordinarios (RPMI 1640 y 20% de suero de ternera fetal) adicionados de interleucina-2 junto con linfocitos de donante sano previamente estimulados con un mitógeno (fitohemaglutinina). Semanalmente se añaden linfocitos estimulados de donante, manteniendo estas condiciones de cultivo durante 4 semanas. La detección del crecimiento vírico se puede realizar midiendo la actividad retrotranscriptasa en los sobrenadantes, por detección de antígenos específicos del virus (p24

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principalmente) o bien mediante la demostración del efecto citopático en forma de sincitios o células gigantes formadas por la fusión de células infectadas; que tienen glucoproteina de la envoltura del VIH en su superficie; con otras células contigüas. A pesar de que las muestras más comunes para aislamiento son linfocitos de sangre periférica y líquido cefalorraquídeo (LCR), el VIH ha podido aislarse de gran número de humores orgánicos entre los que se incluyen el plasma, suero, secreciones cervicales, semen, saliva, leche materna, lágrimas, orina, líquido alveloar, órganos de trasplante y tejido cerebral. El aislamiento es la técnica de referencia final para cualquier otra técnica y es obligado cuando se pretende establecer el fenotipo de VIH (cepas inductoras de sincitio o no; IS/NIS), la actividad in vitro de antivíricos y puede servir de referencia de la cantidad de virus presente en la muestra del paciente. Sin embargo, el aislamiento de VIH presenta, como principal inconveniente, la necesidad de laboratorios con complejos sistemas de contención biológica (nivel P3), pero además, podría plantear la dificultad de seleccionar tan sólo aquellas, con mayor capacidad para su crecimiento in vitro,disminuyendo, por tanto, su posible importancia como marcador de eficacia terapéutica o como técnica de monitorización de la aparición de variantes del virus resistentes a los anti-retrovirales.

7. IDENTIFICACION SEROLOGICA DEL TIPO DE INFECCION VIH (VIH1/VIH-2) Actualmente, la identificación serológica de los Ac VIH, en una persona infectada, no debe plantear ninguna dificultad en nuestro medio. En España, la casi totalidad de individuos diagnosticados serológicamente y confirmados, lo están por VIH-1, por tanto, cualquiera de las pruebas de confirmación basadas en reactividad diferenciada frente a las proteínas del virus (WB, RIPA) pueden servir para identificar el tipo de infección VIH. El contexto epidemiológico debe orientar el diagnóstico de infección VIH-2. En el ámbito de la tecnología EIA, una buena combinación es la utilización de un EIA indirecto (VIH 1 y 2) un EIA competitivo (VIH-1). Una positividad elevada en el primer test y negativo o débilmente positivo en el segundo test, es muy sugerente de infección por VIH-2.

La confirmación de una infección por VIH-2, se debe realizar en sueros reactivos en las pruebas de diagnóstico y no confirmados o indeterminados en el WB de VIH-1, comprobando en WB para VIH-2 su reactividad siguiendo las pautas mencionadas anteriormente con el criterio de la OMS (reactividad al menos frente a dos glicoproteinas: gp140, gp105 o gp36). Existen pruebas que vehiculan en tiras de nitrocelulosa péptidos sintéticos correspondientes a los epítopos de glicoproteínas de VIH-1 (generalmente gp41) y de VIH-2 (generalmente gp36), la utilización de las mismas puede servir para aportar más datos y ayudar a la identificación de infecciones VIH-2 con más certeza. El mayor problema de identificación lo constituyen los sueros en los que se aprecia doble reactividad frente a VIH-1 y VIH-2 en las pruebas serológicas. En dichos casos la reactividad doble puede estar causada por la existencia en el WB de reactividad cruzada frente a proteínas del "core" y frente a las glicoproteinas de envoltura (consideradas más específicas). En estos casos puede estar indicado utilizar pruebas de péptidos sintéticos realizando diluciones de la muestra y observando frente a cual de los péptidos desaparece la reactividad. Sugiriendo así, que la identificación lo es por el tipo de VIH frente al cual persiste la posibilidad tras la dilución de la muestra. A pesar de lo espuesto los casos de coinfecciones por VIH-1 y VIH-2 pueden ser de díficil confirmación desde el abordaje serológico y precisarán pruebas de diagnóstico directo, (como las de amplificación genómica especifica, cultivo o ambas) que permitan una documentación más fiable de la doble infección, que es bastante infrecuente. En el entorno europeo los países con más casos documentados de infección VIH-2 son Portugal, Francia y Bélgica. En España, desde hace algunos años se han documentado infecciones por VIH-2 principalmente en inmigrantes africanos y esporádicamente en sujetos españoles. En algunos de los sueros de dichos casos se ha obervado que puede haber una cierta reactividad en las pruebas de VIH-1 y una lectura superficial del WB podría confundir a personas poco habituales a esta prueba de confirmación. En conclusión, la identicación de infección por VIH-2 se aconseja sólo en los casos de reactividad repetida en pruebas de diagnóstico y con resultados indeterminados

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frente a VIH-1 en pruebas de confirmación o en individuos con antecedentes de contactos sexuales con personas de antiguas colonias portuguesas, de países africanos o con prostitutas de esos países. Las pruebas de péptidos sintéticos pueden ayudar a la identificación serológica de la infección VIH en dichos sueros.

8. MARCADORES SERICOS ESPECIFICOS DE LA INFECCION VIH. En la actualidad existen marcadores séricos que permiten una mejor caracterización de la infección VIH, uno de ellos lo constituye una de las proteínas estructurales del core de VIH-1, de 24 kd de PM, denominada proteína p24 ó Agp24. Esta proteína aparece como consecuencia de la replicación del VIH en el organismo y puede detectarse en distintos momentos de la infección, constituyendo así otra importante ayuda diagnóstica. Así mismo, en el curso de la infección VIH, se producen anticuerpos específicos contra dicha proteína que sufren variaciones a lo largo del tiempo. Ambos marcadores séricos son específicos de la infección VIH y su manejo conjunto pueden facilitar el mejor seguimiento de los individos infectados por VIH. 8.1. SISTEMA ANTIGENO p24 ANTICUERPO p24 En la actualidad, existen diversas técnicas comerciales que utilizan el principio de EIA en triple "sandwich" para la detección de Ag p24. Las muestras clínicas en las que puede realizarse la detección son: suero, plasma y LCR. Dada la existencia de falsos positivos deberá confirmarse mediante una reacción de bloqueo de la muestra con suero antip24. La sensibilidad de los reactivos actuales permite la detección de cantidades que oscilan entre 10 a 50 pg/ml o más de Ag p24. Se puede hacer una semicuantificación de dicho Ag utilizando sueros en cantidades conocidas de p24. Las muestras pueden almacenarse a 4ºC durante una semana y más tiempo a -20ºC ó -70ºC. Este antígeno puede desnaturalizarse, por ello, se recomienda para el almacenamiento prolongado temperaturas de -70ºC. Para este tipo de ensayos deben rechazarse muestras turbias, hemolizadas o repetidamente congeladas y descongeladas. La sensibilidad de esta

técnica es menor que la de la detección de Ac VIH. El hallazgo oscila desde un 4% para sujetos seropositivos asintomáticos hasta el 70% de los pacientes de SIDA. En LCR los porcentajes de detección pueden variar desde 0% en asintomáticos al 55% en pacientes de SIDA. En el curso de la infección por VIH se produce una antigenemia primaria p24 con un aclaramiento posterior que puede ser debido, entre otros factores, a la formación de inmunocomplejos por la aparición de Ac circulantes anti-p24. Según esto, la aparición de dicho Ag en el curso de la infección sería el resultado de una mayor replicación vírica que puede llevar a un exceso de Ag y producir el aclaramiento de Ac p24 observando en el SIDA. En la actualidad hay descritas técnicas sencillas para disociar inmunocomplejos p24 y evaluar la cantidad libre y combinada de este Ag. La detección de Ag p24 tiene diferentes gravados de utilidad clínica según la finalidad que se persiga. La aparición de Ag circulante libre y su persistencia es marcador de mal pronóstico y de progresión de la infección, y suele correlacionar bien con otros marcadores no específicos como el cociente de linfocitos CD4/CD8, la elevación de beta-2-microglobulina y neopaterina y los linfocitos totales. Los niveles elevados de antigenemia p24 se asocian con distinta frecuencia a la desaparición de Ac p55 y Ac p24 también de mal pronóstico. Por otra parte, la presencia de p24 puede demostrarse en LCR en diferentes estadíos de la infección, como expresión de la multiplicación neurológica del virus. La detección de Ag p24 para diagnóstico en el período ventana es de menor utilidad y debería reservarse sólo ante signos clínicos compatibles con la primoinfección en caso de exposición conocida o sospechada. Aunque existen referencias sobre detección de p24 antes de la seroconversión, tanto en asintomático expuestos al virus, como en enfermos en el estadío I, en la mayoría de los casos la antigenemia primaria dura 1 o 3 semanas durante el período ventana que precede a la seroconversión VIH. En los casos pediátricos la detección de Ag p24 confirmada es indicativo de infección y puede agilizar el diagnósitico. Ya que la detección de IgM anti-VIH en recién nacidos de madres infectadas es de variable utilidad y la IgG que presentan puede ser de transferencia materna en el 25% de los casos, de producción propia en la misma

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proporción o de la coexistencia de ambas, debido a que el tiempo de aclaramiento de los anticuerpos maternos puede ser superior a los 18 meses. Los métodos que permiten definir dichas situaciones son laboriosos, en algunos casos se dan falsos negativos por pruebas de EIA que resultan positivas mediante WB o pruebas más sensibles En estos casos la detección de Ag p24 libre o en inmunocomplejos ofrece una alternativa diagnóstica más asequible. Esta técnica serológica, sin embargo, es menos sensible que el cultivo o la detección por amplificación genética (PCR). En los casos tratados con quimioterapia antivírica específica para VIH la detección y cuantificación de p24 sirve para controlar la eficacia terapéutica del fármaco empleado y como marcador adicional para la monitorización del paciente. La detección de Ac p24 se realiza habitualmente mediante técnicas de EIA, la mayoría de estas utilizan péptidos recombinantes o sintéticos de p24. En general son algo menos sensibles que otras técnicas cualitativas como el WB pero tienen la ventaja de permitir una semicuantificación del título de dichos anticuerpos. No es una prueba de confirrnación, su fin es exclusivamente como marcador cronológico de la infección VIH. Cualquier laboratorio con un equipamiento de tipo medio, habituado al empleo de técnicas de diagnóstico basadas en el principio inmunoenzimático puede realizar este tipo de determinaciones. En algunos casos pueden presentarse falsos positivos en la detección de Ac p24 debido a reacciones heterogéneas con diversos antígenos. Por esta razón y dada su finalidad como marcador de evolución, no es aconsejable hacer este tipo de determinación sin la confirmación previa de la infección VIH en un individuo.

9. EXPRESION DE RESULTADOS DEL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE LA INFECCION VIH Y DE LOS MARCADORES ESPECIFICOS La demostración confirmada de anticuerpos frente a VIH en una persona es significativo de infección por dicho virus. Dadas las características biológicas del mismo, dichas personas deberán ser consideradas a todos los efectos como portadores del virus y por tanto potencialmente transmisoras de VIH por los mecanismos actualmente reconocidos. De la misma forma cuando no

exista esa evidencia confirmada de Ac VIH, no podrán considerarse portadoras del virus, aunque si concurren en dichas personas factores de riesgo, deberán aconsejarse la realización de pruebas adicionales. Por lo anteriormente expuesto resulta muy importante que los resultados de las pruebas serológicas de diagnóstico de VIH se expresen de forma clara y precisa para evitar situaciones diagnósticas confusas y ansiedad innecesaria en los individuos a los que se les realizan las pruebas serológicas. 9.1. PRUEBAS DE DIAGNOSTICO Los resultados de estas pruebas deberán expresar con claridad si el suero es positivo o reactivo para Ac VIH-1 o VIH-2, indicando, en los casos en que se utilice una prueba rápida (latéx aglutinación, dot-blot, etc.), la naturaleza de la misma. Asimismo, la expresión en unidades arbitrarias o en unidades de valor de corte añadida a la expresión cualitativa en las técnicas de EIA, indican una mayor o menor reactividad de la muestra con respecto al valor de corte obtenido y no una expresión numérica de la cantidad de anticuerpos presentes en el suero. En los resultados positivos y en los débilmente reactivos se indicará la necesidad de confirmar dicha reactividad. En los casos en que el laboratorio no realice pruebas confirmatorias adicionales, deberá indicarse la necesidad de confirmar el resultado de la prueba de cribado mediante otras técnicas. 9.2. PRUEBAS DE CONFIRMACION Los resultados de estas pruebas expresaran de forma inequívoca si el sujeto es positivo o negativo para Ac VIH. En los casos de sueros con resultados no interpretables o indeterminados en estas pruebas, se expresará claramente que la presencia de Ac VIH no ha sido confirmada, recomendándose en dichos casos un seguimiento serológico y remisión de nuevas muestras para confirmación por otras técnicas, esto es de especial aplicación para los resultados ilegibles en la confirmación por IFI. En los casos de WB indeterminados deberán expresarse las reactividades observadas con objeto de poder interpretar correctamente el seguimiento. 9.3. MARCADORES ESPECIFICOS DE VIH Los resultados de las pruebas de Ag p24 deberían expresarse como positivas y confirmadas por bloqueo. Es deseable la

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semi-cuantificación y su expresión en el informe, dados los fines para los que están destinadas. En los casos en los que dicha se solicite como ayuda en el diagnóstico precoz de la infección VIH en indiviudos seronegativos o con WB indeterminados deberá indicarse la necesidad de realizar pruebas de anticuerpos seriadas para llegar al diagnóstico serológico definitivo. Las pruebas de Ac p24 deberían expresarse de forma semi-cuantitativa (título, unidades, etc.) para poder ser objeto de seguimiento.

10. ESTRATEGIAS EN EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE LA INFECCION VIH: 10.1. PRINCIPIOS GENERALES En la actualidad, existen diferentes tipos de técnicas de detección de anticuerpos específicos VIH. La selección de la técnica o combinación de técnicas más apropiada dependerá de: a) objetivo de la prueba; b) sensibilidad y especificidad de las técnicas a utilizar y c) la prevalencia de la infección VIH en la población estudiada. Objetivos de la Determinación de Anticuerpos VIH La determinación de anticuerpos VIH se realiza con cuatro objetivos fundamentales: a) Cribado de los donantes de sangre, órganos, semen y óvulos. b) diagnóstico de la infección VIH. c) vigilancia seroepidemiológica de la infección VIH d) investigación. Sensibilidad y Especificidad del Diagnóstico Las técnicas de detección de anticuerpos con un elevado nivel de sensibilidad son las técnicas de elección en el cribado de donantes de sangre, óganos, semen y óvulos. Aquellas técnicas con un elevado nivel de especificidad serán las técnicas de elección en el diagnóstico de la infección VIH. Valores Predictivos del Diagnóstico La probabilidad de que una técnica de detección de anticuerpos VIH determine con certeza el verdadero estado de infección de un individuo, varía de acuerdo con a la prevalencia de infección VIH en la población de estudiada. Así, a mayor prevalencia de infección mayor probabilidad de que un resultado positivo signifique que el paciente se halla realmente infectado, es decir, la técnica poseerá un elevado valor predictivo

positivo (VPP). Sin embargo, poseerá un valor predictivo negativo (VPN) menor. Estrategias en la Determinación de Anticuerpos VIH En la actualidad, la O.M.S., recomienda tres estrategias que confieren un máximo de exactitud por un coste mínimo (tabla 9). La estrategía más apropiada, a cada situación, dependerá del objetivo de la prueba y de la prevalencia de infección VIH en la población. Estrategia I: determinación de anticuerpos mediante un único EIA o una técnica rápida/sencilla. Estrategia II: todas las muestras reactivas en una primera técnica, son realizadas de nuevo en una segunda técnica de principio o preparación antigénica diferentes. En caso de falta de reactividad del suero en la segunda técnica el resultado se considerará negativo. Estrategia III: todas las muestras reactivas en la segunda técnica de la estrategía II, son ensayadas de nuevo con una tercera técnica diferente a las anteriores. En caso de falta de reactividad del suero en la tercera técnica es obligado realizar un western blot. En las estrategias II y III, la prueba utilizada en primer lugar debe poseer la máxima sensibilidad y la utilizada en segundo lugar debe poseer la mayor especificidad. 10.2. ESTRATEGIA EN LA DONACION DE SANGRE/ORGANOS Con el objetivo de disminuir al máximo el riesgo de transmisión de la infección VIH mediante sangre transfundida, hemoderivados, semen, óvulos u órganos contaminados, desde 1987 es obligatoria la detección de anticuerpos VIH en todas las unidades a transfundir y en suero de donantes de semen, óvulos u órganos. Esto ha obligado a que los Bancos de Sangre incluyan protocolos de cribado para localizar y desechar las unidades presumiblemente contaminadas. La técnica de cribado indicada es aquella que presenta la máxima sensibilidad y tenga posibilidades de automatización con la finalidad de obtener resultados reproducibles de forma rápida y procesar un gran número de muestras al mismo tiempo. Actualmente, son las técnicas de enzimoinmunoanalisis (EIA) de 2ª y 3ª generación que incorporan antígenos de VIH-l y VIH-2 las que cumplen estos requisitos de forma más satisfactoria. Aunque en sentido estricto los Bancos de Sangre realizan sus competencias

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localizando y desechando aquellas unidades con pruebas de cribado claramente positivas o con valores próximos al punto de corte de la prueba (zona gris) (figura 1), su intervención debe comprender, además, los aspectos siguientes: a) envió de la muestra para confirmación del diagnóstico y b) localización del donante, explicación de la anormalidad analítica y derivación a la consulta correspondiente. Mención especial merece la detección de patrones serológicos con EIA positivo/zona gris/negativo (según el reactivo utilizado) y western-blot con patrón indeterminado en población sin antecedentes de exposición a VIH. Estudios de seguimiento de hasta 5 años y de investigación de presencia del virus (detección de ácidos nucleicos, aislamiento) indican que no existe relación entre este patrón y la infección VIH, en ausencia de antecedentes de riesgo. Sin embargo, en esta situación, la obligación es desechar la bolsa de sangre y las recomendaciones más aceptadas son: a) explicar al donante el hallazgo analítico; b) derivación a consulta donde pueda realizarse una historia clínicoepiderniológica, exploración, seguimiento serológico con muestras analizadas en paralelo a los 3 y 6 meses y explicación del cuadro analítico y consejo y c) en caso de patrón indeterminado mantenido en el western-blot, parece oportuno que la persona deje de ser donante de sangre. 10.3. ESTRATEGIA EN EL DIAGNOSTICO DE LA INFECCION VIH En la actualidad, prevalece la hipótesis de que el VIH, desde el momento en que penetra en el organismo humano, prolifera de una forma continua, aunque a velocidades diferentes según el estadío evolutivo de la infección. Se distinguen tres fases: a) primoinfección; b) asintomática, de varios años de duración, y c) sintomática, que clínicamente se corresponde con el complejo relacionado o el SIDA. Primoinfección VIH Una vez el VIH penetra en el organismo humano, por los mecanismos de transmisión actualmente reconocidos, inicia una replicación activa a consecuencia de la cual se desarrolla el cuadro clínico de la primoinfección, que suele ser asintomática o bien su sintomatología es tan leve que suele pasar desapercibida. No obstante, también puede manifestarse como un síndrome mononucleósico asociado o no a una meningitis o meningoencefalitis aguda o subaguda de tipo linfocitario, o una

neuropatía central o periférica o una depresión transitoria de la inmunidad celular. Las técnicas de PCR cualitativa pueden detectar en esta fase al VIH. Su cuantificación durante este momento de la infección permite valorar la evolución posterior de la misma. Durante esta fase y no antes de las 3-6 semanas después del contagio ("período ventana"), la infección puede ponerse de manifiesto serológicamente mediante la detección de los antígenos del virus, concretamente del antígeno p24 libre, por técnicas de enzimoinmunoanálisis (EIA). La aparición de anticuerpos suele acontecer alrededor de los 2-4 meses después de la exposición al virus, y salvo en raras ocasiones, persistirán durante toda la vida. A medida que aumenta el título de anticuerpos específicos frente a las proteínas de envoltura y de core, se produce una disminución paulatina de la concentración sérica de antígeno p24 libre hasta su total negativización en las técnicas de EIA, pero con frecuencia en los niños y ocasionalmente en los adultos coexisten títulos altos de antígeno y de anticuerpo. La estrategia diagnóstica ante la sospecha de primoinfección VIH incluirá necesariamente la detección de anticuerpos totales y antígeno p24 libre en sangre con las siguientes consideraciones: 1) Un resultado negativo frente a los dos marcadores citados de infección VIH puede ser debido a: a) la ausencia de infección o b) el paciente está en el "periodo ventana". En ambas situaciones se procederá a la realización de determinaciones seriadas de anticuerpos y de antígeno a las 2 y 4 semanas y a los 3 y 6 meses para confirmar la ausencia o presencia de infección VIH. 2) Un resultado de anticuerpos negativo con presencia de antígeno p24 libre en sangre, es indicativo de infección reciente, probablemente durante las 8 semanas anteriores. Se procederá a realizar determinaciones seríadas de anticuerpos y antígeno siguiendo la pauta indicada en el punto anterior. 3)Un resultado de anticuerpo positivo con ausencia de antígeno libre circulante, es diagnóstico de infección VIH completamente establecida. Fase Asintomática de la Infección VIH Esta fase se caracteriza por la presencia de anticuerpos y ausencia de antígeno p24 libre, o presencia intermitente, no mantenida, de dicho Ag. Esta fase puede durar años manteniendo dicho perfil sérico. Los diferentes estudios de seguimiento longitudinal de pacientes infectados indican

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que la probabilidad de que la infección progrese hacia estadíos más avanzados es baja en los primeros estadíos más avanzados es baja en los primeros 2-4 años de infección y aumenta considerablemente a partir de los 5 años, siendo de casi el 60% a los 10 años de haberse producido la infección y sin que, aparentemente, parezca haber diferencias importantes entre los distintos subgrupos importantes afectados. Los niveles de antígeno y anticuerpos varían enormemente entre individuos. Si el médico que sigue a un paciente infectado por VIH decide emplear marcadores séricos específicos víricos, debe conocer que son necesarios los test seriados para confirmar una tendencia.Así, los pacientes, en esta fase de la infección por VIH, deben monitorizarse para detectar cambios en el perfil serológico y establecer un pronóstico de evolución de la infección. Un descenso en el título de anticuerpos antip24 y/o la positivación del antígeno p24 libre en, por lo menos, dos muestras consecutivas, son un indicador de progresión de la infección. En el momento actual no existe una recomendación de amplio concenso sobre la cronología de detección de estos marcadores en la fase asintomática, por ello su determinación debe ser realizada en el contexto clínico individualizado teniendo en cuenta otros parámetros clínicos. Fase Sintomática de la infección VIH Esta fase se inicia a consecuencia de un aumento de la actividad replicativa del virus y se carazteriza por la positividad mantenida del antígeno p24 libre por técnicas de EIA, asociada, en un 60-70% de los casos, a un descenso en los niveles de anticuerpos antip24 manteniéndose positivos los anticuerpos frente a las proteínas de envoltura, y con una importante disminución de los linfocitos CD4(+). Clínicamente se manifiesta por la aparición de una grave alteración del estado general, infecciones oportunistas, ciertos tipos de neoplasias o de trastornos neurológicos, cuyo grado de evolución se clasifíca según los criterios de la O.M.S. (tabla 2 y 2 bis). El pronóstico vital a partir de este momento, aún con tratamiento específico antivírico es, en las mejores estimaciones, del 50-75% a los 365 días. La edad, el sexo, la actividad de riesgo a través de la cual se adquirió la infección y la forma de presentación (reflejo indirecto del grado de inmunosupresión) influyen en el pronóstico. Monitorización de Tratamiento Antiretroviral

Los pacientes en tratamiento anti-retroviral, presentan disminuciones de los niveles en suero del antígeno p24 libre estadísticamente significativos. El uso de PCR cuantitativa es en la actualidad el método recomendado para la monitorización de tratamiento antirretroviral. En Enero de 1997 la secretaría del Plan Nacional sobre el SIDA elaboró unas directrices que se recogen a continuación y en las tablas 10 y 11. FRECUENCIA DE REALIZACIÓN DE LA CARGA VÍRICA. Obtención de la muestra vasal en pacientes sin tratamiento antirretrovírico previo: Es muy recomendable realizar dos determinaciones vasales separadas por 2 a 4 semanas, en ausencia de procesos infecciosos, vacunaciones o patología intercurrente. Dado que las técnicas son complejas y la posible sobrecarga de los laboratorios con esta determinación, podría plantearse la alternativa de una muestra vasal única, al menos en las etapas iniciales de su introducción. Monitorización en los pacientes sin indicación de tratamiento antirretrovírico: Si un paciente no es tratado con antirretrovíricos, sería recomendable su monitorización con carga vírica cada 4 ó 6 meses (simultáneamente con recuento de linfocítos CD4), a menos que presente algún dato clínico de progresión de enfermedad. Monitorización en los pacientes que han iniciado recientemente tratamiento antirretrovírico: Si se dispone de muestra vasal previa al tratamiento y el paciente ha comenzado con antirretrovírico, tal como se recoge en el Documento del Consejo Asesor Clínico (C.A.C.) en su 3ª edición de noviembre de 1.996, se recomienda una determinación a los 2 meses cuando la pauta es de dos análogos de nucleosidos, y a los 3 ó 4 meses si la combinación incluye un inhibidor de proteasa. Tal como se especifíca en dicho documento, esta determinación puede realizarse a los tres meses, independientemente de la pauta utilizada, si ello facilita el seguimiento periódico de los pacientes. Monitorización de los pacientes en tratamiento prolongado con antirretrovíricos: En un paciente tratado con antirretrovíricos de forma estable se recomienda una determinación de carga vírica cada cuatro meses, a menos que presente algún dato

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clínico de progresión. Si en un paciente se realiza un cambio terapéutico en función de sus datos clínicos inmunológicos o virológicos, tal como se especifíca en el apartado nº 4 y en el documento del C.A.C antes citado, se recomienda una determinación previa de carga vírica, a los dos meses cuando la pauta es de dos análogos de nucleósidos, y a los 3 ó 4 meses si la combinación incluye un inhibidor de proteasa. Tal como se refiere previamente puede realizarse de una forma uniforme a los 3 meses, independientemente de la pauta utilizada, si ello facilita el seguimiento periódico de los pacientes. 10.4. ESTRATEGIAS EN SITUACIONES ESPECIALES Embarazo La transmisión vertical de la infección VIH es la responsable de más del 80% de los casos de SIDA en niños menores de 1 año de edad. El número creciente de mujeres infectadas que se hallan en edad fértil, conjuntamente con el importante aumento porcentual de la infección VIH por transmisión heterosexual, ha supuesto un importante incremento del SIDA en la poblacion infantil. Actualmente la probabilidad de transmisión vertical del VIH, a partir de una madre seropositiva, es del 13-20% en los países europeos. La determinación de anticuerpos VIH en las mujeres embarazadas se justifica por : a) posibilidad de interrupción del embarazo; b) modificación de la conducta obstétrica durante el parto, para evitar al máximo el riesgo de transmisión perinatal y c) medidas de atención al recién nacido. La recomendación mas ampliamente aceptada es realizar determinación de anticuerpos VIH en la mujer gestante cuando existan prácticas de riesgo. Sin embargo, los datos recientes demuestran que la identificación de la embarazada con prácticas de riesgo, presentes o pasadas, puede fallar, bien porque ésta no se identifica como adicta a drogas por vía parenteral o no es consciente del riesgo de la transmisión heterosexual por contactos sexuales previos con individuos seropositivos. En este sentido, estudios recientes demuestran, que hasta un 25% de las mujeres embarazadas VIH(+), desconocían haber estado expuestas a un riesgo de infección VIH. por ello, puede ser conveniente ofrecer esta prueba en el control serológico de la gestación. Es importante que esta oferta se acompañe del

consentimiento informado de la embarazada y de una adecuada información sobre la transmisión del virus. La implantación definitiva de este cribado serológico en un Area de Salud debiera precederse de un estudio tipo de prueba anónima no relacionada u otro que informe de la seroprevalencía existente,ya que en muchas zonas de nuestro país tal implantación no va a ser, probablemente, necesaría. Unicamente en aquellas mujeres seronegativas que presenten prácticas de riesgo persistentes se repetirá periódicamente la determinación, teniendo siempre en cuenta que se ha descrito transmisión en casos que presentaban resultados indeterminados en western blot. La determinación de anticuerpos VIH en las parejas que acuden a clínicas de esterilidad para fecundación asistida, se deberá realizar por razones obvias. Recién Nacidos de Madres Portadoras La terapia anti-retroviral instaurada precozmente en el tratamiento de la infección congénita, disminuyo el riesgo de aparición de infecciones oportunistas, incrementando, incluso, la supervivencia del niño infectado. Así, la detección precoz de la infección es especialmente importante Sin embargo, se halla dificultada por: a) presencia de anticuerpos específicos en todos los recién nacidos de madre seropositiva, a consecuencia de una transferencia pasiva de las IgG anti-VIH de la madre; b) persistencia de los anticuerpos maternos por encima de los 10 meses de edad; c) resultados falsamente negativos, durante los tres primeros meses de vida, en caso de infección perinatal y d) infección VIH en ausencia de seroconversión, debido a una importante hipogammaglobulinemia, a consecuencia de una disfunción de los linfocitos B. La estrategia de diagnóstico serológico en los hijos nacidos de madre seropositiva incluirá necesariamente la detección de anticuerpos totales VIH y antígeno p24 libre en sangre: 1) La presencia de infección VIH en el recién nacido se caracteriza por: a) La persistencia de anticuerpos VIH por encima de los 18 meses de edad; b) aparición, en sueros seriados, de nuevas bandas de reactividad en el Western Blot, a pesar de que su valor es inferior al anterior marcador; c) presencia de antígeno p24 libre en sangre. Este marcador de actividad replicativa del virus, suele asociarse con una evolución rápida de la infección hacía

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estadios sintomáticos. El principal problema en la determinación de antígeno p24 radica en que no se positiviza hasta que los anticuerpos anti-p24 del tipo IgG de la madre disminuyen o desaparecen de sangre, como consecuencia de la formación de inmunocomplejos antigeno-anticuerpo circulantes no detectados por las técnicas de EIA. En ésta situación el tratamiento del suero para disociar los inmunocomplejos (acidificación, guanidina, etc.) puede ser de gran ayuda y d) La disminución del nivel de anticuerpos anti-p24 seguido de un aumento de éstos, en el transcurso de uno o dos meses, podrá correlacionarse con la pérdida de anticuerpos maternos y la producción propia, de los mismos, por parte del niño infectado por vía vertical. Las dificultades derivadas de importante retraso en el diagnóstico de la infección VIH en los recien nacidos de madre seropositiva (18 meses), hace necesario la utilización futura de otros marcadores de infección no serológicos, como cultivo o amplificación genética (PCR). Accidentes con Riesgo de Exposición a VIH. La infección VIH en el Personal Sanitario, como resultado, aparentemente, de un accidente percutaneo con jeringuillas contaminadas, o de un contacto mucomembranoso con sangre o secreciones contaminadas, ha supuesto un motivo de preocupación en el Ambito sanitario. El riesgo de infección VIH a partir de un accidente percutaneo es del 0,1-0,7% mientras que a través de una exposición mucomembranosa el riesgo no se haya suficientemente bien determinado, sin embargo, es claramente inferior al anterior. Es necesario, por tanto, la adopción de protocolos de diagnóstico serológico para el personal sanitario con exposición accidental a VIH. Protocolo de Actuación Después de una Exposición Accidental a Productos Biológicos Probablemente Contaminados: Se podrá considerar como criterio de inclusión en protocolo de seguimiento en caso de accidentes percutáneos o mucomembranosos con: -Fuente con infección VIH conocida. -Fuente Conocida VIH(-): En caso de duda razonable de exposición reciente o por decisión individual del sanitario accidentado. -Fuente Desconocida con Antecedentes de Prácticas de Riesgo.

-Fuente Desconocida sin Antecedentes de Prácticas de Riesgo: Decisión individual del sanitario accidentado. El protocolo de segumiento serológico del accidentado incluirá: 1º. Determinación de anticuerpos VIH en el momento del accidente, que en caso de ser positivos son indicadores de infección anterior no asociada a la exposición accidental. 2º. A las 2 y 6 semanas: Determinación de antígeno-p24, cuya positivización en un indicador de infección. Un resultado negativo no aporta ninguna información. 3º. A los 3 meses: Determinación de anticuerpos específicos, que en el caso de ser positivos son indicadores de infección. 4º. Si el resultado anterior fuera negativo deberá repetirse la determinación de anticuerpos a los 6 meses. 5º. A los 12 meses: Si la determinación de anticuerpos se mantiene negativa puede asegurarse que no ha habido transmisión de VIH a través de la exposición accidental. Existe controversia sobre la necesidad de una última determinación a los 18-24 meses de la exposición. En la Vigilancia de la Infección VIH En los estudios de seroprevalencia, el marcador de infección VIH deberá ser la detección de anticuerpos específicos VIH, cuya determinación se realizará de acuerdo con la prevalencia de infección VIH esperada en la población objeto de estudio (tabla 9).

11. CRITERIOS GENERALES PARA LA REALIZACION DE PRUEBAS VIH. La realización de pruebas VIH y las circunstancias que la rodean, hacen necesario establecer unos criterios generales para su utilización: A)DEL CENTRO SANITARIO 1. Consentimiento Informado. Cada Centro Sanitario debería disponer de un "Documento de Consentimiento Informado" que deberán firmarlo el médico y el paciente. 2. Confidencialidad. Los resultados deberán transmitirse de forma que no se vulnere el principio de confidencialidad. 3. Consejo y Educación Sanitaria antes y después de la indicación y realización de una prueba de diagnóstico de la infección por VIH. 4. Indicaciones Legales. En la actualidad, la realización de pruebas VIH es obligatoria en la donación de productos biológicos de

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origen humano, así como también por indicación judicial en caso de violación. B) DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOnGIA CLINICA 1. Confidencialidad. Los resultados deberán transmitirse de forma que no se vulnere el principio de confidencialidad. 2. Normas de Buena Práctica.

12. DISPOSICIONES LEGALES Resolución de 6 de septiembre de 1985 de la Subsecretaría de Sanidad y Consumo, por la que se declara obligatoria la prueba de detección de anticuerpos frente al virus asociado a la linfadenopatía/tipo III de virus linfotrópico T humano (LAV/HTLVIII) asociado al Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, por las industrias fraccionadoras de plasma y los fabricantes e importadores de hemoderivados. (BOE de 10 de Septiembre de 1985). Resolución de 20 de Marzo de 1987 de la Subsecretaría de Sanidad y Consumo, por la que se establece el procedimiento y la documentación necesaria para obtener autorización de los reactivos, para realizar pruebas de detección de marcadores de infección por virus humanos de la familia Retroviridae, entre ellos las pruebas de selección de anticuerpos frente a los virus asociados al Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) y la detección de los antígenos correspondientes a los mismos. (BOE de 28 de Marzo de 1987). Resolución de 11 de Septiembre de 1989 de la Subsecretaria de Sanidad y Consumo, por la que se regula la realización de procesos de investigación controlada de reactivos para la detección de marcadores de infección por virus humanos de la familia Retroviridae, entre ellos los asociados al Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). (BOE de 16 de Septiembre de 1989). Orden Ministerial de 18 de Febrero de 1987 del Ministerio de Sanidad y Consumo, sobre pruebas de detección de VIH en las donaciones de sangre. (BOE de 20 de Febrero de 1987). Orden Ministerial de 24 de Junio de 1987 del Ministerio de Sanidad y Consumo, sobre pruebas de detección anti-VIH en materia de obtención, extracción, trasplante, injerto o implantación de órganos humanos. (BOE de 14 de Julio de 1987). Orden Ministerial de 15 de Junio 1988 del Ministerio de Sanitaria y Consumo, para

la coordinación de actuaciones y control del VIH en las intervenciones médicas para la obtención y recepción de semen. (BOE de 24 de Junio de 1988). Real Decreto 478/1993 de 2 de Abril por el que se regulan los medicamentos derivados de la sangre y plasma humano. (BOE de 7 de Mayo de 1993). Real Decreto 1854/1993 de 22 de Octubre, por el que se determinan con carácter general los requisitos técnicos y las condiciones mínimas de la hemodonación y bancos de sangre. (BOE del 20 Noviembre de 1993).

13. BIBLIOGRAFIA SELECCIONADA 1.Brun-Vezinet PC. Methodes diagnostiques de l'infection par VIH. En: Montaignier L, Rozenbaum W, Gluckman JC, eds. SIDA et infection par VIH. Paris, Flammarion, 1989; 145-157. 2.- Campos JM. Laboratory methods for early detection of human immunodeficiency virus type 1 in newborns and infants. Cli. Microbiol. Rev. 1992; 5:238-247. 3.- Center for Disease Control. Interpretation and use of the Western blot assay for serodiagnosis of human immunodeficiency virus type I infections. MMWR 1989; 38:1-7 4.- Consortium for Retrovirus Serology Standardization. Serological diagnosis of human immunodeficiency virus infection by Western blot, JAMA 1988; 260:674-679. 5.- Hammer S, Crumpacker C, D'Aquila R, Jackson B, Lathey S, Livnat D and Reichelderfer P. Use of virologic assays for detection of human immunodeficiency virus in clinical trials: recommendations of the AIDS Clinical Trials Group Virology Committee. J.C1in.Microb. 1993; 31:25572564. 6.- The European Collaborative Study. Mother to child transmission of HIV infection. Lancet 1988; 3:381-395. 7.- Fahey JL, Taylor J, Detels R, et al. The prognostic value of cellular and serologic markers in infection with human immunodeficiency virus type 1. N. Engl. J. Med. 1990; 322:166-172. 8.- Harry DJ, Jennings MB, Yee J, Carlson JR. Antigen detection for human immunodeficiency virus. Clin. Microbiol. Rev. 1989; 2:241-249.

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9.- Hollinger PB, Bremer JW, Myers LE, et al. Standardization of Sensitive Human Immunodeficiency Virus Coculture Procedures and Establishment of a Multicenter Quality Assurance Program for the AIDS Clinical Trials Group. J, Clin. Microbiol. 1992; 30:1787-1794. 10.- Jackson JB, Balfour RH. Practical diagnostic testing for human immunodeficiency virus. Clin. Microbiol. Rev. 1988; 1:124-138. 11.- Jacobson MA, Bachetti P, Kolokathis A, et al. Surrogate markers for survival in patients with AIDS and AIDS related complex treated with zidovudine. Br. Med. J. 1991; 302:73-78. 12.- Kelinman S, Fitzpatrick L, Secord K et al. Follow-up testing and notification of antiHIV Western blot atypical (indeterminant) donors.Transfusion 1988; 28:280-282. 13.- Levy JA. Pathogenesis of human immunodeficiency virus. Microbiol. Rev. 1993; 183- 289. 14.- Nishanian P, Huskins KR, Stehn S, et al. A simple method for improved assay demonstrates that HIV p24 antigen is present as immune complexes in most sera from HIV-infected individuals. J. Infect. Dis. 1990; 163:21-28. 15.- Soriano V. Gutierrez M, Tuset C, Martinez-Zapico R, Ortiz de Lejarazu R,

Aguilera A, Codina G, Gonzalez A, Ulloa F, Leal M, Fernandez JL y Grupo Español para el estudio del VIH-2. Estudio multicéntrico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2) en España (1991). Med.Clin.(Barc) 1993; 100:531-535. 16.- Ortiz de Lejarazu R, Eiros JM, Rodriguez-Torres A. Diagnóstico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana. Enf. Infec. y Microbiol. Clin. 1991; 9:Spl.1 18-31. 17.- Phair JP, Wonsky S. Diagnosis of infection with the human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis. 1989; 159:320-323. 18.- Pumarola T. El síndrome de la ininunodeficiencia humana. En: Prats G. ed. Enfenmedades Infecciosas (Monografías Medicine). IDEPSA sa, Barcelona 1992; 5373. 19.- WHO. AIDS. Proposed WHO criteria for interpreting results from Western blot assays for HIV-1, HIV-2 and HTLV-IIHTLV-lI. Wkly. Epidem. Rec. 1990; 65:281-283. 20.- WHO. Global Programme on AIDS. Recommendations for the selection and use of HIV antibody rest. Wkly. Epidem. Rec. 1992; 67:145-1 52. 21.- Olajide O. HIV- 1 indeterminate Western Blot results: Implications for diagnosis and subject notification. Clin.Microb.Newslet. 1992; 14:121-126

TABLA 1 CLASIFICACION DE LOS RETROVIRUS HUMANOS*

GENERO ONCOVIRUS DE MAMIFEROS TIPO B ONCOVIRUS DE MAMIFEROS TIPO C RETROVIRUS TIPO D RETROVIRUS AVILARES TIPO C VIRUS ESPULMOSOS GRUPO HTLV-BLV LENTIVIRUS

FAMILIA RETROVIRIDAE SUBGENERO/ESPECIE

- Virus Linfotrófico de Células T humanas tipo 1 y 2 (HTLV1 y 2) VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA DE PRIMATES - Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipos 1 y 2 (VIH1 y 2) - Virus de la Inmunodeficiencia de los Simios (VIS)

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*Classification and Nomenclature of Viruses. Fifth Report of the International Committee on Taxocomy Edited by Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. Arch. Virol. Sp1.2. 1991 TABLA 2 CLASIFICACION DE LA O.M.S. DE LA INFECCION POR VIH EN LOS ADULTOS* ESTADIO 1 Paciente asintomático Adenopatías generalizadas persistentes Nivel 1: asintomático, actividad normal ESTADIO 2 Pérdida de peso de menos del 10% del peso habitual Manifestaciones cutáneas mínimas (dermatitis seborreica, prurito, onicomicosis, úlceras orales, quielitis angular) Herpes zoster durante los últimos 5 años Infecciones respiratorias altas recurrentes Y/o nivel 2: presencia de síntomas, actividad normal ESTADIO 3 Pérdida de peso de más del 10% del peso habitual Diarrea crónica no explicada de más de 1 mes de evolución Fiebre prolongada (constante o intermitente) no explicada de más de 1 mes de evolución Candidiasis oral vellosa Tuberculosis pulmonar durante el último año Infecciones bacterianas severas Y/o nivel 3: paciente encamado menos del 50% del tiempo el último mes ESTADIO 4 Pérdida de más del 10% del peso habitual más diarrea crónica (>1 mes) no explicada o debilidad crónica y fiebre crónica (>1 mes) no explicada Neumonía por P.carinii Toxoplasma cerebral Criptosporidiosis con diarrea de más de 1 mes Criptococosis extrapulmonar Enfermedad por CMV con afectación de otros órganos aparte del hígado, bazo y ganglios linfáticos Infección mucocutánea por virus del herpes simple de más de 1 mes de duración o visceral de cualquier duración Leucoencefalopatía multifocal progresiva Cualquier micosis endémica diseminada Candidiasis esofágica, traqueal, bronquial o pulmonar Infección diseminada por micobacterias atípicas Sepsis por Salmonella sp. diferente a S. Typhi Tuberculosis extrapulmonar Linfoma Sarcoma de kaposi Encefalopatía por VIH Y/o nivel 4: paciente encamado más del 50% del tiempo el último me *.- Wky Epidem Rec 1990; 65:221-8 TABLA 2 BIS CLASIFICACIÓN DE LA INFECCIÓN POR EL VIH CD4 CATEGORIA CLÍNICA >= 500/MM³ A1 B1 200-499 mm³ A2 B2 10% 10% 750.000)

3,5-28% 9-45% 18-43% (consultar bibliografía) B no/? no/? 200 µl

NASBA HIV-1 RNA QUANTIPLEX QT HIV RNA v.2 Amolificación isotérmica Amplificación de señal por hibridación molecular del ARN 500-240 4.000 (con 100 µl) 400 (con 1 ml) 7 500-800.000 400-10 (diluir si>800.000)

10³ UFC/ml de un solo microorganismo de los habituales debe considerarse positivo. Si el recuento es 100.000 UFC/ml de un único microorganismo considerado patógeno, en las muestras de orina obtenidas por micción espontánea a primera hora de la mañana durante

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dos días consecutivos, en ausencia de sintomatología clínica. En general y con fines prácticos se diagnosticará como bacteriuria asintomática la existencia de un único urocultivo >100.000 UFC/ml de un patógeno reconocido. La bacteriuria asintomática debe ser estudiada en todas las gestantes y el momento ideal es la semana 16. Si en este momento la bacteriuria es negativa no se recomienda practicar nuevo estudio, excepto en mujeres con infecciones urinarias recurrentes o anomalías importantes del tracto urinario. Para detectar la bacteriuria asintomática es necesario cultivar la orina, ya sea mediante el método convencional de siembra en medios de cultivo ya sea mediante un método automatizado. No es aceptable su despistaje mediante microscopia debido a su baja sensibilidad o mediante las tiras reactivas debido a que con frecuencia la esterasa leucocitaria y los nitritos serán negativos por la elevada proporción de bacteriurias asintomáticas que cursan sin piuria y por los agentes etiológicos incapaces de reducir los nitratos a nitritos. 3.4.3. Métodos microbiológicos Para el diagnóstico tanto de la bacteriuria asintomática como de cistitis y pielonefritis se realizará un urocultivo cuantitativo y cualitativo por los procedimientos convencionales de cada laboratorio. A la bacteriuria asintomática se le exigirá un recuento > 100.000 UFC/ml, mientras que a cistitis y pielonefritis recuentos mucho más bajos (³ 100 UFC/ml) pueden ser significativos siempre que exista garantía de una correcta recogida de la orina y aparezca en el cultivo un solo microorganismo acompañado de leucocituria y/o síntomatología clínica. Puesto que en la orina de la embarazada es importante detectar Streptococcus agalactiae se recomienda añadir un medio donde pueda detectarse este microorganismo claramente, puede ser incluso un medio selectivo-diferencial. Ante la presencia de microorganismos de patogenicidad dudosa como Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum o ciertos estreptococos, se practicará una valoración cuidadosa sopesando si el cultivo es puro o mixto, abundante o escaso, etc; la mayoría de estos casos traducirán condiciones precarias en la recogida de la orina. Cuando entre esta flora contaminante se encuentre Gardnerella vaginalis o Streptococcus agalactiae deberá constar en el dictamen, a fin de alertar al clínico sobre la presencia vaginal de microorganismos causantes de parto prematuro y sepsis perinatal. 4. DIAGNÓSTICO Y PREVENCIÓN DE LA CORIOAMNIONITIS

Se denomina corioamnionitis (CA) a la infección del útero y su contenido (liquido amniótico - LA, feto y anejos), durante la gestación. Si la infección es sintomática se denomina CA clínica o infección intraamniótica (1 - 10% de los partos). Existe también la CA subclínica de la cual el parto prematuro puede ser el primer signo, incluso en ausencia de rotura de membranas (RPM). Mas frecuentemente existe (20% de los embarazos) la CA histológica que suele diagnosticarse únicamente en el estudio posparto y tiene escasa repercusión materna y fetal. 4.1. PATOGENIA DE LA CORIOAMNIONITIS La CA se produce la mayoría de las veces por vía ascendente, sobre todo tras una rotura de membranas; con menor frecuencia por vía hematógena o como consecuencia de maniobras uterinas como amniocentesis (1 por 1000), cerclaje cervical (1 - 2 por 1000), etc. Las mujeres de mayor riesgo para padecerla son las muy jóvenes, primagrávidas, malnutridas y de nivel socioeconómico bajo. Esta también asociada a enfermedades crónicas, bacteriuria asintomática e infección urinaria durante el embarazo, así como a vaginocervicitis tanto asintomáticas como sintomáticas. Las mujeres que han padecido parto prematuro, RPM, etc., en ges-taciones previas presentan mayor riesgo de padecerla en la gestación actual. Se han aislado microorganismos en corion hasta en el 60% de mujeres con parto prematuro y membranas intactas, y del LA de 10 - 15% de mujeres sin trabajo de parto y membranas intactas. La incidencia de CA en partos prematuros puede llegar al 30% y por lo tanto debería descartarse la existencia de CA en todas las amenazas de parto prematuro (APP), incluso sin RPM. La CA es la acompañante habitual del 30 -40% de RPM, siendo esta última el mayor factor de riesgo para complicaciones obstétricas, infección perinatal, y responsable del 25 - 50% de los partos prematuros. Se sabe que la infección vaginal y/o cer-vical puede causar CA subclínica y que ésta puede pasar a infección del LA e infección fetal directa. Por otro lado, la actividad de las enzimas bacterianas en LA puede aumentar la síntesis de prostaglandinas aumentando así las contracciones uteri-nas que producen dilatación cervical y aumento de la presión amniótica que puede producir RPM, y parto prematuro. La pro-pia acción de los patógenos en la cervicitis puede causar alteración de las membranas ovulares produciendo fragilidad ovular y posterior RPM. 4.2. ETIOLOGÍA DE LA CORIOAMNIONITIS

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La coriamnionitis suele ser de naturaleza polimicrobiana con predominio de los componentes de la flora del tracto genital femenino. Otros microorganismos menos frecuentemente implicados son: C. trachomatis, Neisseria gonorrhoeae. Micoplasmas genitales, solos o en asociación con flora de la implicada en vaginosis bacteriana. Enterobacterias, Streptococcus spp y anaerobios son los microorganismos más frecuentemente hallados como causa de CA, pero no se sabe en que medida la colonización vaginal por enterobacterias, estreptococo grupo B, Haemophilus spp, etc., puede influir en el desarrollo de CA, aunque hay estudios que asocian esta situación con APP, RPM e infección perinatal materna y neonatal. Por todo esto, no hay recomendaciones internacionales que apoyen la investigación sistemática de estos microorganismos en exudados vaginales, reservándolo para las pacientes sintomáticas, o de alto riesgo obstétrico en embarazos previos o en el actual. 4.3. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE CORIOAMNIONITIS Se sospecha CA si existen 2 de los siguientes signos o síntomas: a - En la madre: temperatura > 38º C , Leucocitosis > 15000/mm³ con desviación izquierda (si la paciente está con corticoides, los leucocitos pueden estar aumentados hasta 48 horas tras su administración, pero no hay desviación izquierda), proteína C reactiva elevada. b - En LA : LA purulento, tinción de Gram con microorganismos, glucosa < 10 mg/ 100 ml, > 50 leucocitos por campo, esterasa leucocitaria. c - En el feto : taquicardia basal con o sin disminución de la variabilidad (no útil si a la madre se administran tocolíticos betamiméticos ). Los signos clínicos de infección pueden estar ausentes en el momento de la evaluación inicial, sobre todo ante una APP con membranas intactas. La amniocentesis puede ser apropiada para detectar la presencia de CA ocultas, sobre todo si la edad gestacional es compatible con la viabilidad fetal. La utilidad de este procedimiento para esta indicación es controvertida debido a la alta tasa de falsos positivos y falsos negativos. La amniocentesis además puede ser difícil cuando hay RPM por la disminución del LA. Para valorar los resultados del LA este debe ser obtenido con técnicas que eviten la contaminación con la flora vagino-cervical normal o con la de la piel

abdominal, usando para eso catéter de presión itrauterina, amniocentesis transabdominal en condiciones estériles o aspiración con aguja en el momento de la cesárea. Mientras no haya mas evidencia de su utilidad en la mejora del manejo de estas situaciones, no se considera que deba recomendarse de rutina y habría que individualizar los casos en los que pueda ser realmente necesaria. En el manejo microbiológico de la sospecha de CA (también en APP y en RPM) puede ser útil hacer cultivo vaginorectal para EGB, Tinción de Gram y cultivo de exudados vaginal y cervical, buscando los microorganismos antes citados y la vaginosis bacteriana. De todas formas, la presencia de estos microorganismos en la vagina o el cérvix no implica necesariamente que estos sean los causantes de la CA, pero sí pueden ayudar en el manejo clínico de la CA en la madre, y en la evaluación y manejo posterior del neonato. La detección de infección urinaria o bacteriuria asintomática en la gestación y su tratamiento adecuado disminuye significativamente las complicaciones anteriores. 4.4. PREVENCIÓN DE LA CORIOAMNIONITIS En la prevención de la CA esta indicada la detección de infecciones vagino-cervicales en aquellas pacientes seleccionadas por su especial riesgo, sobre todo de aquellas entidades y/o microorganismos que se han visto mas asociadas a dicha patología, como C. trachomatis (hasta diez veces mas frecuente RPM y PP), N. gonorrhoeae, mycoplasmas y flora de vaginosis bacteriana. Son las proteasas, elastasas y colagenasas producidas por estas bacterias las que son capaces de disminuir la resistencia de las membranas ovulares. Las peroxidasas que también producen bacterias como el estreptococo grupo B (EGB), originan radicales libres que provocan la rotura de enlaces de colágeno y necrosis tisular. Además, la infección provoca una disminución de PH que inactiva las inmunoglobulinas del moco cervical, el cual pierde sus propiedades de barrera protectora. Por tanto , el papel del obstetra en la prevención de la CA es el diagnostico de las infecciones del tracto geniturinario en la gestante y su tratamiento adecuado, y la identificacción precoz de la APP, RPM, así como los marcadores indirectos de CA por métodos biológicos, bioquímicos o clínicos, donde se encuadra también la búsqueda de nuevo de las infecciones implicadas y su tratamiento. 5. INFECCIÓN ADQUIRIDA EN EL CANAL DEL PARTO Durante el embarazo y hasta la rotura de membranas el entorno del feto es normalmente estéril. Staphylococcus epidermidis, lactobacilos,

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difteroides, estreptococos alfa hemolíticos y anaerobios estrictos están presentes en la practica totalidad de flora vaginal de la mujer adulta sana. Con menor frecuencia aparecen Gardnerella vaginalis, enterococos , Streptococcus agalactiae (estreptococos grupo B, EGB), enterobacterias y mas raramente están presentes otros microorganismos como Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae y Streptococcus pneumoniae. Aunque el feto puede infectarse aún cuando las membranas están íntegras, es desde que las membranas se rompen y hasta que el parto finaliza cuando habitualmente queda expuesto a estos microorganismos que inician la colonización del tracto respiratorio y gastrointestinal. Si el parto se retrasa tras la rotura de membranas los microorganismos de la vagina puede ascender y colonizar o infectar al feto y a la placenta. El recién nacido (RN) se coloniza inicialmente en piel y mucosas y en la mayoría de los casos los microorganismos proliferan sin causar infección y la microbiota normal se establece sin incidentes, sin embargo una minoría de RN desarrollan infección causadas por estos microorganismos. Los RN que desarrollan sepsis bacteriana presentan con frecuencia factores de riesgo que son más raros en aquellos que no resultan infectados. Los más importantes son: bajo peso, parto prolongado con hipoxia perinatal, rotura prematura y prolongada de membranas, fiebre y o leucocitosis en la madre, infección maternal periparto, vaginitis y/o cervicitis (sintomáticas o asintomáticas), infección del tracto urinario o bacteriuria asintómatica por EGB, e hijo anterior con infección por EGB (lo que habitualmente traduce un déficit de anticuerpos maternos frente a EGB). Los microorganismos adquiridos durante el paso por el canal parto que más frecuentemente ocasionan infección en el RN son EGB, Escherichia coli, Ureaplasma urealyticum S. pneumoniae, Neisseria gonorreae, Chlamydia trachomatis, Listeria monocytogenes y algunos virus que también pueden estar presentes en las secreciones genitales (Herpes simplex, Varicela, Papilomavirus, Citomegalovirus, Hepatitis B ó VIH). 5.1. INFECCIÓN CAUSADA POR Streptococcus agalactiae EGB se encuentra en la vagina o anorecto en el momento del parto en un 15 - 20% de las embarazadas de nuestro país, siendo la tasa de transmisión vertical madre / RN del orden del 50%.

En ausencia de medidas de prevención un 3 por cada mil RN pueden ser infectados por EGB a su paso por el canal del parto desarrollando una infección neonatal severa (sepsis precoz). Actualmente la única medida de eficacia probada para prevenir el desarrollo de sepsis neonatal precoz por EGB es la aplicación en el momento del parto de profilaxis antibiótica a las madres portadoras. Para detectar las madres portadoras debe efectuarse un cultivo tomando un escobillón vaginal y otro anorrectal (o un escobillón vaginorectal). La frecuencia comunicada de sepsis neonatal por EGB documentada por hemocultivo en el grupo de hospitales del Grupo Castrillo en los años 1995, 1996 y 1997 (cuando aún no se habían implementado las estrategias de prevención) fue del 1,3 ‰ RN (con una tasa total de sepsis en RN del 2,5 ‰). En los años 1999 - 2000 después de la publicación del protocolo SEGO/SEIMC esta frecuencia de sepsis por EGB bajó al 0.4 ‰. 5.1.1. Detección de portadoras Se recomienda estudiar la colonización vaginorectal de forma universal como screening entre la 35 y 37 semana de gestación, preferentemente en la 35 semana y siempre que exista sospecha de corioamnionitis. Estos escobillones se siembran en medio líquido de enriquecimiento selectivo para EGB (p.ej.: BHI con gentamicina y ácido nalidíxico, Todd-Hewitt) y tras incubar 18 - 24 horas se efectúa subcultivo a agar sangre y posteriormente las colonias betahemolíticas son identificadas como EGB usando antisueros específicos, sin olvidar que entre un 7 - 10% de los EGB son no hemolíticos . Una alternativa más cómoda es sembrar los escobillones directamente en "medio Granada", incubándolas en anaerobiosis 18 a 24 horas donde EGB produce colonias naranjas o rojas diagnósticas de EGB. Si se desea maximizar la detección de portadoras puede utilizarse además de la siembra directa en Granada un caldo de enriquecimiento selectivo, y efectuar subcultivo en agar sangre o medio Granada, si la placa directa fue negativa. Actualmente y por la posibilidad de falsos resultados negativos se desaconseja la utilización de las técnicas de detección de antígeno para diagnóstico de embarazadas portadoras vaginales de EGB. Sin embargo en el futuro estas pruebas podrían ser de utilidad si se consigue resolver los problemas derivados de su falta de sensibilidad. Una posible alternativa al cultivo para detectar las madres colonizadas por EGB es la utilización de técnicas moleculares. Se ha señalado que la técnica de PCR en tiempo real podría identificar

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las gestantes colonizadas en el momento del parto. Ello evitaría el problema logístico que supone el screening general de las embarazadas en la semana 35 - 37. Sin embargo el costo del instrumental necesario y la necesidad de garantizar la disponibilidad continua de la técnica como procedimiento urgente capaz de proporcionar resultados inmediatos hacen difícil (por ahora) la adopción generalizada de este sistema. 5.1.2. Prevención de sepsis neonatal por S. agalactiae A los siguientes grupos de embarazadas se les deberá administrar profilaxis antibiótica para prevenir la infección neonatal precoz por EGB: - A toda gestante con colonización positiva - Si durante la gestación se detectó bacteriuria (sintomática o asintomática) por EGB. - Si existe el antecedente de un hijo previo con sepsis por EGB, independientemente del estado de colonización. - Parto prematuro con edad gestacional menor de 37 semanas si no se conoce su estado de portadora de EGB. - Si están presentes uno de los factores de riesgo siguientes: fiebre intraparto (>38º C) y/o rotura de membranas ovulares superior a 18 horas (de acuerdo con el protocolo SEGO/ SEN/SEIMC y el protocolo CDC). Para la prevención de sepsis por EGB se recomienda administrar al comienzo del trabajo del parto (al menos 4 horas antes del expulsivo, ya que en caso contrario disminuye su eficacia) una de las dos pautas siguientes: a) Penicilina G intravenosa, 5 millones de UI y repetir 2,5 millones de UI cada 4 horas hasta su finalización. b) Ampicilina intravenosa (solo si no se dispone de penicilina), 2 g y repetir 1 g cada 4 horas hasta su finalización. En caso de alergia a betalactámicos: Clindamicina intravenosa 900 mg, cada 8 horas o Eritromicina intravenosa 500 mg, cada 6 horas hasta la finalización del parto. En caso de corioamnionitis sin conocer microorganismo o rotura prolongada de membranas (> 18 horas) se utilizará ampicilina + gentamicina o una Cefalosporina de (cefotaxima) o Amoxicilina-clavulánico.

Dado que la infección por EGB afecta casi siempre a RN cuyas madres presentan bajo nivel de anticuerpos frente a la cepa colonizante se han desarrollado vacunas de polisacáridos capsulares (conjugados con proteínas) o proteicas que administradas a la madre elevan su nivel de anticuerpos protectores y teóricamente protegerían al RN. Aunque este enfoque es muy prometedor la dificultad de comprobación de la eficacia e inocuidad de estas vacunas hace difícil su disponibilidad en un futuro próximo. 5.2. OTROS MICROORGANISMOS 5.2.1. Enterobacterias Hoy día los avances de la perinatología han hecho que nazcan y sobrevivan RN muy prematuros y estos RN son muy susceptibles a las infecciones incluyendo las de transmisión vertical. Actualmente es materia de preocupación la aparición de infección en estos RN prematuros causadas por bacterias entéricas resistentes, fundamentalmente E. coli. La infección del RN por bacterias entéricas resistentes puede estar favorecida por el uso abusivo de antibióticos en la madre, sobre todo después de la rotura de membranas, por ello se debe ser muy prudente con la utilización prolongada de antibióticos en estas circunstancias. Respecto a cuando se detecta E. coli, H. influenzae de forma abundante colonizando la vagina, se ha visto que esta asociado a mayor morbilidad materna y neonatal, pero no está establecido en protocolos actuales la utilidad de la intervención en estos casos, aunque sí debe tenerse en cuenta si se presentan factores de riesgo como fiebre intraparto, RPM , parto pretérmino o signos de infección neonatal, valorándose el uso de antibióticos en la madre y/o en el recién nacido de acuerdo a estos datos. En caso de exudado vaginal positivo por Escherichia coli sensible a ampicilina se utilizará como profilaxis ampicilina 2 g. IV, seguidos de 1 g. IV cada 4 horas hasta el expulsivo. 5.2.2. Infección causada por Ureaplasma urealyticum Ureaplasma urealyticum se encuentra en la vagina del 40 a 80% de mujeres sanas, siendo la tasa de transmisión vertical del 20 al 50%, la colonización del RN normalmente es transitoria pero U. urealyticum es capaz de causar neumonía en el feto y RN, especialmente en los muy prematuros o de muy bajo peso (menor de 1.250 g). Así mismo la infección del RN por U. urealyticum se relaciona con el desarrollo de enfermedad pulmonar crónica en el RN de muy bajo peso.

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Dada la alta frecuencia con que U. urealyticum se aísla del tracto genital femenino y del RN sano el screening sistemático no esta justificado. En cambio la investigación de U. urealyticum estaría justificada en RN prematuros (menos de 32 semanas de edad gestacional, peso inferior a 1.250 g) si aparece distress respiratorio en el momento del nacimiento o ante un cuadro de neumonía o sepsis en ausencia de una etiología definida. Dichas infecciones neonatales pueden ser autolimitadas, pero existen estudios que indican que el tratamiento del recién nacido acorta la evolución clínica.

en pacientes de riesgo obstétrico en el actual embarazo o en anteriores. Este protocolo no avala una pauta única de comportamiento. Otras alternativas pueden ser también adecuadas de acuerdo con las circunstancias particulares de cada centro asistencial y el juicio de los clínicos implicados en la atención de cada caso.

5.2.3. Microorganismos de ETS

6.1. ENDOMETRITIS POSTPARTO 6.1.1. Introducción

En las mujeres de alto riesgo para ETS, (< 20 años, sin pareja estable, etc.), así como en las que presentan síntomas de infección genital, y sobre todo en mujeres procedentes de países en vías de desarrollo se debería descartar ETS al menos una vez en la gestación (CDC), ya que están asociadas a morbilidad materna y neonatal. C. trachomatis produce conjuntivitis y neumonitis en el recién nacido, y amnionitis, endometritis postparto, etc. N. gonorrhoeae produce conjuntivitis y sepsis neonatal, además de infecciones perinatales en la madre. La colonización vaginal porCandida spp. en las gestantes se asocia a muguet del recién nacido por lo que debe tratarse tópicamente a la madre antes del paso del RN por el canal del parto, sobre todo en pretérminos y RN de bajo peso donde puede producirse un diseminación de las candidas a partir de la piel, orofaringe etc. Existe gran debate respecto a como afecta la vaginosis bacteriana al curso de la gestación, no habiéndose llegado a ningún acuerdo sobre si debe o no hacerse detección sistemática, ya que hay estudios que la asocian a parto pretérmino y a mayor morbilidad materna y fetal. Hoy día sólo está establecido su investigación en presencia de síntomas de infección genital, o en pacientes de riesgo obstétrico en el embarazo actual o en embarazos anteriores. 5.3. CONCLUSIONES: PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS DE COLONIZACIÓN / INFECCIÓN DEL CANAL DEL PARTO - Todas las mujeres. Detección de S. agalactiae entre la semana 35 - 37 de gestación en exudado vagino-rectal. - Mujeres con síntomas de infección genital y mujeres de alto riesgo para ETS (incluso asintomáticas): tinción de Gram y cultivo de exudado vaginal y exudado endocervical para detección de ETS. Valorar con cautela la presencia abundante de cualquier microorganismo que desplace la flora vaginal normal, sobre todo

6.- INFECCIÓN PUERPERAL Las infección puerperal incluye tres situaciones principalmente, la endometritis postparto, la infección de la episiotomía y la mastitis puerperal.

La infección del útero postparto es la causa más común de fiebre puerperal y se designa según la extensión de la enfermedad como endometritis, endomiometritis o endoparametritis. La cesárea es la situación más predecible de endometritis postparto (EPP), especialmente despúes de la ruptura de membranas de cualquier duración. El rango de incidencia de EPP después del parto vaginal es de 0,9 a 3,9% y de cesárea de 10 a 50%. Los factores predisponentes de endometritis después de la cesárea son: la duración del parto, la ruptura de membranas, presencia de vaginosis bacteriana, número de exploraciones vaginales y la utilización de monitorización fetal. Los factores predisponentes de endometritis después de parto vaginal son ruptura de membranas prolongada, utilización de forceps, anemia y trauma del tejido blando materno, pero éstos no se identifican en la mayoría de las pacientes con esta infección y son probablemente factores de riesgo relativo. Por razones poco claras, las pacientes indigentes tienen más riesgo de padecer EPP después de parto vaginal o cesárea. 6.1.2. Manifestaciones clínicas La paciente desarrolla fiebre generalmente en el primero o segundo día después del parto. También puede presentar dolor abdominal bajo, útero doloroso y leucocitosis. Las pacientes con sospecha de EPP deben somenterse a una exploración pélvica bimanual para determinar el tamaño del útero, la consistencia y el dolor. Se puede detectar la presencia de masa anexial. Se debe diferenciar de la tromboflebitis puerperal de la vena ovárica, que es un síndrome consecuencia de la trombosis aguda de las venas de uno o ambos ovarios en el periodo puerperal. Muchas pacientes son diagnosticas previamente

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de EPP, pero fracasan en la respuesta a los antibióticos apropiados.

epiteliales y/o leucocitos y los microorganismos aislados.

6.1.3. Etiología

6.1.5. Prevención

La EPP es una infección polimicrobiana causada por una gran variedad de microorganismos. Los aislados con mayor frecuencia son: Streptococcus agalactiae, Enterococcus sp., otros Streptococcus aerobios, Gardnerella vaginalis, Escherichia coli, Klebsiella spp., Bacteroides spp. y Peptostreptococcus spp. Los aislados en sangre con mayor frecuencia son Streptococcus agalactiae y Gardnerella vaginalis.

La realización de profilaxis antimicrobiana disminuye la endometritis después de la cesárea en un 50%; no obstante, un 15% de mujeres con cesárea no electiva y con profilaxis antimicrobiana desarrollan EPP.

El aislamiento de Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma hominis en endometrio y sangre sugiere que estos microorganismos pueden causar EPP, aunque se ha obtenido buena respuesta clínica en pacientes con aislamiento de micoplasmas en hemocultivos que fueron tratados con antibióticos no activos contra estos microorganismos. Chlamydia trachomatis se ha asociado con la forma latente de EPP, que se manifiesta entre 2 días a 6 semanas después del parto vaginal. La EPP debida a Streptococcus ß-hemolítico del Grupo A es rara, pero puede ocurrir en mujeres portadoras y se caracteriza por su temprana manifestación y rápida progresión con pocos signos de localización. 6.1.4. Diagnóstico microbiológico Los cultivos de contenido uterino obtenido a través de la vagina son díficiles de interpretar, debido a la contaminación vaginal; sólo pueden ser útiles en caso de fracaso terapéutico. Se deben obtener cultivos de contenido uterino protegidos, como son los aspirados transcervicales obtenidos por catéter telescopado. También se aconseja obtener un cultivo de orina. Si la paciente tiene signos de sepsis es importante obtener hemocultivos, porque un 10 - 20% de las pacientes tienen bacteriemia documentada. Sin embargo, la bacteriemia no predice la gravedad de la enfermedad o una recuperación prolongada. Si la paciente presenta EPP de aparición tardía o riesgo alto para la infección por chlamidia (p.ej.: adolescentes), se debe obtener una muestra para detección de Chlamydia trachomatis. El contenido uterino puede ser cultivado para bacterias facultativas y anaerobicas. Los medios de cultivo que pueden utilizarse son: agar sangre, agar chocolate, medio selectivo para gonococo, medio selectivo para bacterias Gram negativas, agar sangre colistina-ácido nalidíxico, placas para anaerobios y se debe realizar una tinción de Gram, para valorar la presencia de células

6.2. INFECCIÓN DE LA EPISIOTOMÍA 6.2.1. Introducción La infección en el lugar de la episiotomía es poco frecuente. Aproximadamente sólo 0,1% de las episiotomías se infectan. 6.2.2. Clasificación Shy and Eschenbanch han clasificado las infecciones de la episitomía en cuatro categorías dependiendo de la profundidad de la infección: 1. Infección de la episiotomía simple. Es una infección local que se limita a la piel. Debe ser abierta, explorada y desbridada bajo anestesia adecuada para excluir hematomas o comunicaciones rectovaginal previos no reconocidos. Si la capa de la fascia se infecta extensamente, se debe administrar tratamiento antibiótico para inhibir Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Enterobacteriaceae y anaerobios, incluyendo Bacteroides fragilis. 2. Infección de la fascia superficial sin necrosis. Es la más frecuente, la piel puede estar eritematosa y edematosa, pero no existen manifestaciones sistémicas. La episiotomía debe ser revisada quirurgicamente, si no existe respuesta al tratamiento antibiótico de amplio espectro en 24 48 horas, o si las condiciones clínicas emperoran. 3. Infección de la fascia superficial con necrosis. Referida más frecuentemente como fascitis necrotizante, es una infección del tejido subcutaneo; la afectación cutánea es secundaria, debido a la trombosis de los vasos de la piel. La herida de la episiotomia puede parecer normal, porque la piel no esta afectada primariamente y puede retrasar el tratamiento. Las pacientes presentan síntomas graves con gran dolor local, fiebre alta y manifestaciones sistémicas importantes, a pesar de los escasos hallazgos locales. La mayoría de las pacientes son diabéticas. El diagnóstico definitivo se realiza durante la cirugía. El tratamiento requiere antibióticos de amplio espectro y desbrindamiento incluyendo extracción de todos los tejido necróticos

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4. Mionecrosis. Afectación de la fascia profunda de los músculos. Su etiología más importante es Clostridium perfringens. Debe ser tratada con resección quirúrgica y tratamiento antibiótico. 6.3. MASTITIS PUERPERAL La infección de la mama puede presentarse con diferentes formas clínicas que incluye desde nódulos eritematosos dolorosos a la formación de abscesos canaliculares. La mayoría de estas infecciones ocurren en la segunda o tercera semana del puerperio y generalmente, al comienzo los síntomas están ausentes para aparecer más tardiamente. El microorganismo que se aisla con mayor frecuencia de la madre y del lactante es Staphylococcus aureus. Además del tratamiento tópico, es necesario realizar terapia antimicrobiana por vía general con penicilinas estables a ß-lactamasas. Si aparece formación de abscesos, se deberá realizar incisión y drenaje lo más rapidamente posible para controlar la infección. 7. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LA INFECCIÓN NEONATAL SISTÉMICA BACTERIANA DE TRANSMISIÓN VERTICAL El diagnóstico clínico de la infección diseminada en el RN es difícil, pues los signos iniciales pueden ser mínimos, inespecíficos y/o indistinguibles de otros procesos no infecciosos. Los métodos de laboratorio actuales son de valor limitado para establecer el diagnóstico. En la sepsis bacteriana el recuento de leucocitos es variable y sólo indica infección si es alto o muy bajo. Más valor tiene un descenso del número total de neutrófilos después del nacimiento (cuando habitualmente sube) pues es sugestivo de sepsis. El contaje de leucocitos inmaduros (bandas) es poco específico pero la observación de un alto número de leucocitos inmaduros en un RN con signos clínicos de infección y cultivos negativos, requiere una evaluación y seguimiento muy cuidadosos. Los niveles altos de IgM total o la elevación de los denominados marcadores de fase aguda como la proteína C o la procalcitonina sugieren infección activa pero carecen de suficiente sensibilidad y especificidad para ser considerados indicadores definitivos de infección. La repetición del análisis del hemograma y los marcadores de infección a las 0 - 12 y 24 horas de la sospecha diagnóstica, mejora considerablemente la sensibilidad y especificidad diagnóstica. 7.1. CULTIVOS PERIFÉRICOS

La detección de microorganismos (y leucocitos polinucleares) en un RN por cultivo o examen microscópico tras tinción de Gram en el aspirado gástrico, tubo endotraqueal, exudado faríngeo, canal auditivo, cordón umbilical y meconio solo indican exposición a un agente infeccioso y aunque en estas localizaciones pueda ser detectado el verdadero agente infeccioso estos hallazgos no deben considerarse como criterio definitivo de infección. Sin embargo la ausencia de microorganismos y leucocitos en aspirado gástrico y exudado del canal auditivo hace improbable la existencia de infección adquirida durante el nacimiento. Teniendo en cuenta la poca especificidad y sensibilidad de los "cultivos periféricos" no se aconseja actualmente su realización sistemática como screening en todos los RN para detectar infección neonatal. Únicamente podrían tener interés los tomados en las primeras 24 horas de vida, para orientar etiología en las sepsis verticales clínicas (con hemocultivo negativo) si en tres o más exudados se aísla un agente típico de infección vertical (Streptococcus agalactiae, Escherichia coli), aunque se debe ser muy cauto en su interpretación. 7.2. DETECCIÓN DE ANTÍGENOS BACTERIANOS La dificultad de diferenciar los RN con infección por EGB de los infectados con otras microorganismos o con síndromes no infecciosos ha hecho que se desarrollen diversos tests para detectar la presencia del antígeno polisacárido especifico de EGB, E. coli , H. influenzae, S. pneumoniae, en suero, orina y LCR. Estos tests deben interpretarse con precaución y su positividad indica solamente la presencia de antígeno y no de organismos viables. habiéndose indicado la presencia de falsos positivos en orina (presencia de antígeno de EGB) debida a contaminación desde el tracto digestivo por EGB y no a verdadera sepsis neonatal. 7.3. HEMOCULTIVO EN EL RN El aislamiento de microorganismos a partir de una muestra significativa como sangre o líquido cefalorraquídeo es hasta ahora el único método definitivo de diagnóstico de infección sistémica en el RN (sepsis o bacteriemia). La orina debe valorarse con cautela (al menos que sea de punción suprapúbica) puesto que puede reflejar una colonización de origen materno. Dada la gravedad de la infección sistémica bacteriana en el RN, la detección en sangre de la bacteria causante es muy importante para establecer el diagnóstico y tratamiento. Los hemocultivos deben ser obtenidos (si es posible)

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antes de la utilización de antibióticos. Como la bacteriemia por anaerobios en el RN es muy rara sólo se utilizarán hemocultivos aerobios existiendo frascos especialmente diseñados para hemocultivos pediátricos, p.ej.: BactAlert PF (y Bactec Pediátrico (BD). La cantidad de sangre a extraer debe ser 1 - 2 ml por frasco y es preferible efectuar dos tomas utilizando dos localizaciones anatómicas distintas (ello hace mas fácil la interpretación del hemocultivo cuando se obtiene una toma positiva con un posible contaminante). Se deben realizar todos los esfuerzos para minimizar el número de hemocultivos contaminados, lo que es especialmente importante en el RN por la dificultad de la venipunción. El punto decisivo es la correcta desinfección de la piel (habitualmente flexura del codo o mano) que debe ser desinfectada por medio de dos lavados consecutivos con alcohol de 70º. No deben usarse yodoforos para desinfección de la piel del RN pues hay riesgo de absorción de yodo e interferencia con el desarrollo normal de la función tiroidea. En lo posible debe evitarse la toma de hemocultivos a través de catéteres o de sangre de cordón ya que en estos casos la contaminación es más frecuente. Es muy recomendable (y hoy casi obligado) la utilización de sistemas automáticos de detección de hemocultivos positivos. Dado que las bacterias que más frecuentemente causan sepsis neonatal son de crecimiento rápido y su densidad en sangre suele ser alta (más de 100 UFC/ml y frecuentemente más de 1000 UFC/ml) en la mayoría de casos en el RN los hemocultivos son positivos precozmente (1 - 2 días). Cuando los hemocultivos son recibidos en el laboratorio deben examinarse visualmente para detectar signos de crecimiento (hemólisis, turbidez, gas o viraje del indicador). En estos hemocultivos potencialmente positivos debe efectuarse una tinción de Gram y subcultivo a medio sólido y no deben ser incubados si la tinción detecta presencia de microorganismos. La sepsis neonatal es un proceso grave que puede conducir a la muerte o dejar secuelas permanentes, por ello es muy importante comunicar inmediatamente al neonatólogo los hemocultivos positivos. Esta información se hará de manera fiable y por el medio mas rápido posible (usualmente por teléfono) y debe quedar documentada de manera adecuada en laboratorio señalando fecha y hora y la persona a que se le dió la información. 7.4. DIAGNÓSTICO DE NEUMONITIS EN EL RN

7.4.1. Diagnóstico de la infección por U. urealyticum en el RN La investigación de este microorganismo puede estar indicado en prematuros con distress y/o neumonitis. El cultivo es la técnica diagnóstica de elección (aunque en un futuro podría ser sustituido por la PCR). La muestra preferida es el aspirado endotraqueal (son menos útiles los escobillones faríngeos o nasales y el aspirado gástrico). En caso de que la muestra se tome con escobillón deben usarse escobillones de alginato cálcico, dracón o poliéster, evitando usar escobillones de algodón con mango de madera pues pueden contener sustancias inhibidoras. Se deben utilizar medios especiales para el transporte p.ej.: medio 10B o la solución R1 del medio Urea-Arginina, y siembra (p.ej.: caldo Urea-Arginina y/o medios sólidos como los medios de Shepard A7 o Shepard A8) de la muestra. En general se recomienda sembrar varias diluciones de la muestra con el fin de reducir la influencia de posibles inhibidores. En estos medios puede conseguirse la identificación directa y definitivas de U. urealyticum sin necesidad de pruebas adicionales. 7.4.2. Infección por C. trachomatis Si se sospecha neumonitis por esta bacteria (en hijos de madres infectadas en la gestación) debe buscarse en aspirado endotraqueal por técnicas de biología molecular (preferiblemente), IFD o cultivo, con las adaptaciones adecuadas de la técnica a este tipo de muestra. En nuestro medio no hay datos acerca de la prevalencia de esta patología, pero se considera muy infrecuente. 8. BIBLIOGRAFÍA 1) Tratado de obstetricia y ginecologia. J.A Usandizaga , JP De La Fuente.Vol. I. Cap. Patologia de las menbranas fetales. Ed Mc Craw Hill- Interamericana. 2) Microbiologia Medica. JA Garcia Rodriguez y J.J Picazo Ed. Mosby. tema 26: infecion en la embarazada.Infeccion en obstetricia y ginecologia. 3) Sociedad Española de Obstetricia y Ginecologia (SEGO). Protocolos Asistenciales en Ginecologia y Obstetricia.Protocolos nº 10 y nº 30 . 4) Physicians Practices and opinions Regarding Prenatal Screening for HIV and other Prenatal Sexually Transmitted Diseases. Wendy A Hills, MPH et al. Sexually Transmitted Diseases. March.1998. pg 169-

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Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Editor: Juan J. Picazo

Coordinador:

Miguel Gobernado y Fernando Jiménez Cruz Fernando Dalet Enrique Broseta Marina de Cueto María Santos Manuel de la Rosa

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INDICE Introducción 1. Diagnóstico microbiológico 1.1. Toma de muestras 1.1.1. Obtención por micción 1.1.2. Obtención en bolsa adhesiva 1.1.3. Obtención por sondaje vesical 1.1.4. Obtención por punción suprapúbica 1.1.5. Recolección en pacientes cateterizados 1.1.6. Recolección en situaciones especiales 1.1.7. Conservación y transporte de la muestra 2. Datos informativos al laboratorio 3. Examen del sedimento urinario 4. Cultivos e identificación 4.1. Cultivo de orina 4.2. Interpretación de los resultados 4.3. Etiología de la infección urinaria 4.4. Piuria estéril 5. Pruebas de sensibilidad (antibiograma) 6. Métodos rápidos de detección de bacteriuria 6.1. Métodos químicos 6.1.1. Reducción de nitratos 6.1.2. Producción de catalasa 6.1.3. Reducción del tetrazolium 6.1.4. Presencia de glucosa 6.1.5. Esterasa leucocitaria 6.1.6. Bioluminiscencia 6.2. Métodos físicos 6.2.1. Conteo de partículas 6.2.2. Fotometría 6.2.3. Bioimpedometría 6.2.4. Microcalorimetría 6.2.5. Radiometría 6.3. Métodos microbiológicos 7. Localización de la infección urinaria 7.1. Métodos directos 7.2. Métodos indirectos 7.2.1. Diagnóstico por imagen 7.2.2. Capacidad de concentración osmolar 7.2.3. Determinación de enzimas 7.2.4. Determinación de alfa2-microglobulina

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7.2.5. Investigación de cilindros bacterianos 7.2.6. Anticuerpos unidos a bacterias (ACB) 7.2.7. Título de anticuerpos séricos frente a la proteína de Tamm-Horsfall 8. Caracterización de las cepas pielonefritógenas 9. Situaciones clínicas 9.1. Bases microbiológicas y tratamiento 9.2. Terminología 9.3. Clasificación 9.4. Infección urinaria no complicada 9.4.1. Bacteriuria asintomática 9.4.2. Bacteriuria sintomática 9.5. Infección urinaria complicada 9.6. Infección urinaria de repetición 10. Bibliografía selccionada

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14. LA INFECCIÓN URINARIA 2002 INTRODUCCIÓN Entre todas las infecciones humanas, las del aparato urinario son una de las más frecuentes. En cualquier comunidad social suelen ocupar el segundo lugar después de las respiratorias. Hay un patrón característico y definido relacionado con las distintas etapas de la vida de los seres humanos. Son frecuentes en la infancia en ambos sexos, en la edad preescolar y en la escolar para las niñas, a menudo son asintomáticas y recurrentes; en los adultos su incidencia es muy bajas en el varón, y más alta en la mujer, sobre todo si es activa sexualmente, lleva dispositivos intrauterinos o está embarazada; en el varón, a partir de los 50-60 años, aumenta la incidencia, por la obstrucción causada por la próstata y posible instrumentación urológica; en el anciano, tanto varón como mujer, las alteraciones anatómicas y funcionales aumentan el porcentaje. Además de la edad hay otras circunstancias que influyen en la epidemiología de la infección urinaria, como son determinadas enfermedades, los cateterismos y otro tipo de instrumentación en el tracto genitourinario, la estancia hospitalaria, y otras. Esto datos se ampliarán en cada tipo de infección concreta. 1. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Excepto algunos microorganismos que se pueden encontrar en la uretra anterior, el aparato urinario está libre de microorganismos, por lo tanto, su presencia en la orina probablemente será indicativo de infección. Ante este hecho, el diagnóstico microbiológico de infección urinaria no es tarea fácil. No se trata de cultivar microorganismos sin más. Hay que tener presente que, aunque se basa en demostrar la presencia de microorganismos en la orina, que normalmente es estéril, presenta varias dificultades, la principal estriba en la valoración de lo encontrado en los cultivos ya que, de manera natural, existen microorganismos en la uretra, región genital y periné que pueden, accidentalmente, contaminar la orina y multiplicarse en ella, incluso a temperatura ambiente, pudiendo dar lugar a interpretaciones erróneas de los hallazgos. Por otra parte, en muchas ocasiones, hay que dirigir las técnicas a búsquedas concretas y específicas para hallar microorganismos poco habituales o inesperados y también se debe tener presente que la sintomatología clínica orientativa de las infecciones urinarias es, a veces, confusa, presentado síntomas similares a las infecciones de otra localización, incluso genital. El diagnóstico microbiológico de una infección urinaria se compone secuencialmente de una serie de fases

bien diferenciadas cuyo informe puede detenerse en alguna de ellas. Cuantas más se hayan cumplido más completo y valioso será el informe final. Razones económicas y de estructura del laboratorio pueden obligar a soslayar alguna fase y entonces el diagnóstico microbiológico será, con certeza, incompleto. Esto no supone una imposibilidad de diagnóstico aunque su fiabilidad se reduce drásticamente. Las fases que componen un diagnóstico microbiológico son : toma de muestras, su transporte, estudio del sedimento de la orina en fresco y por tinción, cultivo de orina, identificación del agente aislado y la realización de una prueba de sensibilidad a los antibióticos. Como variantes o métodos complementarios se encuentran la detección rápida de la bacteriuria, la localización no invasora de la infección urinaria y la caracterización de las cepas pielonefritógenas. 1.1. TOMA DE MUESTRAS* El objetivo es recolectar una muestra que refleje lo mejor posible las características de la orina presente en la vejiga urinaria. Se ha comentado en repetidas ocasiones que el reservorio natural de los uropatógenos es el intestino y que el área perineovaginal de la mujer y el surco balano- prepucial del hombre, sobre todo fimótico es, a menudo, un reservorio secundario. Además, la orina debido a sus componentes químicos es un medio de cultivo adecuado para el crecimiento la toma de muestras de la orina para que la colonización accidental sea restringida al máximo. Por ello, durante mucho tiempo, se pensó que la obtención solo se podría realizar en las mujeres mediante el uso de un catéter uretral. Ahora sabemos que siguiendo técnicas bien definidas de recolección por micción limpia pueden obtenerse muestras de confianza sin el riesgo concomitante de la instrumentación.

1.1.1. Toma de muestras por micción Es una técnica fácil, barata, no invasora y de rápida ejecución que tiene una alta fiabilidad en la mayoría de los casos si se realiza bajo unas estrictas condiciones. Es la usada entre nosotros en el 80 % de las ocasiones. Se basa en recoger en un recipiente estéril la orina, preferible la de primera hora de la mañana por estar más concentrada, pero no imprescindible, procedente del chorro medio de la micción previo lavado escrupuloso de los genitales externos (en

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especial de la mujer) con detergentes sin antisépticos. Es un método indicado para adultos y niños mayores de ambos sexos e ideal en los centros con procesamiento de grandes cantidades de muestras. Debe usarse siempre que sea posible teniendo presente que la fiabilidad de las muestras obtenidas en mujeres es de alrededor del 80 %, cifra que aumenta hasta algo más del 90 % cuando se valoran dos muestras consecutivas con el mismo resultado y virtualmente el 100 % cuando se valoran tres muestras. Este método de micción limpia consiste en : - Dotar al sujeto de una toallita impregnada de detergente para el lavado de los genitales externos en la mujer y surco balano-prepucial en el hombre, junto con una segunda toallita seca para secado del área lavada. O bién un simple lavado de genitales con abundante agua y jabón, antes de acudir al laboratorio. Suministrarle un recipiente estéril, preferiblemente de boca ancha (alrededor de 6 cm) para una cómoda y fácil recolección de la orina. - Antes de orinar debe retraer el prepucio el varón o separar los labios con los dedos la mujer. - Explicarle que debe recoger la porción de orina que corresponda aproximadamente a la mitad de la micción sin tocar con las manos o los genitales la superficie interna ni los bordes del recipiente. El seguimiento de estas normas puede ser dificultosa o imposible en hombres con fimosis importante, enfermos con incontinencia de orina, de edad muy avanzada y niños pequeños todavía sin control voluntario de la micción. En estos casos deben realizarse simples modificaciones del método o útilizar otras técnicas. 1.1.2. Recolección de la orina en bolsa adhesiva Es evidente que para los pacientes seniles y los niños pequeños, los requerimientos para una micción limpia supera su capacidad de comprensión. Una sencilla alternativa consiste en la adaptación de bolsas de plástico estériles, con una zona adhesiva, a los genitales externos previamente lavados y secados, comercializadas en las farmacias y distribuidores de material sanitario. Es muy útil para niños que todavía no controlan la micción voluntaria o son lo suficientemente sensibles/rebeldes al ambiente sanitario que impide la micción en las condiciones mínimás aceptables de asepsia. Para evitar largas esperas, es aconsejable que los acompañantes traigan al niño hidratado y

observen, en el momento de colocar la bolsa, si el pañal esta húmedo o no. En el primer caso, con toda lógica, la vejiga estará vacía, por lo que para evitar nerviosismos es mejor salir a pasear con el niño fuera del laboratorio o de la consulta, durante al menos una hora. En el segundo caso, se procede sin dilaciones a la instauración de la bolsa, teniendo cuidado de avisar enseguida que se produzca la salida de orina. De todas formas, si no se ha obtenido una muestra de orina es necesario cambiar la bolsa cada 30-45 minutos, limpiando de nuevo la zona. 1.1.3. Obtención de orina por sondaje vesical transuretral En menos del 10 % de los casos, la micción limpia y su variante (bolsa adhesiva) será imposible, bien porque la cooperación del paciente no es suficiente, o bien, porque se obtengan orinas muy contaminadas de forma repetida por agentes ajenos al aparato urinario (materia fecal, microorganismos no uropatógenos), en los enfermos neurológicos o con problemás urológicos obstructivos. En estos pacientes se hace imprescindible a la obtención por sondaje vesical. Debe hacerse siempre por personal especializado, sin traumatizar la uretra y con rigurosa asepsia. Se útilizaran sondas finas estériles preferiblemente de un solo uso, desechando la primera parte de la orina. Se trata de una técnica invasora y por lo tanto susceptible de iatrogenia si está incorrectamente realizada como falsas vías por rotura uretral e infecciones urinarias secundarias hasta en un 6 % de las ocasiones. 1.1.4. Obtención de orina por punción suprapúbica Consiste en la recolección de orina directamente de la vejiga, mediante la punción y aspiración del líquido contenido en su interior. Técnica invasora recomendada en recién nacidos, lactantes y niños pequeños en los que la bolsa adhesiva haya fracasado, bien por la obtención de orina insuficiente, o bien, por la repetida y manifiesta contaminación. Puede estar también indicada en varones de cualquier edad con fimosis puntiforme, en los que existe la casi segura anidación de uropatógenos en el surco balanoprepucial, o en mujeres con bacteriurias de repetición de dudosa procedencia. La técnica debe ser practicada por un especialista y la preparación del campo y la persona ejecutora debe observar una asepsia tipo quirófano. Básicamente, consiste en, previa desinfección de la piel con povidona yodada, estando el enfermo en decúbito supíno y en ligero Trendelemburg, la introducción de una aguja en la línea media unos 2 cm. por encima de la sínfisis del pubis, hasta la vejiga palpable (vejiga llena por previa hidratación), y aspiración del contenido vesical. Con la introducción de los ultrasonidos, la técnica se ha simplificado mucho puesto que se puede realizar con aguja ecodirigida. Se evitan así los problemás de la localización manual de

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la vejiga, en ocasiones de gran dificultad en las mujeres, dado el inferior tono muscular que poseen respecto al varón. Es necesario tener la precaución de averiguar si el enfermo tiene problemás de hemostasis, en cuyo caso estaría contraindicada. A veces se produce hematuria y hematoma de la pared abdominal. 1.1.5. Recolección de orina en pacientes cateterizados con sonda permanente Es muy frecuente en los ambientes hospitalarios de la especialidad urológica y relativamente en los ambulatorios que los pacientes soporten la presencia de sondas / catéteres en la vía urinaria (sonda vesical) con salida natural, o como drenaje de la vía a través de la piel (catéteres percutáneos) a distintos niveles del aparato urinario (sonda de cistotomía, sonda de nefrostomía, sonda de ureterostomía). La recolección de orina en pacientes con sondas de salida por la vía natural y las de cistotomía es fácil y consiste en pinzar la sonda durante al menos 1 hora y recoger en frasco estéril una porción de orina después de dejarla fluir libremente por unos instantes a través de la sonda desconectada. Para evitar posibles iatrogenias infecciosas en el acto de conexión y desconexión de la sonda, la mayoría de los fabricantes han colocado en la sonda un dispositivo especial para que la orina pueda ser extraída con la ayuda de una jeringa mediante punción de la goma o plástico. No es posible realizar la técnica del pinzamiento en aquellos pacientes con sondas de nefrostomía o ureterostomía por el peligro de iatrogenia ascendente que comporta. Se recomienda la extracción de orina por punción del dispositivo previo a la bolsa colectora. En caso de una sonda con ausencia del dispositivo mencionado, no queda otra alternativa que desconectar asépticamente la sonda de su bolsa colectora, desinfectar la boca de ambas, secar la boca de la sonda, dejar gotear libremente durante un minuto, después recolectar en frasco estéril durante no más de 10 minutos y finalmente volver a conectar el circuito. Nunca se deben aceptar las orinas procedentes de las bolsas colectoras porque la contaminación es tan elevada que invalida cualquier intento de valoración, o, si se usa la técnica de añadir antisépticos a las bolsas, sucede todo lo contrario y se corre el peligro de informar resultados negativos erróneamente. 1.1.6. Recolección de orina en situaciones especiales En los ambientes uronefrológicos existen algunos grupos de enfermos que muestran características especiales a la hora de recolectar orina y de su valoración. En los ambientes uronefrológicos existen algunos

grupos de enfermos que muestran características especiales a la hora de recolectar orina y de su valoración. - Enfermos con vejigas de sustitución Este grupo de enfermos están adscritos a la especialidad Este grupo de enfermos están adscritos a la especialidad de urología y son portadores de vejiga ileal, vejigas de sustitución intestinal, con micción por la uretra, abocamientos de los uréteres al sigma (uretero-sigmoidostomía), con micción rectal. En el primer caso, la orina es expelida al exterior por un estoma cutáneo y recogida en una bolsa colectora. Sí se recomienda la recolección de orina para un estudio citobacteriológico, útilizar las bolsas adhesivas previo lavado aséptico y secado del estoma. Sí la evacuación de la orina se efectúa a través del esfínter anal (que actúa como cuello vesical) hay consiguiente contaminación fecal de la misma. La toma para el examen de la orina puede hacerse por recogida directa sobre un frasco no necesariamente estéril de boca ancha. El valor bacteriológico de estos análisis es muy limitado y el citológico discutible. En las neovejigas con micción uretral, el método será el de la micción media. - Enfermos con insuficiencia renal terminal Constituye un grupo proveniente del ambiente nefrológico que están adscritos a un programa de diálisis o trasplante renal en su fase inmediata. Parte de ellos conserva una diuresis isotónica suficiente como para efectuar una toma por micción del chorro medio; sin embargo, otros solo conservan una mínima diuresis (inferior a 200 ml/día), lo que hace difícil esta técnica. Se admite la toma de muestras durante la micción sin separación de fases. - Anurias obstructivas En estos casos, la orina es recogida por especialistas por punción directa por encima del nivel de obstrución. La técnica de ejecución es paralela a la de la punción suprapúbica. Cualquier volumen obtenido es válido para el exámen. - Enfermos con prostatitis crónica Se requiere una toma secuencial de varias orinas y también de semen. De ello nos ocuparemos en el apartado 9 de situaciones clínicas. 1.1.7. Conservación y transporte de la orina Una vez obtenida la orina por cualquier método debe remitirse rápidamente al laboratorio, antes de dos horas o menos tiempo en verano, o refrigerarse a ± 4º C, temperatura en la que se puede conservar hasta 24 horas. Cuando la refrigeración no es posible, existe la posibilidad de usar tubos con un medio conservador

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(B-D, Becton-Dickinson, Cockeyville), que aunque encarece la prueba, permite la conservación de la orina durante 24 horas y evita, en muchas ocasiones, falsos resultados positivos. 2. DATOS INFORMATIVOS AL LABORATORIO Cuando se envía una muestra al laboratorio, además de la filiación del enfermo e información demográfica, identificación del solicitante del estudio y otros datos administrativos, es imprescindible acompañarla de datos adicionales, que incluyan: forma de la toma de la orina y procedencia, enfermedad de base, factores de riesgo, tratamiento antibiótico y todos aquellos orientativos para el mejor procesamiento de la orina en cuanto a sistema de cultivo y medios a elegir, tiempo de incubación, antibióticos a incorporar en las pruebas de sensibilidad microbiana, e interpretación posterior de los resultados obtenidos. 3. EXÁMEN DEL SEDIMENTO URINARIO El sedimento de orina es quizás el análisis más solicitado por los clínicos, y el más fácil de realizar, porque no precisa de instrumentaciones complejas, y el más útil para la rápida sospecha de una infección urinaria, pero posiblemente, el que mayor número de errores diagnósticos lleva consigo. Dos son las principales fuentes de error (ambas contrapuestas) cuando se examina un sedimento de orina : la sobrevaloración y la infravaloración de los elementos observados. Los uropatógenos desarrollan para su supervivencia en la orina una frenética fase de multiplicación. Inapreciables contaminaciones en el momento de la recogida por potenciales uropatógenos residentes en el área perineo-vaginal en la mujer y surco balanoprepucial/uretra anterior en el hombre, rápidamente llevan, si la orina no se procesa de forma inmediata, a la presencia de un ingente número de bacterias que puede confundir al microbiólogo y posteriormente al clínico. Por esta razón, la realidad es que teliales de descamación cuyo numero o profundidad dan una acertada idea de la extensión de la agresión microbiana, la investigación de cilindros leucocitarios o bacterianos que pueden localizar la infección y la interpretación de la presencia de ciertos cristales (fosfato amónico-magnésico, urato amónico, carboapatita) que en orinas frescas indican la presencia de bacterias ureolíticas. En niños pequeños, mujeres de higiene dudosa y varones portadores de sonda vesical permanente es relativamente frecuente observar la presencia de restos fecales. Carece de significado patológico y solo indica una inadecuada recogida de la muestra urinaria. En estos casos la presencia de microbiontes de varios tipos es la norma y no deben ser considerados para

ulteriores estudios. Existe una situación quirúrgica en sujetos de ambos sexos, el abocamiento de los uréteres al sigma (ureterosigmoidostomía uni o bilateral), que comporta la presencia de materia fecal en la orina sin que sea una situación patológica ni una incorrecta recogida de muestras. Si en las mejores condiciones de recogida y en ausencia de los factores quirúrgicos anteriores se observan restos fecales, deben ser tomados en consideración, porque constituyen un elemento diagnóstico de extraordinario valor en las fístulas intestino-urinarias a cualquier nivel. En estos casos, es preceptivo la recogida de varias muestras (no menos de tres), extremando, si cabe, las precauciones higiénicas o obteniéndolas por sondaje vesical o punción suprapúbica. 4. CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS 4.1.CULTIVO DE LA ORINA Una vez examinada la orina en fresco o teñida se procede a la fase siguiente cual es el cultivo. Por razones económicas o colapso del laboratorio se admite que las orinas sin proteinuria, leucocituria, microhematuria y ausencia de bacterias en la observación directa sean consideradas sin interés bacteriológico (como cultivos negativos), por lo que no se prosigue la investigación. La fiabilidad de este proceder alcanza alrededor del 90 % de los casos. Se exceptúan aquellas orinas obtenidas por punciones directas (vesical o renal), ya que se consideran como muestras únicas y valor diagnóstico definitivo. No obstante, dada la mayor fiabilidad del cultivo, en la práctica clínica se prefiere el cultivo de orina independientemente del resultado del sedimento. El cultivo es muy interesante ya que permite conocer el número de colonias, y por lo tanto de bacterias vivas en la muestra sembrada, la posterior identificación del género, especie, fenotipo, biotipo y genotipo en su caso de la bacteria involucrada, imprescindibles desde un punto de vista clínico y epidemiológico, para conocer la etiología de la infección urinaria, tratamiento adecuado, diferenciar reinfecciones de recaídas, y, también, la posibilidad de realizar pruebas de sensibilidad bacteriana a los diferentes antimicrobianos. Habitualmente se usan dos tipos de cultivos, el sistema clásico en placas de Petri, sembradas con asas de platino calibradas, que permite recuento y aislamiento, y recientemente, sobre todo en los hospitales y centros con muchas muestras, los sistemas automatizados, de gran valor como muestreo y detección de bacterias de crecimiento rápido. En el método clásico se emplea dos medios de cultivo. Con

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un asa de platino calibrada se deposita 0,01 ml de orina en un medio rico de crecimiento, habitualmente agar-sangre, que permite, al cabo de 18-20 horas de incubación a 35'5 º C, el conteo de las bacterias vivas que había en la orina, por extapolación del número de colonias detectadas en la placa, ufc/mm. Una cantidad igual de orina se siembra en otro medio, este selectivo, como puede ser el EMB de Levine o McConkey, que impiden el crecimiento de bacterias contaminantes, facilitan el desarrollo de la mayoría de las enterobacterias como Escherichia coli y evitan el crecimiento en sábana al que tiende Proteus mirabilis. Las dos placas pueden sustituirse por una única con medio de CLED (Cistina Lactosa Electrolito Deficiente), un medio diferencial no selectivo que permite el crecimiento de Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterococcus y Candida y el desarrollo como colonias puntiformes de Streptococcus agalactiae, inhibiendo además el fenómeno de "swarming" de Proteus spp. En muchos laboratorios se utiliza como único medio de cultivo éste agar. La observación de ciertos tipos de bacterias en el exámen directo (por ejemplo bacilos grampositivos o cocos gramnegativos) pondrá en guardia al bacteriólogo para el uso complementario de medios de cultivo y atmósfera especiales. Una vez transcurrido el periodo de incubación se podrá informar semicuantitativamente del número de unidades formadoras de colonias por ml de orina (ucf/ml), multiplicando el factor de la alícuota tomada por el número de colonias contadas en la placa. Las cifras obtenidas se comparan con las ya definidas en la literatura, que tratan de soslayar las posibles contaminaciones. Los medios generales y selectivos comentados, o similares, pueden ir incorporados en las caras opuestas de una lámina de plástico, que está dentro de un recipiente estéril; tras sumergirse en la orina e incubando puede observarse la formación de colonias bacterianas. Es un medio práctico utilizado como muestreo en muchas consultas y laboratorios pequeños, aunque en caso de positividad debe comprobarse con el sistema clásico. 4.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS CULTIVOS A la hora de valorar el número de colonias que se aislan en un cultivo, clasicamente, según los criterios de Kass, del año 1956, se ha considerado que 5 recuentos iguales o superiores a 10 ufc/ml, en una orina obtenida por micción espontanea, son indicativos de bacteriuria significativa en un 80% de los casos, porcentaje que se eleva al 95% cuando se repite en más de un cultivo o se acompaña de síntomás de

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infección. Conteos inferiores a 10 ufc/ml se han considerado como de contaminación, y entre las dos cifras, dudosos o indicativos de otras circunstancias. Cuando la orina se obtiene por cateterismo, un solo 4 conteo de 10 ufc/ml ya es indicativo de bacteriuria significativa, e inferior habla de una probable infección. En el caso de que la orina se hubiese obtenida por punción vesical suprapúbica o renal percutanea lumbar, cualquier recuento debe considerarse como significativo de bacteriuria; no obstante, estos criterios, universalmente admitidos hasta ahora, están en revisión desde hace algunos años, sobre todo desde 1992 de acuerdo con los criterios de un comité de expertos de la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas, ya que son frecuentes las circunstancias clínicas en que no se cumplen. Son muchas las ocasiones en que recuentos por debajo de los indicados responden a una auténtica infección urinaria y, por lo tanto, no pueden considerarse sólo como excepciones. Tal es el caso de las orinas muy diluidas, o las que tienen pH extremos, incompatibles con la vida bacteriana, o cuando existen microorganismos de crecimiento lento como Corynebacterium spp, que requieren más de 18-24 horas para su desarrollo, tiempo habitual que se mantienen en incubación los cultivos de orina, o el caso de las uretritis o las prostatitis, de lo que nos ocuparemos más adelante, o cuando existe obstrución ureteral, pielonefritis crónica, etc.; y sobre todo, dos circunstancias demasiado comunes en la práctica diaria como para considerarlas excepciones, como son el síndrome uretral femenino y los enfermos que, por su sintomatología específica, u otra causa, están siendo tratados con antibióticos. En el síndrome uretral femenino es común encontrar conteos bajos de enterobacterias o de Staphylococcus saprophyticus, a veces Chlamydia trachomatis y, cada vez menos en nuestro medio, Neisseria gonorrhoeae, con síntomas poco específicos, datos a tener en cuenta a la hora de procesar los cultivos. Estos últimos casos, así como algunos de cistitis en mujeres jóvenes han hecho que, hoy día, se deba considerar recuentos 3 de 10 ufc/ml e, incluso inferiores, como indicadores de infección ante una mujer con síntomas del tramo urinario inferior. Una vez aislado el agente causante, por motivos asistenciales, epidemiológicos y científicos obvios se procede a su identificación mediante una serie de pruebas bioquímicas o de otra índole preestablecidas, no necesariamente iguales en cada laboratorio de microbiología. 4.3. ETIOLOGÍA BACTERIANA DE LAS INFECCIONES URINARIAS La invasión del aparato urinario sano esta restringido a un grupo muy selecto de microorganismos, llamados "uropatógenos", que son capaces, mediante la expresión de factores de virulencia, de sobrepasar,

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soslayar o minimizar los mecanismos de defensa del huesped. En el diagnóstico microbiológico también hay que tener en cuenta que el tipo de los microorganismos que se aislan van a variar dependiendo de las circunstancias del paciente y de sus enfermedades de base. En la infección adquirida en la comunidad, en enfermos sin factores de riesgo específicos o enfermedades de base, Escherichia coli, cuya extremada y sofisticada adaptación para alcanzar las estructuras del aparato urinario son en la actualidad muy bien conocidas, es la bacteria que se aisla en más del 70% de los casos, seguida de Klebsiella spp., Proteus mirabilis y Enterococcus faecalis. En los hospitalizados, con enfermedad de base obstructiva, sometidos a manipulaciones instrumentales y/o con tratamiento antibiótico, el porcentaje de Escherichia coli desciende a favor de otras bacterias detectándose con frecuencia Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella morgagnii, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. y otros microorganismos como levaduras, la más frecuente Candida albicans; en este caso las infecciones cruzadas juegan un papel importante en el tipo de flora aislada. Cuando, además de estas circunstancias, el enfermo está inmunodeprimido es posible que otros microorganismos como, Aeromonas spp., Corynebacterium spp, Mycobacterium spp. y hongos sean los causantes de la infección. El aislamiento de bacterias anaerobias, así como otros microorganismos tales como adenovirus y el BK virus, frecuente en las cistitis hemorrágicas, también es posible, pero de manera poco frecuente. Es de esperar microorganismos diferentes ante enfermos distintos, como lesionados medulares, receptores de transplantes de órganos, neutropénicos, adictos a drogas por vía parenteral, o afectados por el síndrome de inmunodeficiencia adquirida. De los datos anteriores se deduce la importancia de que cuando se solicite un cultivo de orina a un laboratorio se acompañe, junto con los datos demográficos, información concreta de las circustancias clínicas del enfermo, de sus enfermedades de base y factores de riesgo. Esto hará posible que una orina de un enfermo, con cálculos u otra enfermedad obstructiva o inmunosupresión no sea cultivada en un medio automatizado rutinario que despacha los cultivos en poco más de cinco horas, o que se considere como patógenas a especies del género Corynebacterium que de otra manera serían desechadas como contaminantes, o que se valoren conteos inferiores a 10³ ufc/ml, o el aislamiento de Staphylococcus saprophyticus en una mujer con molestias miccionales típicas del llamado síndrome

uretral femenino. Deducimos, entonces, que puede ser posible el diagnóstico bacteriológico empírico en la infección adquirida en la comunidad en enfermos sin factores de riesgo, dudoso en la infección nosocomial, y practicamente imposible en aquellos con múltiples factores de riesgo o inmunocomprometidos; en estos dos últimos casos el cultivo diagnóstico es imprescindible. 4.4. PIURIA ESTÉRIL Hay circunstancias en que, ante la presencia de una clara piuria, detectada en el examen del sedimento, no se aislan bacterias en la orina, algunas de las razones ya las hemos comentado, como es el caso de bacterias de crecimiento lento o que requieran medios especiales para crecer o están en pequeña cantidad, pero también puede deberse a que los leucocitos sean de procedencia uretral o vaginal derivados de una infección bacteriana no buscada como las causadas por Chlamydia o Mycoplasma, o como manifestación de una reacción inmunológica, o la respuesta ante la agresión de agentes no bacterianos como analgésicos u otros fármacos. Estas posibles circunstancias deben tenerse en cuenta y aplicar el sentido común clínico cuando aparentemente los datos obtenidos no encajen con nuestra sospecha inicial. 5. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) A partir de las bacterias aisladas se procede a la práctica de un antibiograma. Raramente se admite usar orina directa para el mismo. La técnica sólo sería posible en infecciones no complicadas de mujeres donde el porcentaje de aislamientos de Escherichia coli es muy alto y la tasa de cultivos mixtos practicamente despreciable, y también por razones de urgencia y gravedad del enfermo, previa tinción de Gram y observación de bacilos gramnegativos puros, aunque no es muy fiable ya que los leucocitos suelen interferir el crecimiento. El antibiograma es ineludible en las infecciones urinarias complicadas porque los agentes etiológicos son variados, muchos con resistencia seleccionada, y por consiguiente su sensibilidad a los antibióticos imprevisible, y sólo necesario en infecciones urinarias no complicadas porque los agentes causantes son restringidos y su sensibilidad conocida y bastante constante en periodos largos de tiempo. Se practica, la mayoría de las veces, por razones de costo y eficiencia, como técnica cualitativa, por el método de difusión de la bacteria en medio sólido, utilizando para ello discos de papel o comprimidos con una carga determinada de antibiótico. Salvo casos excepcionales o laboratorios muy preparados no es aconsejable la fabricación "casera" de los discos

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porque, en general, la carga de antibiótico absorbida no es uniforme. Después de una incubación en estufa a 36,5º C durante 18-24 horas, se miden los halos de inhibición de cada antibiótico y extrapolando la CMI por medio de redes de regresión. En favor de la reproductibilidad y fiabilidad de esté metodo de antibiograma, tanto la técnica, como la carga de los discos, diámetro de los halos e informe de resultados, hay que decir que han sido normatizadas internacionalmente. Las principales ventajas de usar comprimidos comprende la estabilidad (ausencia de pérdidas de potencia durante el almacenaje) a temperatura ambiente (alcanza hasta 5 años) y dosificación exacta (incorporación de microcristales del antibiótico). La incorporación del disco o comprimido al medio de cultivo puede realizarse por métodos manuales o automáticos. Actualmente se dispone en el mercado de un gran número de variantes, más o menos automatizados para el procesado de cantidades importantes de muestras. Las técnicas cuantitativas se realizan en medio sólido o líquido con diluciones conocidas del o los antibióticos a probar. Las primeras se usan para ensayos de gran número de cepas para un determinado antibiótico y las segundas para lo contrario, diversos antibióticos para solo una cepa. Como las concentraciones de antibióticos alcanzadas en el tracto urinario son muy elevadas, solo se practican estas técnicas en modalidades infecciosas seleccionadas (por ejemplo en las prostatitis/orquiepididimitis crónicas) donde la penetración del antibacteriano puede estar muy restringida. Dada la profusión de antibióticos existentes en el arsenal terapéutico actual con tendencia a aumentar todavía más, un punto interesante a comentar son los antimicrobianos que deben probarse para obtener una máxima información y un menor coste económico. La idea se sustenta en los siguientes puntos : a) No es conveniente probar aquellos antibióticos de probada ineficacia sobre el agente etiológico porque es antieconómico y su valor clínico nulo. Se exceptúan aquellos casos en los que el antimicrobiano se coloca a propósito con fines de identificación y que no se informan al clínico. b) No deben probarse aquellos antibióticos cuya eliminacion renal bioactiva sea inferior al 10 %, independientemente de su eficacia in vitro, como macrólidos y lincosaminas, cloranfenicol y ácido fusídico c) En infecciones urinarias no complicadas se útilizarán solo los cabezas de serie más simples. Si

estos son activos (alta probabilidad) también lo serán sus congéneres más sofisticados. Por ejemplo, si un Escherichia coli es sensible a la cefazolina o ácido pipemídico, también lo será a las cefalosporinas de segunda, tercera y cuarta generación, o fluoquinolonas, respectivamente. En caso contrario, el antibiograma debe completarse adecuadamente. Se han comunicado dispersiones considerables de resultados cuando se prueban discos de papel impregnados con ß-lactámicos e inhibidor de ßlactamasas (amoxi/clav y ampicilina/ sulbactam) respecto a las técnicas cuantitativas, debido a la relativa inestabilidad de estos inhibidores en los discos de papel (tendencia a la hidrólisis), lo que se puede evitar sustituyendo por comprimidos los discos de papel. d) Todas estas consideraciones conducen a la conclusión de que es necesario el planteo de varios antibiogramas base, según el agente etiológico aislado: - Antibiograma "reducido" para cepas de Escherichia coli, Proteus mirabilis y Klebsiella en infección urinaria no complicada. Consta de un máximo de 7 antimicrobianos cabezas de serie. Resistencia a cefazolina, ácido pipemídico o gentamicina implica la ampliación del mismo. - Antibiograma "ampliado" para otros bacilos gramnegativos (excluidas Pseudomonas spp., y Acinetobacter spp.), cepas con resistencias del grupo anterior y en infecciones complicadas, pielonefritis y sepsis de origen urológico. Se ha sugerido formalmente que para probar la actividad sobre gramnegativos de todas las fluoquinolonas actuales basta la inclusión de norfloxacina y ciprofloxacina, pudiéndose extrapolar los resultados para el resto de la serie, considerando, sobre todo para gramnegativos, la resistencia cruzada entre ellas. - Antibiograma "selectivo" para Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter. - Antibiograma "selectivo" para grampositivos. - Antibiograma "selectivo" para prostatitis. Es evidente que estas sugerencias sólo son válidas para el caso de que la única infección sea la del aparato urinario, algo que a veces no sucede en los enfermos hospitalizados con más de un foco de infección, y también depende mucho de la organización de cada laboratorio, del uso rutinario de pruebas de sensibilidad automatizadas, con paneles fijos de antibióticos, y otra serie de circunstancias variables en cada laboratorio. No cabe duda, por ejemplo, que el antibiograma secuencial alarga el tiempo de respuesta.

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6. MÉTODOS RÁPIDOS DE DETECCIÓN DE LA BACTERIURIA El tradicional largo periodo de tiempo que se necesita para la realización de las pruebas microbiológicas, conduce a menudo a los clínicos a confiar exclusivamente en su propia experiencia, en especial frente a una emergencia. De esta forma, se considera el informe microbiológico como un elemento, que en el mejor de los casos, sirve solamente para confirmar o excluir una hipótesis etiopatogénica y una decisión terapéutica. Este estado de cosas penaliza el estudio de las enfermedades infecciosas que son frecuentemente imposibles de diagnosticar en el laboratorio en un periodo de tiempo adecuado. Todo ello ha contribuido negativamente en el significado y valor del informe microbiológico, que es a menudo subestimado e incluso simplemente ignorado. El esfuerzo tecnológico realizado ha cristalizado en la aparición de una serie de técnicas más o menos costosas que han permitido mejorar sustancialmente los tiempos de un laboratorio microbiológico. Se define como método rápido toda aquella técnica que hace posible disponer de un informe, aunque solo sea en fase preliminar durante las primeras 4 horas. En el contexto de las enfermedades infecciosas en general, este informe preliminar no será en muchas ocasiones único, sino que ira seguido de otros confirmativos y más precisos en pocas horas, acortando la duración del informe definitivo. En el capitulo de la detección de infecciones urinarias, los métodos y las etapas se han simplificado ostensiblemente por dos razones fundamentales; en primer lugar, porque pueden obtenerse respuestas finales casi inmediatas cuando los casos son negativos; y en. segundo, porque el conocimiento que da el informe preliminar en los casos positivos es lo suficientemente valioso como para efectuar un diagnóstico de firme sospecha e iniciar una terapia razonada. Los métodos rápidos aplicados al diagnóstico de las infecciones urinarias detectan la presencia de microorganismos en la orina en un tiempo que varía entre pocos minutos a varias horas. Están diseñados de forma que amplían su útilidad en dos vertientes distintas. Una de ellas se refiere a la construcción de aparatos de diagnóstico rápido que permiten la posibilidad de procesar grandes cantidades de muestras de orina (más de 100 muestras/día) en un tiempo relativamente corto (máximo de 4 horas). La segunda vertiente ha proporciónado métodos rápidos de realización muy simple que incluso permiten su práctica en la propia consulta del médico por personal no especializado.

Esto constituye un importante avance diagnóstico porque se pueden efectuar controles de enfermos rápidamente, enviando al especialista microbiólogo solo aquellos casos en los que la prueba ha resultado positiva. Se consiguen con ello tres objetivos fundamentales : mejor control del enfermo, abaratamiento de los costes y, todo esto, unido a una mayor rapidez (a veces minutos). Los métodos rápidos de detección de la bacteriuria se dividen en tres grandes grupos : métodos físicos, químicos y microscópicos. 6.1. MÉTODOS QUÍMICOS Se han desarrollado numerosos métodos químicos para la rápida detección de la presencia de bacterias en la orina. Todos ellos se fundamentan en reacciones químicas que el microorganismo produce frente a sustratos propios de la orina, o bien, añadiendo (la forma más común) sustratos específicos que cambian de color por la acción química de la bacteria, la mayoría de las veces incorporados a "tiritas" de celulosa. En general, en la misma "tirita" se incorporan substratos para detectar densidad, proteínas, pH, glucosa, acetona, sangre, bilirrubina, urobilinógeno, nitritos, esterasa leucocitaria y otros parámetros. Todos, excepto la bioluminiscencia, son métodos muy simples y rápidos, que no precisan de utillaje ninguno, de bajo coste económico y que pueden ser realizados por personal sanitario no especializado. 6.1.1. Reducción de nitratos El principio se basa en la adición a la orina problema de nitratos que en presencia de bacterias serán reducidos a nitritos o nitrógeno molecular. La reacción en medio ácido con ácido sulfanílico y alfa-naftilamina proporcióna un compuesto de color rojo (arilhidracina). En la práctica se realiza mediante tiras reactivas de papel (incoloras) que llevan incorporado el substrato y los reactivos. En caso de cambio de color a rojo se interpreta como una prueba positiva (presencia de bacteriuria). El tiempo de lectura es inferior a 2 minutos, por lo que puede ser conectado a un procesador automático para grandes cantidades de muestras. Los principales inconvenientes se hallan en que no todos los uropatógenos reducen los nitratos, como los enterococos, dando resultados negativos falsos, hecho similar ante pequeño número de bacterias. Por otro lado, la presencia de saprofitos contaminantes, puede dar resultados positivos. Es por tanto un método rápido y barato, aunque poco sensible y específico. 6.1.2. Producción de catalasa La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias. El ensayo consiste en introducir en la orina problema una tira reactiva impregnada con agua oxigenada, la cual en presencia de bacterias desprenderá burbujas de gas. Es un

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método muy sencillo y rápido cuyo principal inconveniente es la de no detectar (falsos negativos) la presencia de los géneros Streptococcus y Enterococcus (no productores de catalasa), bacterias que son con bastante frecuencia agentes causales de infecciones urinarias. También debe tenerse en cuenta que bacteriurias con escaso número de bacterias pueden dar lugar a resultados de difícil interpretación. Es, por lo tanto, bastante sensible, rápido y barato, pero poco especifico. 6.1.3. Reducción del tetrazolium El clohidrato de tetrazolium (incoloro) es un compuesto químico que actúa como aceptor artificial de electrones en la cadena oxidativa biológica. Esta reducción da lugar a un compuesto, el formazán, que es de color rojo. La introducción en la orina problema de una tira impregnada con dicho compuesto detecta rápidamente la presencia de bacterias por cambio de color. Es tal vez el mejor método químico, aunque tampoco distingue las bacterias contaminantes (falsos positivos). Es sensible, específico y barato, pero solo con relativa rapidez. 6.1.4. Presencia de glucosa La orina contiene normalmente cantidades de glucosa muy pequeñas, que han escapado a la acción reabsortiva del túbulo proximal. Por otra parte, prácticamente todos los uropatógenos utilizan la glucosa en su ciclo oxidativo. Esto significa que en una orina con bacteriuria no se detectará glucosa por haber sido consumida por las mismás. La determinación de glucosa se realiza por métodos enzimáticos muy sensibles y específicos, que evitan las interferencias que se producen cuando se utilizan los método reductores. La introducción de una tira reactiva debe dar, en caso negativo, un cambio de color al detectar la presencia de glucosa; en caso contrario, significa la existencia de bacterias. El principal inconveniente reside en aquellos enfermos con glucosurias no fisiológicas, tales como diabéticos o sobrecarga de glucosa (sueros glucosados) que dan lugar a falsos negativos. Tampoco distingue la posible presencia de agentes contaminantes (falsos positivos). Es un método muy sensible, poco especifico, rápido y barato. 6.1.5. Esterasa leucocitaria Es otra prueba rápida basada en el he-cho de que la presencia de leucocitos suele asociarse, como respuesta inflamatoria, a la infección urinaria. Detecta, por lo tanto, so-lo leucocituria o piuria de manera indirecta, que evidentemente, también es común en la mayor parte de los procesos inflamatorios por cualquier circunstancia, en los tumores, contaminación vaginal y otras situaciones clínicas. La "tirita" está impregnada con un éster del ácido indoxil carboxílico y sal de diazonio, que al exponerse a la esterasa leucocitaria reaccionan a color azul, detectan-do tanto

leucocitos intactos como los lisa-dos. La sensibilidad y la especificidad son altas, pero se pueden aplicar a la prueba to-das las limitaciones que tiene el examen microscópico de la orina. 6.1.6. Bioluminiscencia Este método precisa de una costosa instrumentación (sistemas 3M/Lumac, 535 Luminometer y Monolight), y se fundamenta en que el ATP bacteriano en presencia del sistema enzimático luciferin-luciferasa trae consigo la emisión de luz, cuya intensidad es proporciónal a la cantidad de ATP y en consecuencia a la concentración microbiana en una muestra dada. Esta técnica posee una innegable ventaja cual es la rapidez y sensibilidad; sin embargo presenta la dificultad de encontrar un método de extraccion del ATP que sea exclusivamente de origen bacteriano, ya que los leucocitos y otras células también lo tienen, y obviar el llamado fenómeno del apagón debido a esta causa. También hay que contar con la presencia en la orina de inhibidores del sistema luciferinasa (urea, sulfatos, cloruros). La sensibilidad se coloca en el umbral de 4 5 10 - 10 bacterias/ml de orina, que comparados con las técnicas fotométricas muestras un 6% de falsos negativos. El valor predictivo negativo llega al 97%. Algunos sistemas basados en métodos de tinción o químicos se han automatizado, entre ellos disponemos del Uriscreen, que detecta la producción de catalasa por las bacterias y los leucocitos, con una especificidad del 79%, puesto que, aproximadamente, un 10% de las bacterias causantes de las infecciones urinarias no producen catalasa. El Autotrack, informa de bacterias y células en la orina por fluorescencia, despues de haberlas hecho pasar por una tira de papel de filtro y teñirlas con naranja de acridina, con un valor predictivo negativo del 100%. El sistema RUS (Rapid Urinary Screen) detecta por colorimetría la producción de enzimas bacterianos y de los leucocitos neutrófilos, con una sensibilidad del 92% y un valor predictivo negativo del 96%. El sistema Ramus (Rapid Automatic Microbiologic Urine Screen) puede, por medio de un contador y distribuidor de partículas e impedancia eléctrica, evidenciar, separadamente, bacterias, leucocitos y hematies, con una sensibilidad del 95,6%, una especificidad del 93,8% y un valor predictivo negativo del 98%; el Bactec-T-Screen es también colorimétrico, semejante al Autotrack, pero usa un colorante no fluorescente en vez del naranja de acridina. 6.2. MÉTODOS FÍSICOS Las extensas y variadas ofertas comerciales que existen en la actualidad se reducen a tres técnicas: conteo de partículas, fotometría y bioimpedometría. Son técnicas cuyo utillaje inicial precisa de un desembolso monetario importante, pero permiten el procesamiento de grandes cantidades de muestras en un corto periodo de tiempo.

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Se trata de métodos muy interesantes desde el punto de vista de su capacidad para descubrir la presencia de microorganismos en orina, independientemente de su viabilidad y su número; no obstante, quedan todavía algunos problemas por resolver para su total eficacia práctica En su mayoría son automáticos, los más fiables son los que captan la presencia de bacterias por su crecimiento, avisando cuando han detectado un aumento exponencial. Son fiables para las bacterias de crecimiento rápido y útiles cuando, de manera rutinaria, se ha de procesar un gran número de orinas, pero siempre teniendo presente sus limitaciones. Es importante tener en cuenta que se usan sólo para muestreos de orina y que el principal propósito de los mismos es demostrar, rapidamente, las que no contienen bacterias. La prinicpal razón de su empleo es eliminar 70-80% del trabajo generado por las orinas en un laboratorio que maneje muchas muestras, ahorrando tiempo, personas y espacio y dar, en el caso de verdaderos resultados negativos, un beneficio clínico. Lo que debemos exigir a estos sistemas es que sean rápidos, sencillos, específicos, baratos y de alto poder predictivo. 6.2.1. Conteo de partículas El conteo de partículas se realiza en un contador que se halla combinado con un analizador de distribución en relación a su tamaño; sin embargo, aunque los resultados parecen buenos, existen numerosas interferencias debido a la presencia en la orina de desperdicios celulares, lo que hace necesario que el tratamiento previo de la muestra con ultrasonidos debería estar exactamente estandarizado. Es una técnica altamente sensible y rápida con el inconveniente de su baja especificidad y alto coste económico respecto al utillaje. 6.2.2. Fotometría Son sistemas que detectan crecimiento bacteriano por medio de turbidimetría. El principio se basa en remplazar el ojo humano por sensores ópticos, desde un simple fotómetro a microdensitómetros, capaces, con la ayuda de una computadora, la tecnología láser y luz indirecta esparcida, de analizar la imagen que producen los cambios en las densidades ópticas. La técnica es sensible sólo para las bacterias de crecimiento rápido, no pudiéndose aplicar para los casos, como litiasis, inmunodeprimidos, etc. en que se sospeche bacterias de crecimiento lento o que requieran medios especiales, y tampoco diferencia bacterias patógenas de las contaminantes. El principio del método es sencillo y se trata de diluir la orina en un liquido de cultivo adecuado que permita el desarrollo de cualquier microorganismo presente. Buenos sistemas automáticos son el MS2, dejado de comercializarse en España, el AutoMicrobic System (AMS,Vitek), el Cobas-Bact y el AutoBac. El tiempo requerido para obtener un cierto grado de turbidez depende de la concentración inicial de bacterias.

Tienen una sensibilidad superior al 95% y una especificidad aproximada del 90%, relativa rapidez y coste económico medio-alto. El AMS-Vitek, un sistema muy automatizado de los usados en los laboratorios, y además de muestreo de orinas sirve para identificar bacterias y hacer pruebas de sensibilidad. Usa pequeñas tarjetas de plástico, autocargables con la orina (20 pocillos) u otras muestras, con substratos liofilizados como soporte para todas las pruebas. La máquina decide el tiempo de incubación y lectura de acuerdo con la velocidad y crecimiento de las bacterias. Fue propuesto para el muestreo de orinas ya en 1977. La tasa de detección de bacteriuria es superior al 90% considerando todas las bacterias posibles, con un valor predictivo negativo del 98% 5 cuando el punto de corte se establece en 10 ufc/ml. Otro buen sistema es el Uro-Quick, basado en el mismo principio, pero con modificaciones en la lectura por medio de rayo de láser polarizado y detectores colocados alrededor de los tubos donde se deposita la muestra. Puede leer simultáneamente hasta 120 orinas, que se incuban dentro de la misma máquina. El medio de cultivo está adaptado para permitir el crecimiento de la mayoría de los patógenos urinarios incluyendo levaduras y Pseudomonas hasta una concentración que permita tomar decisiones entre 1 y 3 horas. En cualquier momento se puede visualizar la marcha del cultivo por medio de curvas de crecimiento que se muestran en la pantalla del sistema informático que incorpora el sistema. La sensibilidad es del 94%, la especificidad de 97%, el valor predictivo positivo del 98%, el valor predictivo negativo del 98%, y la eficiencia del 96%. 6.2.3. Bioimpedometría Se fundamenta en que la presencia de bacterias, las cuales se están multiplicando en un medio líquido, trae consigo cambios en la composicion química del medio, lo que produce variaciones en su conductividad o resistencia eléctrica. Las variaciones que se producen en un determinado periodo de tiempo son proporcionales a la cantidad de bacterias en la muestra. En general se puede afirmar que los instrumentos no son particularmente difíciles de manejar, la muestra no requiere pretratamiento y pueden ser conectados a un microcomputador para la lectura de datos. Su principal inconveniente, al igual que los métodos fotométricos, es la incapacidad de reconocer bacteriurias debidas a bacterias de crecimiento lento. Es un método muy sensible y bastante específico con relativa rapidez y coste ecónomico elevado. 6.2.4. Microcalorimetría Las bacterias al crecer y desarrollar sus procesos metabólicos desprenden calor que puede medirse con 5 microcalorímetros. Unas 10 bacterias de la especie Escherichia coli generan hasta 30 U/cal/seg/ml, al cabo de una incubación de 3 horas en un medio de

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cultivo adecuado. El sistema se desarrolló principalmente para medir la sensibilidad bacteriana a los antibióticos y se usa muy poco.

método que se buscan otros antígenos en el líquido cefalorraquídeo, la presencia de Escherichia coli K1, por cursar la infección con más gravedad.

6.2.5. Radiometría El sistema Bactec de Becton-Dickinson, emplea substratos radiomarcados, con 14 C, que al ser 14 metabolizados por las bacterias liberan CO2 que es medido en un contador radiométrico. El método es complejo y poco práctico para la detección de bacteriurias, pero excelente para el cultivo de micobacterias, tanto en orina como en otras muestras, ganando muchos días a los sistemas convencionales usados para estas bacterias especiales de difícil crecimiento.

7. LOCALIZACIÓN DE LA INFECCION URINARIA

De los métodos automatizados disponibles, basados en cualquier procedimiento técnico, se puede decir que la mayoría han alcanzado un buen grado de seguridad en el descarte de orinas negativas, los principales problemas que presentan es que son más caros inicialmente, cuando hay que invertir en la máquina, aunque luego se amortizan enseguida, la presencia de algunas células, cristales, y cilindros pueden modificar, ligeramente, los resultados. Los sistemas que se basan en multiplicación de bacterias no son útiles para las de crecimiento lento y para un buen porcentaje de Staphylococcus y levaduras. Los que se apoyan en la colorimetría pueden verse alterados por los pigmentos. Los que útilizan la filtración y tinción no diferencian entre bacterias vivas o muertas, patógenas o no. Por otro lado, esté claro que todo lo que sea automatización y cambiar hábitos y costumbres exige una preparación, distinta a la clásica, sobre todo en la interpretación de los hallazgos, tanto de los microbiólogos como de los clínicos. 6.3. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS Exámenes en fresco y tinciones Tal como se ha descrito anteriormente, el examen de un sedimento de orina en fresco es una técnica de sospecha de infección urinaria que por su tiempo de realización puede ser considerada como un método rápido. Según se use orina centrifugada o no, teñida o no, existen varias posibilidades que correlacionan el número de microbios observados con los cultivos cuantitativos. La combinación de la visión en fresco y teñida por el método de Gram, imprescindible en los casos graves y urgentes, puede competir en simplicidad y eficacia con las más sofisticadas técnicas mencionadas anteriormente. Estas solo se justifican cuando el número de muestras a procesar es tan elevado que el tiempo que debería emplearse para la investigación microscópica y tinción supera la capacidad técnica del laboratorio. - Detección de antígenos de uropató genos En el caso de sospecha de pielonefritis o sepsis de origen urinario, es importante detectar, por el mismo

Uno de los puntos más interesantes respecto al tratamiento de las infecciones urinarias es el que se refiere a la localización del nivel de invasión. Conocer el lugar de localización de la infección urinaria es de suma importancia porque va a condicionar el tipo de tratamiento antimicrobiano, las dosis y, lo que es muy importante, la duración del mismo. Por ello, siempre se ha tratado de encontrar métodos e indicadores clínicos que ofrezcan cierta seguridad de donde esté localizada la infección del aparato urinario, si es de vías o si es parenquimatosa, y de que tipo de parénquima. Las infecciones urinarias, como ya hemos indicado, se clasifican en dos grupos : infección intersticial o parenquimatosa (mal llamada infección alta), como pielonefritis, prostatitis y orquiepididimitis, e infección del tracto urinario o de vías (mal llamadas infección baja), como cistitis y síndrome uretral femenino. La dificultad principal ante esta clasificación estriba en saber como se van a distinguir ambas entidades. La sintomatología clínica cuando es completa y florida permite esta diferenciación. Así, en las infecciones urinarias no complicadas, con la excepción de la bacteriuria asintomática y la prostatitis crónicas, son procesos de tipo agudo y los datos clínicos aportados por el enfermo permiten establecer, en la mayoría de los casos, alrededor del 90 % una diferenciación muy segura. Por ello, las técnicas de localizacion sólo están justificadas en los casos de duda, en la prostatitis crónica y en la bacteriuria asintomática. El panorama cambia sustancialmente cuando se consideran las infecciones urinarias complicadas. El diagnóstico clínico solo orienta en el 50 % de los casos, puesto que en el resto, los síntomas son incompletos y/o complejos (deformación por la causa complicante) o faltan totalmente (casos crónicos). Además de los datos clínicos orientativos existen métodos directos y métodos indirectos. Los métodos directos son biospsia, cateterismo ureteral, punción renal percutanea y la técnica del lavado vesical. Entre los indirectos citaremos la sintomatología clínica, urografía, presencia de cilindros en la orina, concentración urinaria, excreción de enzimas, distribución del galio 67, y detección de anticuerpos que se unen a las bacterias causantes de la infección, los llamados ACB (antibody coated bacteria). 7.1. MÉTODOS DIRECTOS La biopsia renal no es segura desde un punto de vista diagnóstico, motivado porque la alteración

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parenquimatosa no suele tener distribución homogénea: la pielonefritis, por ejemplo, es una infección focal. El cateterismo ureteral, la punción renal percutanea y el cultivar la orina procedente del colector correspondiente, es un buen método de localización, aunque requiere instrumentación y tiempo. El lavado vesical, método preconizado por Fairley ya en 1967, consiste en instilar en la vejiga, por cateterismo, 2 litros de solución salina fisiológica con un antibiótico aminoglucósido, recogiendo luego el líquido vesical a los 10, 20 y 30 minutos. La localización de la infección es vesical si los 3 cultivos són estériles, mientras que puede ser renal si siguen siendo positivos. 7. 2. MÉTODOS INDIRECTOS De los datos clínicos que se pueden considerar como indirectos nos ocuparemos ampliamente en el apartado 9. 7.2.1. Diagnóstico por imagen Entre los estudios, para los casos que por fracaso terapeútico de una infección correctamente tratada existan sospechas de uropatía obstructiva u otras anormalidades anatómicas, están las radiografías con o sin contraste, la ecografía, la TAC y la resonancia magnética, con cuyo uso pueden detectarse alteraciones condicionantes de infecciones parenquimatosas crónicas de origen, la mayor parte de las veces, obstructivo. La exploración radiográfica es obligatoria en los neonatos y lactantes, ya que la bacteriuria suele ser secundaria a alteraciones anatómicas, generalmente corregibles y su ignorancia puede llevar, con los años, a situaciones graves de infecciones crónicas e insuficiencia renal. La útilización de la sustancia radioactiva galio y su posterior distribución por el organismo, da buenos resultados, sobre todo en los niños, pero es un sistema caro y complejo. 7.2.2. Capacidad de concentración osmolar Pretéritos trabajos demostraron que los pacientes con pielonefritis tenían una capacidad para concentrar la orina menor que los sujetos normales. Se observó en un estudio con 66 pacientes (31 cistitis y 35 pielonefritis) que la media de la máxima concentración osmolar era significativamente menor (784 ± 167 mOsm/Kg en infecciones unilaterales y 721 ± 112 mOsm/Kg en infecciones bilaterales) en el grupo con infección renal respecto del grupo con cistitis (894 ± 163 mOsm/Kg). Incluso se pudo comprobar por recogida selectiva de orina en los casos con infección unilateral que el riñón afectado era el causante del descenso de la capacidad de concentración. método fácil, rápido y barato, pero que adolece de un intervalo diferencial cuantitativo bajo entre un tipo y otro de infecciones, lo que se traduce en un alto porcentaje de casos duda.

7.2.3. Determinación de enzímas En condiciones fisiológicas, las enzimas que se pueden encontrar en la orina derivan principalmente del riñón y tienen unos niveles conocidos. Cuando se produce una alteración renal, infecciosa o no, muchas enzimas se elevan por encima de los límites normales. Estas pueden tener procedencia preglomerular, de poco interés en las infecciones urinarias; glomerular cuando hay lesión del mismo, pasando, sobre todo, las enzimas de alto peso molecular; tubular, al no reabsorberse las de bajo peso molecular; y postrenal. Entre las enzimas que se liberan cuando hay daño renal, son muchas las que se han buscado, como Llactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina, lisozima (LIS), ß-glutamiltransferasa (GGT), malonato deshidrogenasa (MDH), aminopeptidasa microsomal, ß-N-acetilgalactosaminidasa (NAGT), ß-glucuronidasa (GRS), entre otras. Cuando hay pielonefritis suben NAG, GGT, GRS y aminopeptidasa microsomal, en la aguda, y LIS, LDH5 y MDH, en la crónica; en las cistitis solo la LDH, pero la LDH1 en vez de la LDH5; en las glomerulonefritis, las mismás que en las pielonefritis agudas, con la excepción de GGT; y en el caso de necrosis tubular aguda, ademáss de los enzimas anteriores, sube también la fosfatasa alcalina. Para algunos autores, una de las más útiles es la isoenzima LDH-5 (lactato deshidrogenasa) con una fiabilidad de más del 97%, es entre 30 y 50 veces más alta en los casos de pielonefritis que en los de cistitis, se determina por electroforesis del suero del enfermo. La técnica consiste en la práctica de una electroforesis de 40 minutos a 220 V con un frente de 8,5 cm en membrana de cellogel de la orina del enfermo problema. Una vez finalizada la migración se añade el sustrato LDH-revelador, incubándose las tiras en cámara húmeda a 37 ºC durante 15-20 minutos. Al cabo de este tiempo, las fracciones aparecerán en color violeta claramente diferenciadas. La valoración cuantitativa puede hacerse por simple observación visual (método semicuantitativo), o bien, empleando un lector adecuado. Tiene el inconveniente de no ser muy específica al elevarse, en las hepatitis, colelitiasis, sepsis y otras enfermedades, y subir menos en las pielonefritis agudas que en las crónicas. Así, esta enzima, como otras, se altera rapidamente en la orina, por diferentes inactivadores o activadores, como las simples variaciones de pH o temperatura, lo que obliga a buscar técnicas muy meticulosas y engorrosas, o investigar, en el futuro, métodos menos perfectos pero más rápidos que resulten útiles y orientativos. 7.2.4. Determinación de la alfa2- microglobulina Hace casi dos décadas se sugirió que el aclaramiento de alfa2-microglobulina estaba incrementado en los enfermos con pielonefrittis; sin embargo, se comprobó que muchos otros factores podían también aumentar esta excreción, por lo que su determinación para la localización de la infección ha sido abandonada.

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7.2.5. Investigacion de cilindros bacterianos En 1980 Lidner y cols. identificaron con la ayuda del microscopio electrónico de barrido a 5.000 aumentos, una entidad en el sedimento urinario que es especifico para el diagnóstico de pielonefritis : el cilindro bacteriano. Segun los autores, estos cilindros sólo se han encontrado en enfermos con pielonefritis y están formado por bacterias ligadas por hebras fibrilares de naturaleza proteica, acompañadas con frecuencia de leucocitos en varias etapas de degeneración. Se considera que ya que la microscopia electrónica los ha identificado, el observador experimentado puede detectarlos por técnicas de interferencia diferencial de Normaski o en contraste de fases e, incluso, en los análisis de un sedimento urinario teñido. De esta forma, el diagnóstico de pielonefritis puede realizarse de inmediato con el sencillo y rápido método del análisis de un sedimento urinario. De las tres alternativas propuestas, la tercera parece un tanto peligrosa porque durante el secado y manejo posterior de la técnica tintorial pueden producirse agregados bacterianos que induzcan a un error en el observador. Desde luego, el método presenta la más alta especificidad posible asociada a una extraordinaria sencillez en el método. El principal inconveniente es su sensibilidad, ya que no todas las pielonefritis cursan con la formación de cilindros bacterianos, lo que da una fiabilidad en caso negativo muy baja. 7.2.6. Anticuerpos unidos a bacterias (ACB) Thomás y Jones describieron un método por inmunofluorescencia para detectar la presencia en la orina de anticuerpos ligados a bacterias. Segun los autores, con él se pueden diferenciar las infecciones parenquimatosas de las de vías. Se fundamenta en el hecho de que las infecciones del tracto urinario son superficiales (vía externa del huésped) y por ello no se estimula la producción de inmunoglobulinas. Por el contrario, las infecciones que afectan los parénquimas corresponden al medio interno del huésped, por lo que si la bacteria se encuentra allí localizada, se estimula la síntesis de anticuerpos específicos. Varios autores confirmaron las expectativas en los años siguientes y definieron, además, que los anticuerpos son de síntesis intrarenal, que aparecen a los 11 días de la infección y que están dirigidos contra el antígeno somático 0. En una fase posterior se identificó que los anticuerpos iniciales pertenecían al tipo IgA-secretora. El método de realización es fácil y sencillo, fundamentándose en la demostración de anticuerpos en el sedimento de orina por adición de un suero antigammaglobulínico humano marcado con fluoresceína. En caso de haber anticuerpos ligados a bacterias el antisuero pigmentado queda retenido en la superficie de la bacteria por la reacción antígenoanticuerpo y no es extraído por el lavado posterior. La observación al microscopio con luz ultravioleta con objetivo seco (40x) o inmersión (100x), permite

observar a las bacterias presentando fluorescencia verde. En este caso se dice que la reacción es positiva, lo que se interpreta como signo de infección parenquimatosa. En caso contrario no se produce la fijación del antisuero y este es extraído durante el lavado. La técnica, no se afecta por la inmunodepresión y, bien hecha, con la técnica normalizada, es fiable, con una sensibilidad superior al 80% y una especificidad mayor del 75%, con valor predictivo positivo del 80% para infecciones parenquimatosas, si da positiva y del 85% para las de vías si el resultado es negativo. Los títulos son 1/40 en más del 95% de las infecciones de vías e >1/60 en las de parénquima, más altos cuando la infección esta producida por Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter y Serratia, entre 1/640 y 1/320, que cuando está causada por Pseudomonas, título 1/160. La prueba es también positiva en prostatitis, epididimitis, cistitis hemorrágica y en algunos casos de uretritis; y puede ser negativa, aunque la infección sea parenquimatosa, cuando la tasa de anticuerpos, debido al tiempo de evolución, sea baja. Todavía no está bien valorada en situaciones especiales como embarazo, lesionados medulares, receptores de órganos y niños muy pequeños. 7.2.7. Título de anticuerpos séricos frente a la proteina de Tamm-Horsfall Otro método de localización es investigar Ac tipo IgG o IgM frente a una mucoproteina de origen renal, la llamada proteina de Tamm-Horsfall, que se libera cuando hay destrución de las células tubulares renales; el mejor método es el de enzimoinmunoanális (EIA), usando como detector suero de conejo antihumano conjugado con fosfatasa alcalina y p-nitrodifenil fosfato como revelador. Esta determinación se ha mostrado como un método muy seguro para diferenciar infecciones parenquimatosas de las del tracto urinario. La eliminación de estos autoanticuerpos se incrementa 5 o más veces en casos de infección intersticial renal. Esta elevación es independiente de la presencia o no de sintomatología clínica. Brevemente, la metodología consiste en incubar con movimiento circular el suero problema en tubos de plástico a temperatura ambiente durante 5 horas. Se lava y se añade un antisuero anti-IgM o anti-IgG humano de conejo conjugado con fosfatasa alcalina. Se incuba durante toda la noche, se lava y se mide espectrofotométricamente la actividad enzimática remanente en los tubos mediante la adición de p-nitrodifenil fosfato disuelto en un buffer de dietilamina (1 mol p-NDF/litro DTA, pH 9,8) como enzima sustrato. Los resultados se expresan en porcentajes respecto de un suero de referencia. La técnica es lenta, el resultado se conoce a las 24

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horas y puede servir tanto para orientar sobre la localización de la infección como para controlar su evolución. La sensibilidad esta condicionada a una lesión tubular previa que haya permitido el acceso de la proteína de Tamm-Horsfall al intersticio renal y la producción de autoanticuerpos. La especificidad es su punto débil ya que esta proteína también puede liberarse cuando hay daño celular renal por otras causas distintas a bacterias, como son el uso de antibióticos aminoglucósidos, fenacetina, fósforo, tetracloruro de carbono, venenos biológicos de reptiles, arácnidos, setas y otros. 7.2.8. Frente a las bacterias infectantes La presencia de Ac séricos frente a las bacterias infectantes, obtenidas de la orina por centrifugación, es un método antiguo descrito por Needell en 1955 y ampliamente estudiado por Percival basado en la cuantificación sérica de los anticuerpos. Pueden detectarse mediante técnicas de EIA, hemaglutinación u otras. El fundamento fisiopatológico es paralelo al descrito en el apartado anterior, pero en esta ocasion los anticuerpos que se intentan medir son circulantes. Se hace con bacterias muertas, como antígeno, con el suero del enfermo y con sistemás de detección de la unión Ag-Ac, bien hematíes, conjugado de peroxidasa u otros. La técnica con hematíes es sencilla aunque bastante engorrosa. Se basa en una seroaglutinación usando como revelador biológico a hematíes humanos del grupo 0. El agente causal se suspende densamente en suero fisiológico, se homogeniza con un mezclador y se inactivan las bacterias por ebullición durante 90 minutos y adición de alcohol etílico al 95 %. La suspensión así inactivada es entonces mezclada a partes iguales con una suspensión de hematíes, se incuba a 37º C durante 45 minutos en baño maría y se lava con fisiológico para eliminar el exceso de bacterias que no se han adherido a la superficie del hematíe. A esta suspensión se le añade el suero del enfermo en igual volumen y a dilución progresiva. Se incuba de nuevo durante 45 minutos y se observa la presencia de aglutinación a través de un transiluminador. El último tubo en presentar aglutinación corresponde al titulo de anticuerpos específicos. El problema de esta técnica surge en la interpretación clínica de los resultados. ¿Cuál es el valor discriminativo entre infección de vías y parenquimatosa? Los diseñadores del método sugirieron que valores inferiores al titulo de 1/80 correspondían a infecciones de vías, mientras que los superiores debían ser consideradas como parenquimatosas. Begue y cols. advirtieron que en los niños de menos de 6 meses la frecuencia de reacciones negativas en pielonefritis era muy alta y que esta técnica no podría ser aplicada hasta infantes de edad superior a 1-2 años.

La distribución de los casos (excluidos los niños menores de 2 años) según el diagnóstico y los títulos obtenidos muestra una curva gaussiana bimodal con una zona de inflexión común (títulos de 1/80 y 1/120). La conclusión es que los títulos comprendidos en la zona de inflexión no son concluyentes para definir un diagnóstico. Los títulos inferiores a 1/60 muestran una predicción mínima de infección de vías del 87 %, cifra que aumenta hasta el 100 % para títulos inferiores a 1/15. Los títulos superiores a 1/160 muestran una predicción mínima de infección parenquimatosa del 82 %, cifra que aumenta progresivamente hasta el 100 % para títulos superiores a 1/640. También, según el microorganismo infectante, existen diferencias en los valores límite que están en relación con el poder antigénico de cada especie. Para Escherichia coli la curva es también gaussiana bimodal pero con una zona de inflexión neutra más estrecha. Así, títulos superiores a 1/80 ya indican infección parenquimatosa con una predicción del 70 % y títulos inferiores a 1/80 indican infección de vías con una predicción del 94 %. La distribución en Proteus mirabilis es similar, pero con una zona neutra todavía más concreta, de tal forma que títulos de 1/180 predicen infección parenquimatosa en el 80 % de los casos y títulos de 1/60 infección de vías en el 86 %. En el grupo de Pseudomonas aeruginosa se observa una distribución anormal con curvas bimodales para cada enfermedad, que muestra una amplia zona neutra, por esta razón el titulo de anticuerpos no parece un método discriminativo adecuado para esta especie. La curva del grupo Klebsiella/Enterobacter/Serratia es muy similar a la observada con Escherichia coli. Los casos de prostatitis inducen también títulos altos de anticuerpos (superiores a 1/120), pero cuantitativamente no alcanzan los valores extremos de la pielonefritis, quedando los primeros restringidos a un máximo de 1/1.280 (88 % en la zona comprendida entre los títulos 1/320 y 1/640). Este hecho es lógico si se tiene en cuenta que la respuesta inmunológica es proporciónal a la cantidad de parénquima existente susceptible de ser lesionado. Un punto a tener en cuenta es que la respuesta inmunológica circulante se produce a partir de los 15 días de la agresión bacteriana, por tanto esta técnica no es válida para procesos infecciosos cuya duración sea inferior a las dos semanas. Otra aplicación, además de la diagnóstica, de la determinación del título de anticuerpos es la de poder controlar la evolución del cuadro infeccioso. Si la cepa original del enfermo se congela, puede enfrentarse en fases posteriores con suero del mismo y seguir la evolución cuantitativa de los títulos. Retornos a la normalidad parecen indicar la completa erradicación de la bacteria del parénquima, mientras que el

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mantenimiento de títulos altos señalan una persistencia. Esta característica ha sido empleada para definir la exacta duración de un tratamiento antibiótico. Si bien en las pielonefritis agudas parece claro este proceder, es bastante discutible su eficacia en el control de las pielonefritis crónicas, donde la persistencia o no del antígeno bacteriano puede ser independiente de la progresión de la lesión renal. La correlación entre los métodos TSAE y ACB es muy buena y no se han detectado diferencias significativas entre ambos. 8. CARACTERIZACIÓN PIELONEFRITÓGENAS

DE

LAS

CEPAS

En la actualidad se ha comprobado que existe dentro de la especie Escherichia coli, cepas dotadas de un cúmulo de propiedades virulentas que son repetida y significativamente aisladas de casos de pielonefritis. Desde el punto de vista clínico, los sujetos con infecciones urinarias de vías por estas cepas tienen hasta 10 veces más posibilidades de desarrollar un cuadro de pielonefritis. A estas cepas se les ha denominado con el vocablo de "pielonefritógenas". El acúmulo de factores de virulencia aumenta en proporción geométrica su capacidad invasora renal. Por esta razón se ha propuesto que la determinación de estos factores de virulencia en los Escherichia coli aislados de infecciones urinarias podría ser un punto de referencia sobre el riesgo de padecer infección renal. Dado que Escherichia coli es el principal causante de pielonefritis es la bacteria más estudiada. No es, por tanto, un método para realizar un diagnóstico diferencial, sino para predecir futuras consecuencias. El problema reside en que al ser un tema multifactorial no se ha definido exactamente cuales son los factores que debe poseer una cepa de Escherichia coli para ser considerada como nefritógena. La ya antigua idea de que la expresión de adhesinas MR tipo P era la característica principal, ha sido hoy sobrepasada. Ahora se sabe que las fimbrias P son ciertamente un factor esencial siempre presente, pero no el único. Incluso se habla de variantes del tipo P, llamados tambien subtipos P, cuyo tropismo para el riñón es distinto y en ciertos casos superior. Parece ser que la síntesis de hemolisinas, sideróforos (aerobactina) y factor citotóxico necrotizante son junto a la expresión de adhesinas-MR factores de virulencia esenciales que caracterizan una cepa pielonefritógena. Estudios de biología molecular han definido que el operón que codifica la síntesis de las fimbrias P está estrechamente relacionado con los correspondientes a la síntesis de hemolisina, factor 1-necrotizante y aerobactina, por lo que se denominaron a estos elementos cromosómicos como islas de patogenicidad asociada (PAI). Si los investigadores desarrollan una

sonda génica conjunta, el reconocimienmto de estas cepas podría ser una tarea fácil e incluso económica, lo que para el clínico constituiría un herramienta muy útil en la adopción de una actitud terapéutica y en el estableciemiento de pautas antibióticas. Así, el aislamiento de cepas de Escherichia coli portadoras de PAI en mujeres adultas o ancianos con bacteriuria asintomática podría sentar una razonable base para que estos casos fuesen tratados con antibióticos. 9. SITUACIONES CLÍNICAS 9.1. BASES MICROBIOLÓGICAS Y TRATAMIENTO El tratamiento de las infecciones urinarias continúa sometido a controversias dependientes de los resultados inapropiados que, con mayor frecuencia de la deseada, obtenemos. Diversos factores pueden justificar estos hechos: 1. La existencia de un reservorio de patógenos urinarios (intestino) de imposible o difícil erradicación, a partir del cual colonizan introito y vagina en la mujer y prepucio y uretra distal en el varón. 2. Multiplicidad de microorganismos capaces de provocar infección urinaria. Cerca de una veintena de especies bacterianas aerobias, son identificadas diariamente como patógenos urinarios. A ellas habría que añadir la cada vez más frecuente identificación de hongos, anaerobios, clamidias y micoplasmas como causantes de las mismas. 3. El inapropiado uso de antimicrobianos facilita la selección de microorganismos cada vez más resistentes. 4. El substrato orgánico sobre el que se desarrolla la infección urinaria, es en muchas ocasiones, complejo (obstrucción, litiasis, sondas permanentes, etc), lo que obliga a la adopción de terapias combinadas. 5. Nuestras limitaciones diagnósticas que hacen inviable el precoz reconocimiento de aquellos individuos capaces de sufrir recaídas, ya sea por recidiva (mismo microorganismo) o por reinfección (microorganismo distinto). 6. Elevada incidencia de bacteriuria asintomática, sobre todo en edades extremas de la vida, no eliminable y que en un momento dado, provoca un brote sintomático. 7. Dificultad para localizar el origen de la

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bacteriuria. Aspecto muy importante pues es diferente el enfoque terapeútico ante una infección parenquimatosa que de vía urinaria. Si bien varios de los puntos expuestos no son solucionables, otros, pueden ser eliminados o minimizados en su papel, mediante la conjunción de los datos clínicos y microbiológicos, obtenidos en cada paciente, cuyo resultante permitiría un adecuado empleo de la terapia antimicrobiana. El primer paso es alcanzar la adecuada clasificación de una bacteriuria dada. 9.2. TERMINOLOGÍA Desde hace más de tres décadas se acuñó el concepto de bacteriuria significativa con el objeto de resaltar la importancia del número de colonias aisladas en un cultivo de orina. Así, sólo recuentos superiores a 100.000 unidades formadoras de colonias (ufc)/mL se consideraban como bacteriurias significativas y, por consiguiente, infección urinaria. El principal objeto de esta propuesta pretendía descartar los falsos cultivos positivos por contaminación desde la flora uretral no patógena en el momento de la toma de la orina o de la propia muestra por microorganismos ambientales durante su manipulación. Sin embargo, el problema es más complicado puesto que una bacteriuria significativa no siempre es verdadera. Así, una orina obtenida por micción espontánea en la mujer (chorro medio de la micción) es indicativa de infección sólo en el 80% de los casos, siendo el 20% restante meras contaminaciones. Este porcentaje es aún mayor cuando en lugar de proceder a la siembra con asa se hace por inmersión en placa. Si el recuento se repite (sin mediar tratamiento), en una segunda toma por micción o el paciente tiene sintomatología sugerente de infección urinaria, la posibilidad de acierto diagnóstico microbiológico se eleva al 96%. Cuando la recogida de orina se ha realizado por sondaje uretral estéril la exactitud diagnóstica es del 96%, y 98% en la primera y segunda toma, respectivamente. Cuando la orina la obtenemos por punción suprapúbica de la vejiga o punción lumbar del riñón cualquier número de colonias representa una bacteriuria significativa, ya que al utilizarse una técnica aséptica queda sensiblemente minimizado el riesgo de contaminación. Por el contrario, en determinados procesos, como prostatitis crónica en el varón o en el síndrome uretral femenino excepcionalmente se consiguen recuentos significativos en los cultivos de orina a pesar de una clínica manifiesta. Estos hechos claramente demostrados en la práctica clínica diaria disminuyen el número de tratamientos innecesarios por diagnóstico equívoco. Por todas estas consideraciones, aquellos postulados de Kass, vigentes durante casi cuatro décadas, han sufrido una modificación de acuerdo con las directrices marcadas por la Sociedad Americana de

Enfermedades Infecciosas que baja el listón de recuentos necesarios para considerar infección a 10² ufc/mL en caso de cistitis simple o recurrente y a 10³ ufc/mL en caso de clínica de pielonefritis, manteniendo 5 la significación de 10 ufc/mL para las bacteriurias asintomáticas, complicadas o en pacientes sondados. Estas conclusiones repercuten tanto en los microbiólogos, que deben expresar siempre el microorganismo aislado y el número de ufc/mL (por debajo de 100.000) como en los clínicos, obligados a considerar los recuentos en función de la restante información disponible, representada por los signos/síntomas y las exploraciones complementarias, y en situaciones más complejas ser capaces de evaluar aquellas infecciones por microorganismos especiales o que habitualmente cursan con recuentos bajos. Aparte del urinocultivo disponemos de otras pruebas de laboratorio que ayudan al diagnóstico de la IU. En un metaanálisis sobre los métodos de detección de la IU la mayor sensibilidad de detección la presenta la tinción de Gram (0.93) seguida de la determinación de la esterasa leucocitaria y nitritos (0.88), tras ello la piuria de orina centrifugada (0.67) y la piuria de orina sin centrifugar (0.77) con valores predictivos negativos de 0.05, 0.04, 0.21 y 0.11 respectivamente. 9.3. CLASIFICACIÓN Infección urinaria parenquimatosa (riñon, próstata, epidídimo, testículo) Infección urinaria de vías ( vejiga y ure-tra) Infección urinaria no complicada - Bacteriuria asintomática a. Infancia b. Embarazo - Bacteriuria sintomática a. Pielonefritis aguda b. Cistitis aguda c. Epididimitis aguda d. Prostatitis Infección urinaria complicada - Bacteriuria asintomática - Bacteriuria sintomática Infecciones urinarias de repetición 9.4. INFECCIÓN URINARIA NO COMPLICADA 9.4.1. Bacteriuria asintomática Aparece con relativa frecuencia en las edades extremas de la vida: niños y ancianos. En neonatos y lactantes predomina en varones, luego en el sexo

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femenino, hasta la senectud, donde de nuevo, la incidencia es más alta en el hombre. La presencia no siempre obliga a tratamiento, ya que en el adulto y ancianos de ambos sexos, se tolera bien, con escasa o nula agresividad, siempre que no existan alteraciones anatómicas o funcionales. Es caprichosa en su evolución, con tendencia a la desaparición y reaparición espontánea. Su origen suele ser la vía y rara vez el parénquima. Por la carencia de síntomas deben repetirse los estudios microbiológicos para tratarla adecuadamente. Por el contrario, la bacteriuria asintómatica en niños y en la mujer embarazada tiene potencial morbilidad, que exige un enfoque diferente y la exigencia de su tratamiento, al igual que en adultos en situaciones especiales como: cardiopatía valvular, portadores de prótesis, enfermos bajo tratamiento inmunosupresor, instrumentación urológica, etc., en cuyo caso se tratarán previamente, de forma que se consiga una orina estéril, previniendo así, complicaciones infectivas. a) Infancia. La bacteriuria puede ser la primera manifestación de una anomalía del aparato urinario, por lo que sería complicada. En otras ocasiones no las hay y es simplemente la consecuencia de la fácil colonización microbiana del tramo urinario inferior. Hay que valorar también que cuanto menor edad tenga el niño menos "urinaria" y más "general" será la expresión clínica de esa bacteriuria; así, anorexia, irritabilidad, insomnio, no ganancia de peso y otras alteraciones, son a veces síntomas que acompañan a aquella y por ende, su búsqueda hay que llevarla a cabo en todo niño en el que surjan cambios en sus hábitos. Una vez confirmado, repitiendo el cultivo y observando su asociación a leucocituria o piuria, el tratamiento es ineludible pues si no se elimina induce frecuentemente, lesiones renales en relación inversa a la edad. El uso de antimicrobianos lleva implícito una serie de matices que lo diferencian del adulto. En los últimos años se ha basado la antibioterapia del niño en patrones comunes como son: edad, peso y superficie corporal; sin embargo, en el recién nacido este concepto del niño como "adulto en miniatura" es erróneo, pues en ese período es un organismo dinámico en constante cambio, por lo que fiar la terapeútica a esos parámetros implica generalmente una incorrecta dosificación con doble riesgo, ineficacia o toxicidad. Efectivamente la excreción renal de muchos medicamentos en el neonato es inferior a la previsible en función de su peso porque el flujo sanguíneo renal y la filtración glomerular son bajos. Así mismo, existen diferencias en la fijación proteica y en el transporte y metabolización de los fármacos por la inmadurez de los sistemas enzimáticos. Por el contrario, la absorción, ya sea tras administración oral

o parenteral, así como la distribución orgánica, no varían con respecto al niño de más edad. Por tanto, la primera norma a seguir en el recién nacido estriba en disminuir la dosis y aumentar los intervalos, para de esta manera compensar el déficit de excreción renal, confirmando a través de la determinación de niveles séricos del antibiótico utilizado, lo correcto de nuestra posología. Al existir inmadurez enzimática, que repercute sobre el metabolismo, hay una serie de antimicrobianos que al precisar de metabolización, no pueden ser administrados a estas edades tempranas de la vida. Tal es el caso del cloranfenicol, sulfamidas, tetraciclinas, los tres ya en desuso, rifampicina y anfotericina B. En el lactante, ya estamos en condiciones de recurrir a aquellos parámetros de edad, peso y superficie corporal, para calcular la dosis. En estos niños, puede emplearse cualquier antimicrobiano, excepto las tetraciclinas, ya que se depositan en el esqueleto, deprimiendo el crecimiento óseo, y en los dientes. Tampoco quinolonas, por su posible influencia negativa sobre el cartílago de conjunción, aunque sea un tema en revisión. La vía de administración en la infancia es muy importante. En infecciones graves hay que recurrir a la parenteral para asegurar altos niveles hemáticos e hísticos. Con la ruta intravenosa obtenemos picos elevados rápidamente pero suelen ser causa de tromboflebitis, por lo que obliga a cambios frecuentes de vena. La administración intramuscular asegura niveles adecuados siendo una alternativa válida y, en muchos casos, deseable. La vía oral, si se controla correctamente es muy efectiva, y más confortable para el niño. Esta requiere buena tolerancia, ajuste de dosis y control de niveles, por la labilidad de la absorción. Para facilitar ésta, es importante efectuar el aporte medicamentoso, con estómago vacío. La duración se basa en ciclos cortos de tratamiento, diez días, con control bacteriológico precoz, 48-72 horas, de la eficacia del mismo pues, en ese plazo, la orina es ya estéril. De existir aún bacterias, aunque hayan disminuido en número, es aconsejable variar de antimicrobiano. Con esta pauta eliminamos la bacteriuria, aunque la incidencia de recurrencias es elevada. Una prolongación de la terapia no reporta mayores beneficios. De igual modo, la instauración de entrada, tras negativizar la orina, de una profilaxis a dosis baja no está justificada, salvo en pacientes con brotes repetitivos. Hay que tener en cuenta, además, que los niños no son dóciles a tratamientos de larga duración, lo que comporta, que no se lleven de forma correcta. Para estos tratamientos profilácticos prolongados hay que elegir antimicrobianos de actividad preferentemente urinaria, poco tóxicos, que no alteren la flora intestinal (para evitar la aparición de resistencias) y de bajo coste: nitrofurantoína, sulfametoxazol-trimetoprim, y cefalexina,

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preferentemente. Se debe administrar una dosis única y nocturna pues con el sueño los mecanismos hidrodinámicos de defensa vesical no actúan. La bacteriuria en niños, dado el elevado número de alteraciones orgánicas a ella asociadas, requiere estudio. En las niñas antes de los cinco años también. En los mayores, esperamos a que se produzca un segundo brote, por la facilidad de colonización que les otorga el sexo. b) Embarazo La incidencia de bacteriuria asintomática es de un 47%. La gestación induce una serie de cambios que hacen a la mujer más sensible a los microorganismos colonizadores del aparato urinario: atonía del músculo liso de uréter y vejiga (efecto hormonal), compresión ureteral por el útero (sobre todo del derecho), disminución de la capacidad vesical por compresión uterina, modificación del pH vaginal. Todo ello facilita la colonización y posterior multiplicación de los microorganismos hasta vejiga y riñón. Otros a su vez, influyen sobre la farmacocinética de los antimicrobianos y hay que tomarlos en consideración a la hora del tratamiento: rápido aclaramiento de los fármacos, disminución de la concentración plasmática de proteínas, elevación del metabolismo hepático, descenso de la absorción oral, incremento de la difusión a través de la barrera materno-fetal placentaria. La bacteriuria, que es más frecuente a mayor edad y número de partos, surge en el primer trimestre del embarazo, asintomática y de no eliminarse, produce infecciones sintomáticas, sobre todo, pielonefritis en el curso del segundo-tercer trimestre. Además de este riesgo de infección urinaria sintomática, la bacteriuria induce: anemia, hipotensión, disminución de función renal en la madre y prematuridad, mayor mortalidad e infección en el feto. Por todo ello el control microbiológico de la orina es recomendable durante el embarazo y si aparece bacteriuria confirmada debe tratarse. El período más crítico, por el posible efecto teratógeno, son las primeras catorce semanas (fase de organogenésis) por lo que si es factible , se postpone el tratamiento. Este se basa en ciclos de cinco-siete días (cistitis), pues no está demostrada mayor eficacia con períodos más largos y sí superior números de recaídas. Si estamos ante una pielonefritis, la duración puede ampliarse hasta diez días. Si se presentan más de tres brotes de bacteriuria es conveniente realizar terapia supresiva nocturna, a dosis baja durante todo el resto de la gestación. Los cambios que antes señalábamos y sobre todo los riesgos tóxicos para el feto limitan la elección de los antimicrobianos. Los únicos seguros durante todo el embarazo son las penicilinas, cefalosporinas, monobactanes y fosfomicina, de imprescindible inclusión en el antibiograma para estas mujeres. En los restantes deben sopesarse estrictamente los riesgos de su uso con las ventajas de su elección. El

segundo trimestre es el menos problemático en este sentido. Durante la lactancia hay antimicrobianos que pasan a la leche materna y por ende, al niño (sulfamidas, cloranfenicol, tetraciclinas, macrólidos). Consecuentemente, hay que considerarlo, sobre todo en terapias prolongadas. 9.4.2. Bacteriuria sintomática. Destacan pielonefritis, prostatitis, epididimitis, con carácter agudo, en las de parénquima, y cistitis y uretritis en las de vías. a) Pielonefritis aguda Clínicamente cursa con fiebre, escalofríos, dolor lumbar, a los que suelen asociarse, pero no siempre, síntomas del tramo urinario inferior: polaquiuria, imperiosidad, dolor o escozor miccional. Éste es el cuadro típico del adulto. En neonatos la fiebre falta en la mitad de los casos, destacando el retraso ponderal. En lactantes a la fiebre puede asociarse dolor abdominal difuso, vómitos, irritabilidad y retraso ponderal. A partir de los 2-3 años ya surgen síntomas urinarios. En el anciano, por el contrario, éstos pueden no estar presentes y sí otros: gastrointestinales y pulmonares. Las enterobacterias gramnegativas son, en cualquier caso, las habitualmente causantes: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella. Dentro de las grampositivas, Enterococcus faecalis. La pielonefritis aguda es importante porque posibilita bacteriemias y daño renal si no se trata correcta y precozmente. La presencia de microorganismos en el riñón induce una serie de cambios histológicos y metabólicos que, por sí solos, son capaces de lesionar el órgano. El tratamiento requiere antimicrobianos capaces de obtener concentraciones elevadas en orina, suero y tejido renal. Ha de iniciarse en cuanto se produce el diagnóstico, por la rapidez con que se pueden provocar aquellas lesiones. Una vez tomada orina para cultivo y sedimento para efectuar una tinción de Gram (para aproximarnos al microorganismo causal), así como sangre (hemocultivo), se elige un antimicrobiano que, además de reunir aquellas condiciones, sea bactericida, poco tóxico y de administración cómoda. Los antimicrobianos orales que reúnen estas condiciones, son utilizables: fluorquinolonas (un 20 % de cepas de Escherichia coli resistentes en España), derivados de penicilina y cefalosporinas. La vía parenteral obtiene, por una mayor biodisponibilidad, niveles más rápidos y mayores. Los aminoglucósidos y cefalosporinas de 2ª generación son los más usados. Los monobactanes y las cefalosporinas de 3ª generación, son restringibles a pielonefritis complicadas o no-complicadas desarrolladas en un paciente hospitalizado previamente. La asociación de antimicrobianos, en esta infección no complicada, no es justificable de inicio. La duración del tratamiento es de 7-14 días. Ciclos más largos, no han mostrado mayor eficacia. A los 2-3 días post-tratamiento, al igual que 1 y 4

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semanas después, hemos de efectuar un cultivo de orina para confirmar la curación microbiológica, descartando así, una bacteriuria asintomática, capaz de lesionar el riñón. Si transcurridas 24-48 horas de iniciada la terapia no hay respuesta clínica, debemos replantearnos la misma, orientados ya, por la evolución del cultivo y el antibiograma. A la búsqueda del posible factor causal realizamos radiografía simple de aparato urinario (diagnóstico de litiasis radiopaca) y ecografía renal (dilatación de vías, masas, litiasis, etc.). En un varón por la menor frecuencia de esta infección, haremos urografía. En la mujer sólo aquellas exploraciones y si hay hallazgos, éstos nos guiarán los pasos siguientes, si la bacteriuria persiste o reaparece, la urografía está indicada. b) Cistitis aguda La cistitis, en un sentido amplio, se define como cualquier situación inflamatoria aguda o crónica que afecta a la vejiga urinaria en ausencia (no complicada) o presencia (complicada) de enfermedad urológica subyacente. Es la infección sintomática más común en la mujer. La distribución por edades indica una curva gaussiana con un pico máximo comprendido entre los 20-30 años. Distribuidos según el patógeno aislado muestran curvas similares con la excepción de Staphylococcus saprophyticus en el cual el 70 % se halla comprendido entre 16-25 años, lo que parece indicar una estrecha relación con el inicio de la actividad sexual. El diagnóstico clínico es fácil. La cistitis simple se caracteriza por la presencia de síndrome miccional aislado (75% de los casos) o acompañado de dolor hipogástrico (18-20% de los casos). Alrededor del 20% presentan hematuria macroscópica y un 4% refiere, además, molestia lumbar bilateral que no aumenta con la puñopercusión renal. Las cistitis simples son afebriles en el 90% de los casos y el resto cursan con febrícula. La asociación de la sintomatología con un sedimento en el que se observe piuria y bacteriuria es motivo suficiente para un diagnóstico provisional de cistitis bacteriana. El diagnóstico de confirmación se basa en el cultivo de orina y aislamiento del agente causal. La presencia de microorganismos en la orina, la diferencia de cuadros clínicos similares no microbianos, denominados cistopatías o cistitis no bacterianas. Los cultivos son monomicrobianos en más del 95% de las veces, con recuento de colonias 6 5 superiores a 10 ufc/ml en algo más del 70%, entre 10 6 5 -10 ufc/ml entre un 5- 10% e inferiores a 10 ufc/ml entre un 20- 25% de los casos. La etiología está restringida a cinco patógenos principales que son Escherichia coli (>80%), Staphylococcus saprophyticus (7-12%), Proteus mirabilis (4-6%), Klebsiella spp. (1-2%) y Enterococcus faecalis (0,51%). Los Escherichia coli uropatógenos, a diferencia

de los denominados propiamente fecales, expresan siempre uno o varios tipos de adhesinas muy funcionales. Estas pueden ser de tipo fimbriado MS y/o MR (Subtipos P, S y F) y afimbriado o ligandinas superficiales con una gran apetencia por los epitelios del aparato urinario y glándulas anexas (escamoso, transicional, cúbico y glandular prostático). Staphylococcus saprophyticus y Enterococcus expresan unas adhesinas superficiales capaces de colonizar muy eficazmente el introito vaginal (especialmente el primero) y las superficies inertes (especialmente el segundo). La vía ascendente es la puerta de entrada para una ulterior invasión de estructuras del árbol urinario sano. Como tratamiento antibiótico, al corresponder a una infección de la vía urinaria, cualquier antimicrobiano con alta excreción renal y por ello capaz de obtener elevadas concentraciones en orina, es útil, siempre que sea activo frente a gramnegativos. La sintomatología obliga al inicio empírico del tratamiento. Hay que recoger previamente orina para cultivo y sedimento (Gram, siempre que sea posible). La pauta clásica es la administración de un antimicrobiano de exclusiva eliminación renal, sin niveles séricos o hísticos, con lo cual se reduce el riesgo de modificar la flora intestinal o vaginal (lo que facilita las recaídas). Quinolonas como ácido pipemídico y norfloxacina, son electivos. Cotrimoxazol o nitrofurantoína, han perdido actividad y han sido relegados, por aquellos. Ampicilinas, considerando las cepas resistentes, y cefalosporinas orales, también son eficaces. La duración clásica es de siete días; sin embargo, la constatación de la pronta desaparición de los patógenos y la sintomatología, ha proporcionado regímenes más cortos, 3-5 días, con igual resultado e incluso el empleo de dosis única: administración de una sola vez, de la dosis total diaria del antimicrobiano elegido. Ello se basa en que, en la vía urinaria, concentraciones muy altas en corto espacio de tiempo son tan resolutivas como concentraciones menores pero sostenidas. La dosis única tiene varias ventajas respecto a la pauta clásica: menor incidencia de efectos adversos, mejor aceptación y fidelidad de los pacientes, bajo riesgo de mutantes resistentes. Se le atribuye también un papel diferencial sobre el origen y causa de la bacteriuria, ya que cuando falla y persiste ésta, correspondería a un origen parenquimatoso o complicado, salvo que la bacteria causal fuese resistente al antimicrobiano empleado. Aquí es válido usar de nuevo dosis única de otro fármaco. Actualmente, nos inclinamos por un tratamiento corto, de tres días, oral y si la paciente tiene intolerancia digestiva o dificultad de seguimiento de la pauta empleamos una dosis única parenteral. Es recomendable efectuar un control microbiológico una y cuatro semanas después de terminado aquél. c. Epididimitis aguda.

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Es una infección típica del varón joven, generalmente secundaria al "reflujo" de microorganismos desde uretra prostática, vía el conducto deferente. Por ello, suele ser el "pregonero" de una prostatitis. En varones menores de cuarenta años el microorganismo causal predominante es Chlamydia trachomatis. En mayores de 50-60 años son las enterobacterias y son secundarias a un proceso obstructivo en uretra o próstata o instrumentación uretral (epididimitis complicada). El cuadro clínico habitual cursa con fiebre, aunque puede faltar, y dolor en el hemiescroto, que está aumentado de tamaño, con incremento de la sensibilidad, sobre todo, con determinados movimientos o al palpar el epidídimo que está engrosado. El diagnóstico microbiológico, si la etiología es bacteriana, (enterobacterias), se fundamenta en su identificación en el cultivo de orina. Si es por Chlamydia trachomatis, la orina y el semen no son buenos medios para cultivarlos. Es más fiable la obtención por punción directa del líquido epididimario, pero es una maniobra agresiva, molesta y con abundantes fracasos. La presencia de leucocitos en el sedimento urinario o semen con cultivo bacteriano negativo, sugiere esa etiología. El tratamiento, en este caso, se basa en tetraciclinas: doxiciclina o minociclina, 100-200 mg/día, por un período de 6-8 semanas. En mayores, pensando en enterobacterias, elegiremos antimicrobianos activos frente a los habituales de la infección urinaria (Escherichia coli, Klebsiella, Proteus) o según el cultivo, capaces de obtener concentraciones en parénquima testicular y epididimario: aminoglucósidos, cefalosporinas de segunda generación, monobactanes, derivados de penicilina, o quinolonas. La duración puede ser de 10-14 días. Si a pesar de la correcta elección la evolución es mala habrá que recurrir a la cirugía. d. Prostatitis Dentro de las infecciones parenquimatosas, la prostatitis constituye la infección urinaria más habitual en el varón entre la segunda y cuarta década de la vida. Su prevalencia se estima, según recientes estudios en el 11% en sujetos menores de 50 años y en el 8,5% de los mayores de esa edad. El Instituto Nacional de Salud de EE.UU. (NIH) ha propuesto a través de su panel de expertos una nueva clasificación que intenta acotar los posibles diagnósticos de prostatitis. El diagnóstico de las prostatitis no es sencillo. La abundante flora uretral normal (grampositivos [Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium, Streptococcus spp., Streptococcus grupo D, etc.]; bacterias gramnegativas [básicamente enterobacterias]; Mycoplasma hominis y Ureaplasma uralyticum, Chlamydia trachomatis y hongos originan problemas a la hora de discernir su auténtico papel patógeno cuando son aislados en los medios de

cultivo. Por otro lado, la peculiar anatomía de la próstata es otro factor importante a la hora de enjuiciar las posibilidades diagnósticas. Las manifestaciones clínicas son también complejas dado que muchas veces los síntomas son escasos o inexistentes, comportando únicamente alteraciones en el semen que condicionan infertilidad. En otras ocasiones, predominan las manifestaciones sexuales: pérdida total o parcial de la erección, eyaculación dolorosa, hemospermia. Lo más habitual, sin embargo, es la existencia de dolor genital o perineal y síntomas urinarios (disuria, imperiosidad, polaquiuria, micción dolorosa e incluso retención aguda de orina). La prostatitis aguda presenta una clínica más llamativa y sugerente de infección: fiebre con escalofríos, dolor lumbosacro y perineal, malestar general e intensas molestias miccionales. El cultivo fraccionado es el método más utilizado en el diagnóstico de las prostatitis y también el más fidedigno. Se basa en la obtención por separado de las fracciones inicial y media de la orina. Realizamos entonces masaje prostático, recogiéndose en otro recipiente estéril la secreción procedente de la glándula. Por último, la orina postmasaje que "arrastrará" los restos de aquella que permanezcan en la uretra y el cultivo del semen obtenido por masturbación. La prostatitis bacteriana se caracteriza por la presencia en secreción prostática, orina postmasaje o semen, de una o más bacterias gramnegativas que no crecen en los cultivos de las fracciones inicial o media, o, siendo la misma, los recuentos son superiores en una fracción logarítmica al menos. Con estas consideraciones cuantitativas, el papel de las bacterias gramnegativas es uniformemente aceptado (E. coli, K. pneumoniae, Proteus, son las más habituales). No sucede lo mismo con las grampositivas. Del antiguo criterio de otorgarles responsabilidad cuando cumplían aquel condicionante numérico hemos pasado, tras distintos estudios, a considerarlas excepcionalmente causantes de prostatitis crónica, incluyendo E. faecalis. Para ello es preciso la repetición del cultivo fraccionado sin mediar tratamiento y obtención de idénticos resultados. Cuando ante la sospecha clínica de prostatitis crónica, el cultivo fraccionado es negativo, puede corresponder a falso resultado o a una de las formas restantes: abacteriana crónica / síndrome doloroso pelviano crónico o prostatitis inflamatoria asintomática. La repetición del estudio con resultado negativo nos lleva al diagnóstico de las otras entidades en función de la presencia (prostatitis crónica abacteriana o tipo IIIa) o ausencia (síndrome doloroso pelviano o tipo IIIb) de leucocitos en semen, secreción prostática y orina postmasaje. En cuanto al tratamiento, la prostatitis aguda (categoría I de la clasificación NIH) exige un inmediato

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tratamiento antimicrobiano, una vez recogida la orina y, si lo hay, exudado uretral (que debe fluir espontáneamente) para cultivo. Como las bacterias gramnegativas son las habitualmente causantes de la infección, optaremos por un antibiótico bactericida, con altas concentraciones en suero y buena difusión tisular, administrable por vía parenteral, ya que así tendremos mejor biodisponibilidad en las primeras fases del tratamiento. Aminoglucósidos, cefalosporinas de 3ª generación y monobactanes cumplen estas condiciones. La respuesta clínica es rápida (24-48 horas) si el fármaco es adecuado, de lo contrario, consideraremos la posibilidad de cambios orientados ya por la situación del cultivo. La terapia oral debe cubrir, al menos, 14 días. Después del tratamiento de choque con cualquiera de los antimicrobianos señalados es conveniente cambiar a uno con probada difusión intraprostática (si éste no lo hace) durante el tiempo restante del tratamiento: quinolonas orales, doxiciclina o minociclina. En la prostatitis bacteriana crónica (categoría II de la clasificación NIH), son complejos tanto el diagnóstico como el tratamiento puesto que los antimicrobianos deben ser capaces de alcanzar por completo el interior de la glándula. Por ello requieren cumplir una serie de condicionantes: liposolubilidad, unión proteica baja, pKa alto y pH ácido. Así, difunden adecuadamente al líquido prostático: trimetoprim, doxiciclina, minociclina, ácido pipemídico, norfloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina, fosfomicina, aztreonam y ceftriaxona. Los ciclos de tratamiento son de 6-12 semanas, con control microbiológico fraccionado una semana después. En los casos inicialmente refractarios al tratamiento utilizamos una terapia antimicrobiana supresora durante un lapso de tiempo más prolongado y eyaculaciones frecuentes. Otra opción terapéutica, que obviaría los problemas ligados a la difusión, es la administración intraprostática por punción de antibióticos, que se facilita mediante el uso de ecografía. En las antiguamente catalogadas como prostatitis abacterianas crónicas encontramos ahora dos subcategorías en las que los diferentes tratamientos no se hallan tan unánimemente respaldados por trabajos en la literatura científica. En la IIIa o síndrome de dolor pelviano crónico inflamatorio pautamos tandas de antimicrobianos de modo empírico con recomendación de eyaculaciones frecuentes. También se aconsejan los Alfabloqueantes (como fenoxibenzamina, alfuzosina, terazosina o tamsulosina) antiinflamatorios (como indometacina o los nuevos inhibidores COX-2), inhibidores de la 5-a-reductasa (finasteride), pentosanpolisulfato e incluso la termoterapia que mediante el calor aplicado directamente a la próstata podría contribuir a la cicatrización de la inflamación crónica o mejorar la sintomatología por lesión de los plexos nerviosos prostáticos. En la subcategoría IIIb o síndrome de dolor pelviano crónico no-inflamatorio se recomienda probar con alfa bloqueantes, analgésicos,

relajantes musculares, técnicas de bioretroalimentación y cambios en el estilo de vida. En la categoría IV o prostatitis asintomática inflamatoria no se recomienda tratamiento alguno excepto en casos de PSA elevado o infertilidad. 9.5. INFECCIÓN URINARIA COMPLICADA. - Bacteriuria asintomática La razón más habitual de este tipo de bacteriuria, es la presencia de enfermedad orgánica o funcional en el aparato urinario, por ello, su tratamiento se lleva a cabo, sólo cuando es posible eliminar la alteración que la motiva. Si ello no es factible, el uso de antimicrobianos es contraproducente, ya que no se llega a conseguir su erradicación definitiva y sí la selección de microorganismos cada vez más resistentes a los antimicrobianos. La excepción a esta norma viene dada por los pacientes con reflujo, ya que la bacteriuria tiene capacidad de inducir lesión parenquimatosa y con litiasis infectivas (cálculos de fosfato amónico-magnésico o estruvita). El tratamiento antimicrobiano a dosis plena, durante 10-14 días, seguido de terapia supresiva a baja dosis, sería la alternativa. Esta misma pauta es aplicable a pacientes de alto riesgo: inmunocomprometidos, trasplantados, portadores de prótesis, cardiopatía valvular. En los restantes, nos limitamos a realizar cultivos periódicos para tener perfectamente identificado el microorganismo y su sensibilidad, para que en el momento en que se produzca un brote sintomático, el tratamiento sea inmediato y adecuado. Si vamos a corregir el factor causal, la terapia antimicrobiana la iniciamos el día previo a la cirugía o instrumentación, para prevenir complicaciones infectivas como infección de herida o diseminación. Si la bacteriuria tiene su origen en la vía urinaria o próstata, la continuamos durante 5-7 días. Si se origina en parénquima renal es preferible prolongar el antimicrobiano 10-14 días, sobre todo, si hay lesión intersticial. En este caso concreto, el inicio de la antibioterapia se puede adelantar 3-4 días a la fecha prevista para el acto quirúrgico o instrumental. Una y cuatro semanas post-tratamiento hay que llevar a cabo cultivos de orina para confirmar la desaparición de la bacteriuria. Un caso peculiar de bacteriuria asintomática complicada es el uso de sonda vesical permanente. En el 7-16% de los pacientes hospitalizados se practica, en algún momento de esa hospitalización, sondaje vesical. Tras un único procedimiento con retirada inmediata, ese riesgo de bacteriuria es de un 5-6% (0'5-1% en pacientes ambulatorios), si la sonda permanece, el riesgo se incrementa un 4-7'5% diario aunque en la práctica y salvo que se utilicen bolsas colectoras de orina de drenaje cerrado (no se desconecta el tubo de la bolsa al extremo de la sonda, en ningún momento, y la orina se vacía por un drenaje

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inferior), a los cuatro días, prácticamente el 100% de los sondados, tienen bacteriuria. El empleo de antimicrobianos no la previene, más bien al contrario, selecciona mutantes bacterianas resistentes. Tampoco el uso de antisépticos locales (lavado vesical), es efectivo y con los mismos inconvenientes. La postura que propugnamos tiene otras bases: colocación aséptica de la sonda y empleo de bolsas de circuito cerrado. Si no los hubiere, utilizamos uno "semicerrado" que exige, al desconectar la sonda, la oclusión previa del extremo para cerrar su luz, evitando el contacto de ésta con el medio ambiente y la limpieza de ese extremo antes de conectarlo al tubo de la bolsa, con un antiséptico. Es también necesaria la limpieza cuidadosa (agua y jabón), un par de veces al día de la porción de sonda en contacto con el meato uretral, así como de los genitales. Se ha de evitar el reflujo de orina desde la bolsa a la vejiga, con la adecuada colocación, al igual que facilitar el flujo constante, al impedir las acodaduras. La sonda deberá mantenerse el mínimo de días necesarios dada la directa relación existente con la bacteriuria. A su retirada, por el traumatismo que puede producirse en la uretra, es el momento en que se producen bacteriemias. De ahí que, dado que la bacteria está tipificada, una hora antes empezamos a usar el antimicrobiano adecuado para prevenir ese evento y lo mantenemos cinco-siete días, para erradicar aquella definitivamente. La aceptación por los sanitarios de la morbilidad del sondaje permanente lleva implícito el uso restringido de éste: sólo cuando no son utilizables otros sistemas de recogida de la orina (preservativos colectores, cateterismo intermitente), de esta forma reduciremos o eliminaremos el indiscriminado y por ende injustificadamente elevado uso de esta técnica y con ello de la bacteriuria. - Bacteriuria sintomática La presencia de síntomas atribuibles a la propia bacteriuria exige el inmediato tratamiento, una vez efectuadas tomas de orina para sedimento (tinción de Gram) y cultivo y de sangre (si hay hipertermia superior a 38º C), para hemocultivo. Cuando existe obstrucción o un foco séptico localizado, aquél por sí sólo no es suficiente y debe complementarse con la desobstrucción inmediata, ya sea del tramo urinario inferior (sondaje o punción suprapúbica) o del superior (cateterismo ureteral o punción renal parenteral) o el drenaje del foco (quirúrgico o instrumental). La cirugía o instrumentación presuntamente resolutiva, se debe llevar a cabo, con el paciente asintomático y, preferiblemente, aún bajo terapia antimicrobiana, que se continuará en el postoperatorio, entre 3-7 días, según la etiología y desarrollo del proceso. Si no hay solución definitiva, una vez desaparecida la sintomatología y tras 7 (origen en vías) o 10-14 días (parénquima) de administración del antimicrobiano,

pasaremos a una observación clínica y control microbiológico a los 7-30 días y luego con la periodicidad que la enfermedad de base y la situación general del paciente aconsejen, con un mínimo trimestral y máximo mensual, y siempre que haya un cambio de sintomatología. Si la bacteriuria está tipificada y conocemos la sensibilidad de la bacteria, la elección del antimicrobiano vendrá dada, entre los activos, por la localización en parénquima o vía de aquél y las características del enfermo, en cuanto a gravedad y posibilidades de la administración oral y la supeditación a la cirugía. Cuando la bacteriuria es sintomática y no identificada, a los parámetros anteriores hay que añadir el desconocimiento de la bacteria. Una técnica rápida y sensible, como es una tinción de Gram, nos facilita una primera clasificación en grampositivos o negativos, importante para elegir el antimicrobiano, pues de lo contrario, sobre todo si el cuadro clínico es grave, debemos recurrir a una asociación que cubra ambos tipos de bacterias e incluso, anaerobios. En cualquier caso, el antimicrobiano ha de ser bactericida, con actividad preferente sobre gramnegativos o grampositivos (según tinción o conveniencia de asociación), con eliminación renal y baja toxicidad. Si la bacteriuria es de origen parenquimatoso, el antimicrobiano tendrá además que alcanzar niveles séricos e hísticos. La vía parenteral logra mejor biodisponibilidad en menor tiempo que la oral y por ello, distribución hística más rápida y eliminación renal. Quinolonas, amoxi/clav y cefalosporinas orales, constituyen una alternativa a la administración parenteral, sobre todo en bacteriurias no parenquimatosas. En cualquier caso, facilitan la continuidad del tratamiento tras un inicio parenteral impuesto por la gravedad o requerimiento quirúrgico. Es en las bacteriurias sintomáticas complicadas donde la elección empírica del antimicrobiano exige aquellos más activos, como cefalosporinas de tercera o cuarta generación, aminoglucósidos, o monobactanes. Ante la sospecha de la presencia de anaerobios (implicación del intestino en el proceso, diabéticos, crepitación de un área corporal, gas en aparato urinario), los carbapenemes o metronidazol, son los más indicados. Una vez tenemos el microorganismo identificado y conocida su sensibilidad es más cómodo e igual de eficaz, mantener, si es factible, sólo antimicrobianos selectivos. 9.6. INFECCIÓN URINARIA DE REPETICIÓN Estas se producen como norma en las infecciones urinarias complicadas, mientras permanece la causa,

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pero también en las no complicadas. Las razones que explican la repetición de la bacteriuria, ya sea por la misma bacteria (recidiva) o diferente (reinfección), son: 1. Elección equivocada del antimicrobiano, hecho frecuente cuando la elección del fármaco se ha llevado a cabo sin conocer su actividad y basándose, exclusivamente, en experiencias anteriores. No debemos olvidar que cuando en una comunidad los antimicrobianos se emplean libremente es fácil la aparición de resistencias que comportan, sino se valoran, el fracaso del tratamiento. 2. Duración del tratamiento, pues ya hemos señalado las diferencias en la duración del tratamiento en función de la etiología. 3. Desarrollo de resistencias. Es infrecuente la aparición de resistencias durante el tiempo de administración de un antimicrobiano a dosis adecuadas. Cuando ello se produce es motivado, generalmente, por un pequeño grupo de microorganismos, que ya eran resistentes antes de iniciarse el tratamiento y que han visto favorecido su crecimiento por la desaparición de los que sí eran sensibles a ese fármaco. Por tanto, es obligado cambiar el antimicrobiano, eligiendo uno efectivo para aquéllos. produce es motivado, generalmente, por un pequeño grupo de microorganismos, que ya eran resistentes antes de iniciarse el tratamiento y que han visto favorecido su crecimiento por la desaparición de los que sí eran sensibles a ese fármaco. Por tanto, es obligado cambiar el antimicrobiano, eligiendo uno efectivo para aquéllos. 4. Alteraciones estructurales. La presencia de alteraciones (reflujo, vejiga neurógena, litiasis, obstrucción) es, como ya hemos comentado, causa habitual de recaídas. Su corrección es entonces imprescindible. 5. Factores desconocidos. No siempre es posible evidenciar la causa desencadenante de aquéllas o conociéndolas no son eliminables (anomalías congénitas no reparables, vejiga neurógena). En esta circunstancia sólo efectuaremos el tratamiento en los casos ya señalados. Cuando no evidenciamos causalidad, suele ser en la mujer donde con más frecuencia se presenta este tipo de bacteriuria. Diversos factores han sido investigados a la búsqueda de la etiología de este problema. El único evidente es la cortedad de la uretra femenina y su proximidad al introito vaginal y al ano, lo que facilita su colonización por microorganismos procedentes de la flora intestinal; el coito por el "masaje" a que se somete la uretra, estimula su paso a vejiga; sin

embargo, ambos condicionantes: cortedad uretral y actividad sexual, se dan en la mayoría de mujeres y sólo un porcentaje de ellas, 10% aproximadamente, sufren bacteriuria. Por ello deben existir otros hechos que expliquen la predisposición de ese grupo de mujeres. En ellas se ha observado colonización por enterobacterias del introito vaginal, con mayor frecuencia que en la población sana, probablemente por: cambios del pH del fluido vaginal, mayor adherencia bacteriana a las células vaginales y vesicales, (ya sea por pérdida de la capa de glucosamino-glucanos que protegen los receptores mucosos o de la proteína de Tamm-Horsfall), o disminución de anticuerpos locales. Ninguno de ellos es fácil de corregir y es inevitable, ante una bacteriuria recidivante, recurrir a antimicrobianos a largo plazo para controlar la sintomatología. Tras el tratamiento de choque de la bacteriuria, a dosis plena, durante 5-10 días, si hay fiebre optamos, cuando tiene relación con el coito, por dar el antimicrobiano antes o después de éste, junto al vaciado vesical por micción, ya que es es una medida tan eficaz como la administración continuada de aquél. Cuando no hay conexión con la actividad sexual, después del tratamiento inicial, pasamos a una sola administración a baja dosis, antes de acostarse (tratamiento supresivo). Este momento es elegido porque es durante la noche, cuando más tiempo permanece la vejiga sin vaciar. Para el tratamiento supresivo a largo plazo, o en relación con el coito, es importante utilizar antimicrobianos que no modifiquen la sensibilidad de la flora intestinal y vaginal (para evitar la aparición de resistencias), que alcancen altos niveles en orina y sean bien tolerados. El coste es otro aspecto no despreciable. Nitrofurantoína cumple perfectamente todos esos condicionantes, aunque no es bactericida; otros utilizables son cotrimoxazol, cefalexina, cefradina, cefadroxilo, ácido pipemídico y norfloxacina. El antimicrobiano elegido debe mantenerse mientras no haya bacteriuria. Si ésta reaparece se hace nuevo tratamiento pleno (diez días) y otra vez, supresión nocturna o con el coito. El tiempo mínimo de tratamiento será de 6-12 meses. Es necesario comprobar la eficacia del mismo, con urocultivos trimestrales o antes, si surgen síntomas. - Recaída por reinfección La reinfección (bacteria distinta a la del brote previo) suele, a diferencia de la recidiva, aparecer más tardíamente, tras meses de finalizado el tratamiento, aunque no siempre sucede así, ya que puede ocurrir, incluso, durante la administración del antimicrobiano o nada más cesar ésta; por ello, no es el tiempo de aparición, criterio válido, en su definición. Hay que efectuar un cultivo y, si se trata de la misma especie bacteriana, conocer el serotipo u otros marcadores. Cuando la reinfección es infrecuente (1-2 brotes/año), consideraremos cada uno de los episodios

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aisladamente, tratándolos como una infección sintomática sin más (dosis única o tres días de terapia). Si su frecuencia es de tres o más episodios/ año, y éstos son sintomáticos, los consideramos como recidivas o instauramos tras el tratamiento inicial, una de las dos modalidades terapeúticas (antimicrobiano con el coito, o dosis nocturna a largo plazo). En mujeres de edad media o avanzada con bacteriuria asintomática, en las que el riesgo de daño renal es mínimo, la abstención terapeútica es digna de considerarse. Con esta sistemática los resultados son adecuados pues conseguimos controlar entre 60-85% de pacientes con bacteriuria sintomática de repetición, no complicada. El resto se ven sometidos a ciclos, prácticamente toda su vida. Esto hace que se investiguen nuevas posibilidades, basadas en el bloqueo de receptores en el introito o bien la actuación directa sobre la propia bacteriuria. El más avanzado en la fase de investigación es el empleo de sustancias similares a los glucosaminoglicanos, como son la heparina intravesical y sus derivados (pentosanpolisulfato sódico) por vía oral pero, por el momento, los resultados no son definitivos. Frente a bacterias se preparan vacunas, ya sean con las más habituales de las infecciones urinarias, atenuadas, buscando la formación de anticuerpos que protegen al paciente o bien contra los elementos que caracterizan la virulencia microbiana: antígenos capsular o somáticos y fímbrias. Por último, también se intenta modular la respuesta inflamatoria parenquimatosa renal, a la llegada de bacterias, para prevenir así las lesiones que este contacto producen, aunque estamos en fase de investigación muy precoz. 10. BIBLIOGRAFIA - Ahren C, Jungersten L, Sandberg,T. Plasma nitrate as an index of nitric oxide formation in patients with acute infectious diseases. Scand Jinfect Dis 1999; 31: 405- 407. - Aldridge C, Jones PW, Gibson S, et al. Authomated microbiologic detection/identification system. J Clin Microbiol 1977; 6: 406-413. - Alexander MK, Khan MS, Dow CS. Rapid screening for bacteriuria using a particle-counter pulse-hihgt analyser, and computer. J Clin Pathol 1981; 34: 194-198. - Andre J, Arnaud B, Pilonchery G, Leriche A. Interest de la recherche des anticorps fixes sur les bacteries dans la localisation et la surveillance des infections urinaires chroniques. Ann Biol Clin 1980; 38: 111-114. - Bacheller CD, Bernstein JM. Urinary tract

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