Problemas Cinetica Enzimatica

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: PROBLEMAS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA Los alumnos deben repasar todos los conceptos de cinética enzimática, tanto de las clases teóricas como de los prácticos de enzimología 1, 2 e isoenzimas. Asimismo, deben practicar la resolución de problemas. Los que se incluyen en esta guía son algunos ejemplos resueltos que se discutirán en clase práctica, pero se sugiere la resolución de los otros problemas propuestos en la guía y la interpretación de los gráficos resultantes de los prácticos anteriores. Traer calculadora, papel milimetrado y otros elementos necesarios la resolución de problemas. Problema 1: 1- Un sustrato S se transforma por una enzima, y la velocidad de desaparición se mide cada 30 seg. durante 3 min. Se preparó en tubos de ensayo una serie de seis tubos con 1.5 µg de enzima (peso mol 30,000) añadiéndose un mismo volumen de disolución de sustrato a distintas concentraciones. Los resultados están resumidos en la tabla. ¿Cuáles son las velocidades iniciales para cada tubo con distinta concentración de sustrato? Tiempo (min) 0

0.5 1 1.5 2.0 2.5 3 Conc. Inicial (µmoles ml-1)

S 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.0

1

S 0.49 1.05 1.66 2.23 2.81 3.40 2.32

2

S 0.71 1.52 2.36 3.18 4.00 4.55

Sustrato transformado (µmol) 3 4 S S 1.10 1.36 2.24 2.74 3.48 12.66 38.50

5

S 1.45 3.00 200.00

Solución: Paso 1. Corregir cada lectura sustrayendo el cambio aparente en la disolución testigo (0S) en el tiempo correspondiente. 1

S 0.4 9 0.9 5 1.4 6 1.9 3 2.4 1 2.9

2

S 0.7 1 1.4 2 2.1 6 2.8 8

3

S 1.3 6 2.6 4

5

-

-

-

-

-

3.6 -

-

-

-

S

1.1 2.1 4 3.2 8

4

S

1.45 2.90

Paso 2. Representar µmoles de sustrato transformado para cada concentración frente al tiempo (Figura). Trazar la mejor recta para cada serie de puntos. 1

Sustrato transformado (µmol)

4 5

S

S 3

S

2

S

1

S

Tiempo (minutos) De esta figura determinar la velocidad de sustrato transformado por minuto para cada concentración de sustrato en el tramo lineal de cada curva. Estos valores serán las pendientes de las porciones lineales y serán también las velocidades iniciales. [1S] 2.32 2 [ S] 4.55 3 [ S] 12.66 [4S] 38.50 [5S] 200.00

x x x x x

10-3 M 10-3 M 10-3 M 10-3 M 10-3 M

1

V= 0.95 µmol min-1 2 V= 1.44 µmol min-1 3 V= 2.31 µmol min-1 4 V= 2.64 µmol min-1 5 V= 2.90 µmol min-1

Velocidad inicial (µmol min-1)

Estos valores se representan unos frente a otros

Conc. Sustrato (M x 103)

2

Problema 2: v0 = Vmáx [S] Km + [S] Utilizando la ecuación de Micaelis-Menten, calcular el cambio en la [S] necesaria para aumentar la velocidad de una reacción del 10 al 90 % de la velocidad máxima. SOLUCIÓN Poniendo v0 = 0,1 Vmáx Entonces

[S] = 0,1 Km + [S] [S] = (Km + [S]) . 0,1 [S] = 0,1 Km + 0,1 [S] [S] - 0,1 [S] = 0,1 Km 0,9 [S] = 0,1 Km 9 [S] = Km

Es decir, Poniendo entonces

[S] = Km / 9 v0 = 0,9 Vmax encontramos que [S] = 9 Km, [S]90% = 9 Km = 81 [S]10% Km/9

Es decir, se debe aumentar la [S] 81 veces.

Problema 3: Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reacción catalizada por una enzima hipotética son: [S] (moles/l) V (µmoles/min) 5x10-2 0.25 5x10-3 0.25 -4 5x10 0.25 5x10-5 0.20 -6 5x10 0.071 5x10-7 0.0096 a) ¿Cuál es la velocidad máxima para esta reacción? b) ¿Por qué la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M c) ¿Cuál es la concentración de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M? d) ¿Cuál es la Km de la enzima? e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6 3

y [S]=1x10-1 f) Calcular la concentración de producto formado en los cinco primeros minutos de reacción utilizando 10 ml de una disolución de sustrato 2x10-3 M. SOLUCIÓN a) Vmax = 0.25 µmol/min, ya que por encima de [S] de 5x10-4 no aumenta. b) Porque todos los enzimas está ocupados transformando un sustrato. c) Cero, todos los enzimas ocupados, a esa [S] se da la Vmax. d) Empleando la ecuación de Michaelis, utilizando la velocidad 0.20, 0.070 ó 0.0096 y sus correspondientes [S], como sabemos la Vmax, obtenemos una Km 0 1,25 x 10-5 moles/l. e) Sabiendo la Km y Vmax, aplicamos Michaelis utilizando esas [S], y obtenemos: V = 0,018 µmol/min y V = 0,25 µmol/min. f) A [2x10-3] la V = Vmax = 0,25 µmol/min. En 5 min 0,25 x 5 = 1,25 µmol. Tenemos 10 ml de sustrato, luego 1,25 µmol / 10-2 l = 1,25 x 102 µmol/l

Problema 4: Se estudió la actividad de la enzima ureasa, que cataliza la reacción: CO(NH2)2+H2O CO2+2NH2 en función de la concentración de urea, con los resultados siguientes: Concentración de urea (mmoles dm-3) 30 -1 -1 V inicial (mmoles urea consumidos min mg enzima ) 3,37

60 5,53

100 7,42

150 8,94

250 10,70

400 12,04

¿Cuáles son los valores de Km y Vmáx para esta reacción? SOLUCIÓN Los datos se ordenan en la forma adecuada para una gráfica lineal (por ejemplo, 1/V inicial frente a 1/[S], aunque existen otras formas de linealizar que no son motivo de nuestro estudio). La gráfica de la doble inversa se indica en la Figura. De la gráfica se puede calcular que Km es 105 mmoles dm-3 y la Vmáx es 15,2 mmoles urea consumidos mg-1 min-1. Observar la distribución de los puntos y tener presente cuando se eligen los valores adecuados para la concentración de sustrato al planificar un experimento.

-1

1/Vinicial (mg min mmoles )

0.30

0.24

0.18

0.12

0.06

0.00 0.00

0.01

0.02 3

0.03

0.04

-1

1/[urea] (dm mmoles )

Ejemplo resuelto de acuerdo con el método de doble inversa o de Lineweaver-Burk.

Problema 5: 4

Se investigó el efecto de un inhibidor I sobre la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente sobre un solo sustrato, obteniéndose los siguientes resultados Concentración de sustrato (mmol L -1)

Concentración del inhibidor (mmol L -1) 0 0.5 1.0 Velocidad de reacción ν0 (µmol L -1 min-1)

0.05 0.10 0.20 0.40 0.50

0.33 0.50 0.67 0.80 0.83

0.20 0.33 0.50 0.67 0.71

0.14 0.25 0.40 0.57 0.63

A) ¿De que manera actúa el inhibidor? B) Obténgase los valores para Vmáx, y Km. SOLUCIÓN A) La manera más sencilla de deducir cómo actúa un inhibidor es graficar 1/ν0 en función de 1/[S]0 para cada concentración del inhibidor. 8

1

1/ν 0 (µ mol L -1 min-1 )

7 6

0.5

5

[I ] 0 (mmol L-1) [I ] 0,5 (mmol L-1)

4

1/Vmáx

3

[I ] 1,0 (mmol L-1)

0

2 1 0 -15

-10

-1/Km

-5

0

5

10

15

20

25

-1 -1

1/[S] 0 [(mmol L ) ]

Gráfica de Lineweaver-Burk del efecto de un inhibidor A partir de la gráfica se puede observar que la pendiente de las curvas se modifica con los cambios en la concentración del inhibidor pero no la intersección en el eje 1/ν0 (1/Vmax). Por ello los datos anteriores indican que el inhibidor I está actuando como un inhibidor competitivo. B) De la intersección en el eje 1/ν0 se puede estimar Vmax= 1(µmol L -1 min-1) y de la intersección con el eje 1/[S]0 los valores de Km=0,1 (mmol L -1) sin ihnhibidor, Km=0,2(mmol L -1) con 0.5(mmol L -1) de inhibidor y Km=0,3 (mmol L -1) con 1(mmol L-1) 5

Problema 6:

A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar de que manera está actuando el inhibidor. Determinar la Km y la velocidad máxima. [S] mM µg producto/h µg producto/h (sin inhibidor) (6 mM inhibidor) 2 139 88 3 179 121 4 213 149 10 313 257 15 370 313 SOLUCIÓN Se calculan los inversos de [S] y de v, producto sin inhibidor y producto con inhibidor y se representa. Sin inhibidor: Vmax = 0,5x103 µg/h y Km = 5 mM. Con inhibidor: Vmax es la misma y Km=9 mM. PROBLEMAS PARA RESOLVER Problema 7: Calcular qué velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 y la concentración de sustrato es a) 10 Km b) Km/3. Sol.: a) 91 %; b) 25% Problema 8: Una enzima cuya Km es 2,4 · 10 -4 M se ensaya con una concentración de sustrato de 2·10 -7 M. Si la velocidad media para esta reacción con una concentración de sustrato de 5·10 -2 M fue 0.128 mmoles/min, calcular la velocidad inicial en el caso anterior. Sol.: 0.107 µmol/min Problema 9: Se detectó actividad de una determinada enzima en extractos de hígado y cerebro. Para dilucidar si la actividad detectada era atribuible a la misma enzima presente en ambos órganos, o a especies distintas de la enzima propias de cada órgano, se llevaron a cabo estudios cinéticos con distintos sustratos. Uno de los sustratos, ensayado siempre bajo idénticas condiciones en 1 ml de volumen total incluyendo 0,1 ml de extractos de cada órgano, resultó ser transformado a las siguientes velocidades iniciales: Concentración de sustrato Velocidad (µmoles/min) (µmoles/ml) Hígado Cerebro 1 0,14 0,085 2 0,23 0,14 5 0,39 0,23 10 0,50 0,30 Den las características de la enzima que puedan ser determinadas a partir de estos datos, y muéstrese cuáles de ellas son de interés en relación con la cuestión de la identidad de las dos enzimas. Sol.: los valores de Km son los mismos Problema 10: La fructosa difosfatasa (que cataliza la hidrólisis de la fructosa difosfato a fructosa-6-fosfato y fosfato) es inhibida por AMP. Los siguientes datos se obtuvieron a partir de un estudio de la enzima del hígado de rata: FDP (µmoles ml-1) 4 6 10 20 40

6

AMP (µmoles ml-1)

Velocidad inicial (µmoles ml-1 min-1)

0 0,059 0,076 0,101 0,125 0,150 8 0,034 0,043 0,056 0,071 0,083 Comentar estos resultados en relación a las constantes cinéticas en cada caso. Sol.: Km 8 µmoles ml-1; Vmáx sin inhibidor 0.185 µmoles ml-1 min-1; Vmáx con inhibidor 0.102 µmoles ml-1 min-1

0,010 0,008

Km (M)

Problema 11: Una determinada enzima cataliza la reacción A ↔ B. Se ha observado previamente que la Vmáx de esta reacción no varía dentro de un rango de pH entre 5 y 9: Vmáx= 100 µmoles/min/µg de enzima. Por otra parte, la Km varía según se muestra en esta figura: El ensayo fue realizado en presencia de 0,01 M sustrato, y 1 µg de enzima, en cada uno de los bufferes. ¿Qué velocidad inicial se esperaría para pH 5.5 y 8? Explique. Sol.: Para pH 5.5: 50 µmoles/min/µg de enzima Para pH 8: 100 µmoles/min/µg de enzima

0,006 0,004 0,002 0,000 5

6

7

8

9

pH

Problema 12:

Habiéndose conseguido aislar de Salmonella typhimurium una enzima (E) que cataliza la reacción A→P, se decidió hacer un estudio estructural y cinético de dicha enzima: [A] mM 1,00 0,55 0,25 0,20 V(mmol P/ min) 1,00 0,71 0,50 0,41 V (nmol P/min) con J 0,66 0,41 0,25 0,20 donde J es un inhibidor de E cuya influencia como tal se quiere estudiar. [J] = 0,25mM. a) Calcular la Km de la enzima estudiada para A, y Vmax para la transformación A--P en presencia de E. b) Que tipo de inhibidor es J? c) Cuál sería el efecto sobre la Vmax de la enzima, un aumento de la concentración de J? Solución: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = Vmax’ = 1.66 mmol P/min b) KM = 0.5 mM c) KM’ = 1.25 mM (con inhibidor) (Inhibición Competitiva) Problema 13

La cinética de una enzima viene determinada como función de la concentración de sustrato en presencia y ausencia del inhibidor I. [S], Mx10-5 0.3 0.5 1.0 V(µmol/min) sin inhibidor 10.4 14.5 22.5 V(µmol/min) con inhibidor 10-4 M 2.1 2.9 4.5 a) Calcular la Km y la Vmax en presencia y ausencia de inhibidor b) Que tipo de inhibidor es?

3.0 33.8 6.8

9.0 40.5 8.1

Solución: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4 a) Vmax = 50 µmol/min b) Vmax’ = 9.5 µmol/min c) KM = 1.1x10-5 M 7

d) Inh. No Competitiva Problema 14

¿Qué relación numérica existe entre Km y [S] cuando una reacción enzimática alcanza el 87 % de la Vmax? Problema 15

100 ug de una enzima a 25 °C descomponen en 10 min el 1% de un sustrato 0,1 M. La misma cantidad de enzima descompone en 1 min el 10% de un sustrato 10 -3 M. Calular Vmax y ctividad específica de la enzima. Problema 16

Una enzima se ensayo con una [S] inicial de 2.10 -5 M. en 6 min la mitad del sustrato había reaccionado. Si la Km para el sustrato es 5x10 -3 M, calcular la Vmax y la cantidad de producto formado en 10 min de reacción. Problema 17

Una enzima cataliza una reacción con una velocidad máxima de 5 µmoles por minuto, siendo su Km para el sustrato de 0.5 mM. Si la ponemos en presencia de una concentración 500 mM de sustrato. ¿Qué cantidad de sustrato se logrará transformar en 10 min? Problema 18

La KM para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10 -2 M. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59.8 µg/ml, ¿Qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol). Problema 19

Calcular que velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 y la concentración de sustrato es igual a) 10 Km y b) Km/3. Problema 20

Una enzima cataliza una reacción a una velocidad de 35µmoles/min cuando la concentración de sustrato es 0.01M. La KM para el sustrato es 2x10 -5 M. ¿Cuál será la velocidad inicial a las concentraciones de sustrato: a) 3.5x10-3 M, b)4x10-4 M, c) 2x10-4 M, d) 2x10-6 M y e) 1.2x10-6 M? Problema 21

Calcular Km y Vmax de una enzima sabiendo que la recta obtenida en una representación de Lineaweaver y Burk corta el eje de ordenadas en 5x103 (moles/min)-1, y que la pendiente de dicha recta es 120 min/L. Problema 22

Una reacción enzimática se lleva a cabo a diferentes concentraciones de sustrato en ausencia y presencia de dos inhibidores diferentes: [Ia] = [Ib] = 1.5 mM. La siguiente tabla muestra los datos obtenidos: [S] (mM) v (µmol/min) v (Ia) (µmol/min) v(Ib) (µmol/min) 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2

1.67 2.86 4.44 6.15 7.62

0.63 1.18 2.1 3.48 5.16

0.83 1.43 2.22 3.08 3.81 8

a) determinar todos los parámetros cinéticos de la enzima. b) ¿Qué tipo de inhibidor es Ia e Ib? Problema 23

25 µL de una preparación de Ribonucleasa A se lleva a ensayo a un volumen de reacción estándar de 1 mL y a temperatura y pH óptimos, pero con distintas concentraciones iniciales de sustrato obteniéndose las velocidades iniciales que se indican [S] x10-3 (mM) v (nmol/min)

303 120

149 98

128 92.6

100 83.3

80 74.6

Determine la Km y Vmax y exprese también la cantidad de enzima en UI/mL. Problema 24

La descarboxilación enzimática de β-cetoácido procede con las velocidades iniciales para las concentraciones que se citan: [cetoácido] (mM) 2.500 v (µmol CO2/2 min) 0.588 Determine la Km y Vmax.

1.000 0.500

0.714 0.417

0.526 0.370

0.250 0.252

Problema 25

¿Qué información puede obtenerse a partir de una representación gráfica del método de Lineaweaver & Burk cuando la recta obtenida, convenientemente extrapolada, corta el eje de las abscisas en -40 Litros/mol? Problema 26

La Km para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10 -2 M. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59.8 µg/ml, ¿Qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol)

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