Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein

Prinsip dan Teknik Isolasi dan Purifikasi Protein

Teknik isolasi dan purifikasi

• Merupakan proses hilir dalam bioteknologi Tidak kurang penting dibanding proses hulu – rekayasa genetik, teknik fermentasi

• Yang diolah – produk dari proses terdahulu

• Protein – produk dari rekayasa genetika Yang paling banyak – isolasi / purifikasi protein dari tumbuhan, hewan, mikroorganisme

Teknik isolasi / purifikasi – dapat dalam • skala laboratorium • skala industri

Sebelum melakukan isolasi – penting diperhatikan sumber produk yang akan

diisolasi • Hewan • Tumbuhan • Mikroorganisme

< tahun 1970 an – digunakan sumber dari hewan - tripsin, lipase, rennin - mahal, sumber terbatas • tumbuhan - papain, bromelain, amilase, lipoksigenase - dipengaruhi cuaca, politik Sumber dari mikroorganisme banyak digunakan setelah perkembangan teknologi fermentasi - relatif lebih murah

ISOLASI Metode isolasi tergantung • Sumber produk • Skala produksi (lab / industri) • Stabilitas produk • Bentuk murni / tidak murni

oses isolasi dimulai dengan mengetahui letak / loka roduk yang akan disolasi • Intrasel • Ekstrasel • Terikat membran

Protein larut intrasel dari tumbuhan – teknik isolasi tidak rumit – karena jaringa lunak, mudah dihancurkan dengan tissu homogenizer

• Protein intrasel dari mikroorganisme – lebih liat – perlu metode lebih kuat

• Protein terikat membran – masalah tersendiri – tidak tergantung sumber

Metode penghancuran (lisis) sel

1. Abrasif - dengan blender laboratorium dengan butiran gela (glass beads)

2. Liquid shear - suspensi sel dilewatkan dengan tekanan tinggi me lubang kecil ke dalam ruang dengan tekanan atmo - karena perbedaan tekanan mendadak – sel pecah - untuk dinding sel bakteri yang tidak terlalu keras – misal bakteri Gram negatif

3. Osmotic shock - sel disuspensikan di dalam akuades / larutan hipot sehingga sel lisis - protein dilepaskan dari sel yang lisis - tidak efektif untuk sel bakteri dan tumbuhan

4. Penambahan alkali - metode paling sederhana untuk melisis sel - sebagian besar sel pecah pada pH 11,5 – 12,5 - protein yang diisolasi harus stabil selama 20 – 30 m pada pH tinggi tsb

5. Penambahan deterjen. - selain lisis sel, sebagian besar protein sel mengala denaturasi - untuk isolasi protein terikat membran

6. Solid shear - dengan membekukan sel - 20oC, dipaksa melalui lubang kecil pada tekanan tinggi 7. Penambahan lisozim dan EDTA - cocok untuk skala kecil karena mahal - efektif untuk sel bakteri 8. Pelarut organik - toluen dan aseton – untuk melisis berbagai sel - tidak untuk skala besar – toksik, mahal, mudah terbakar 9. Sonikasi - lisis sel dengan getaran ultrasonik - untuk skala kecil

PURIFIKASI (PROTEIN)

ada waktu lisis sel – seluruh isi sel keluar – banyak kontaminan oleh karena itu harus

disingkirkan, antara lain asam nukleat sam nukleat – meyebabkan viskositas nggi – pada tahap awal harus disingkirkan Presipitasi – penambahan polikation BM  (protamin, streptomisin, polietileneimin) – ma Digesti – dengan nuklease – mudah, murah

etelah asam nukleat disingkirkan – sisa s yang tidak larut (dinding sel, protein membran, bagian sel yang hancur) harus

isingkirkan dengan Sentrifugasi – sangat baik untuk solid yang bersifat licin (slimmy or gelatinous solids) • Filtrasi

Sentrifugasi Kecepatan mulai 100 x g sampai 600.00 xg • Dapat memisahkan organel sel berdasarkan massa dan densitasnya - 3000 g = sel dan nukleus - 12.000 g = mitokondria / kloroplas - 100.000 g = mikrosom, ribosom

enyingkiran asam nukleat + debris sel (=

resipitat, pelet) - menghasilkan supernat

ang mengandung - protein yang diinginkan kontaminan (protein yang tidak diingink molekul organik dan inorganik)

Penyingkiran kontaminan – presipitasi dengan

Amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi - protein yang tidak diinginkan diendapkan terlebih dahulu, baru protein yang diinginkan diendapkan dengan konsentrasi yang lebih tinggi - paling banyak digunakan - pada skala besar – masalah penanganan dan pembuangan – korosif

• Natrium sulfat - tidak bersifat korosif - kelarutan rendah, perlu suhu > 35 oC untuk fraksin

• Pelarut organik - skala lab, jarang skala industri karena muda terbakar

• Polimer - polietilen glikol (PEG) - tidak toksik - tidak mudah terbakar - penggunaan terbatas karena meningkatka viskositas larutan - polyacrylic acid - non toksik

• Presipitasi pada titik isoelektrik (pI)

Lisis sel

sentrifugasi supernatan

presipitat

kontaminan supernatan

Am. sulfat presipitat

Am. sulfat supernatan

presipitat

Fraksinasi

emisahan selanjutnya (fraksinasi) – melibatka komponen 1.

Fasa solid / stasioner - berupa film, kolom, gel atau membran 2. Pelarut - fasa mobil pada kromatografi 3. Solut - molekul yang harus dipisahkan

Teknik

Dasar pemisahan

Fasa solid

Dialisis

Uk / btk molekul

Mbr semipermabel Air

Filtrasi gel

Uk / btk molekul

Gel

Bufer

Krom. Adsorpsi

Adsorpsi

Adsorben

Nonpolar

Krom. Partisi

Solubilitas

Innert support

Ionisasi listrik Muatan

Innert support Mtrks + ggs terionisasi Matriks + ligan berpori Innert support

Pelarut

Polar – nonpolar

Krom. Afinitas Elektr Aset Krom. sel. Pertkr ion

PAGE

Interaksilistr ligan Muatan + uk mol

Bufer Bufer

Bufer Bufer

ada dasarnya pemisahan molekul protein dapat berdasarkan Sifat Muatan

Polaritas

Ukuran molekul

Prosedur - kromatografi pertukaran ion - elektroforesis - kromatografi adsorpsi - kromatografi kertas - dialisis dan ultrafiltrasi - gel elektroforesis - kromatografi gel filtrasi - ultrasentrifugasi - kromatografi afinitas

Dialisis

Untuk memisahkan protein (molekul besar) dari garam (molekul kecil) dan kontaminan berukuran kecil

Protein dimasukkan ke dalam kantong selofan yang berpor kecil

Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang mengandung akuades / bufer, sambil di putar dengan pemutar magnetik semalaman dengan penggantian akuades / bufer beberapa kali dalam wadah Pori memungkinkan molekul kecil berdifusi keluar, molekul besar tertahan di dalam kantong

Dapat untuk memekatkan larutan – dengan meletakkan kantong dialisis dalam polimer desikan , misal polietilen glik

Dialisisis

Kantong selofan berisi larutan yang akan dimurnikan

Magnetic stirrer

Kromatografi

emisahan molekul berdasarkan perbedaan

ruktur dan atau sifat fisik pada saat berintera • fasa mobil engan • fasa stasioner (matriks) - kertas saring ( krom. kertas) - lapis tipis selulosa / silika / alumina – kromatografi lapis tipis

Kromatografi Kertas

Beberapa tetes larutan yang mengandung kompon yang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong ker dibiarkan kering

Ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut yang ter dari campuran pelarut polar dan nonpolar

Komponen polar akan terikat pada kertas memben fasa stasioner, sedangkan komponen nonpolar berg membentuk fasa mobil

Berbagai komponen dalam larutan akan terpisahka berdasarkan perbedaan kelarutan dalam fasa stasio atau fasa mobil – koefisien partisi

Setelah bergerak dalam jarak tertentu – kromatogram diangkat dan dikeringkan • Dideteksi dengan - radioaktif sinar UV - pewarnaan dengan zat warna

Kecepatan migrasi – Rf (rate of fractionatio – perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh solven

Kromatografi kertas - dua dimensi

Kromatografi kolom

Fasa stasioner – kolom butiran kecil selulosa / akrila / silika

Fasa stasioner berinteraksi dengan protein berdasa - muatan - interaksi hidrofobik - interaksi ligan Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom, kemudian di luruhkan dengan fasa mobil (eluen)

Fasa mobil yang keluar (eluat) ditampung dalam fra fraksi dengan volume tertentu

Matriks yang digunakan • Cross-linked dextran (Sephadex) • Agarosa (Sepharose, Biogel)

• Cross-linked agarosa (Sepharose CL) • Poliakrilamid (Biogel P) • Porous glass (Bio-glass)

Kromatografi kolom

Kromatografi kolom

Kromatografi Partisi Pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkan afinitas relatif berbagai protein terhadap fasa mobil dan fasa stasioner Protein yang lebih kuat berinteraksi dengan matriks akan tertahan Lamanya waktu protein berinteraksi dengan matriks tergantung dari komposisi fasa stasioner dan fasa mobil

• Pemisahan protein optimal – diperoleh dengan manipulasi komposisi fasa stasioner dan mobil

omatografi Berdasarkan Ukuran Molekul trasi Gel, Size Exclusion Chromatography)

Pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuran molekul dan melewatkannya melalui kolom gel yan telah mengembang

Yang paling banyak dipakai – Sephadex – partikel k hidrofilik, tidak larut karena cross-linking dekstran membentuk jaringan 3 dimensi

Molekul >> keluar lebih dahulu, molekul > digunakan untuk purifikasi protein, molekul kec

Matriks – bahan inert dengan gugus terionisasi – D selulosa, CM selulosa

Atom N dari DEAE pada pH < 9 – mengikat moleku bermuatan negatif – disebut penukar anion (anion exchanger) CM selulosa – penukar kation (cathion exchanger) Peluruhan protein – berdasarkan muatan atau konsentrasi garam dalam bufer

Penting diperhatikan – resin yang dipakai, pH, ioni strength larutan bufer

Kromatografi afinitas

Ligan – terikat secara kovalen pada matriks porous inert • Ligan - spesifik – substrat, analog, inhibitor - umum – AMP, hidrokarbon, zat warna Dalam skala besar jarang digunakan – mahal, keterbatasan kapasitas, tidak stabil

Resolusi tinggi, proses purifikasi berlangsung cepa

Kromatografi afinitas

Kromatografi afinitas

Kromatografi lapis tipis

• Pemisahan senyawa pada lempeng tipis Dasar – adsorpsi, pertukaran ion, partisi, filtrasi gel • Berlangsung cepat Dapat memisahkan beberapa pemisahan sekaligus Bercak yang timbul diwarnai dengan pewarnaan tertentu – diukur kadarnya secara spektrofotometri

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis

PLC (High Performance Liquid Chromatography)

Separasi berdasarkan – adsorpsi, pertukaran ion at filtrasi

Sampel diuapkan dan dimasukkan ke dalam kolom dengan tekanan tinggi (sp 5000 psi) Eluat dideteksi dengan mengukur serapan pada gelombang UV

Resolusi tinggi, cepat, sensitivitas >> - dapat meng sampai ng

• Sering digunakan untuk steroid, vitamin

Prinsip HPLC

Elektroforesis Merupakan teknik pemisahan protein yang paling sering digunakan di lab Berdasarkan pergerakan molekul bermuatan dalam medan listrik Pada pH > pI, protein bermuatan negatif – bergerak ke anoda; pada pH < pI, protein bermuatan positif – bergerak ke katoda; pada pH = pI, protein tidak bergerak Matriks yang digunakan – membran selulosa asetat, starch gel, akrilamid, agarosa

Elektroforesis

SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

• SDS = Sodium dodecyl sulphate Akrilamid berpolimerisasi dan cross-linked – membentuk matriks yang porous SDS – membuat protein bermuatan negatif, sehingga pemisahan terjadi berdasarkan kecepatan bergerak dalam medan listrik yang dipengaruhi oleh besar molekul Molekul besar lebih tertahan pergerakannya dibanding molekul kecil Protein yang terpisah divisualisasi dengan zat warna – Coomassie blue

Pada tiap tahap purifikasi harus dilakukan • Pengukuran volume sampel • Penetapan kadar protein  Mulai dari tahap awal sampai tahap akhir penetapan – untuk mengetahui seberapa jauh terjadi pemurnian produk

Bila pada elektroforesis diperoleh 1 puncak setelah melalui berbagai tahap purifikasi – presipitasi, krom pertukaran ion, filtrasi gel, krom afinitas – dapat dikatakan protein telah murni

Bila mungkin – protein murni disimpan dalam bentuk kristal

ENTIFIKASI & PENGHITUNGAN KADAR PROTEIN

LAM BAHAN UJI PADA TAHAP PURIFIKASI - serapan pada  280 nm (sinar UV) ecara spektrofotometri - serapan protein setelah diwarnai dengan pewarna bereaksi dengan asam amino / protein - ninhidrin ( biru )  kromatografi lapis tipis - biuret (lembayung) - Bradford (biru)

ibandingkan terhadap serapan larutan standar yang - fluoresamin diketahui kadarnya

ntuk enzim – dihitung aktivitas dan aktivitas spesifik pada setiap tahap purifikasi

Aktivitas (Unit) enzim = jumlah protein yang dapat mengubah 1 mol substrat menjadi produk per menit pada suhu 25 C pada pH optimum

Aktivitas Spesifik = Unit per mg protein

Homogenat

Vol, kdr protein, Akt, AS

Am. sulfat

presipitat

Fraksinasi Krom. Pert. Ion

Gel filtrasi

Elektroforesis Krom. Afinitas

1 pita

Volume, kadar protein, Akt, AS

supernatan

Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling 

Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling 

Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling 

Enzim murni

Contoh purifikasi enzim X

Contoh Tabel Purifikasi Enzim X Tahap

Vol fraksi (mL)

Prot total (mg)

Aktivitas (U)

Akt Spesifik (U/mg prot)

1.400

10.000

100.000

10

Presipitat

280

3.000

96.000

32

Krom Pert Ion

90

400

80.000

200

Filtrasi gel

80

100

60.000

600

6

3

45.000

15.000

Homogenat

Krom Afinitas