Principales Métodos de Extracción de Proteínas PDF

 

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA ING.EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS  UNIVERSIDAD NACIO DOCENTE

: Ing. Minchan Quispe William

CURSO

: Extracción de biomoleculas

INTEGRANTES:  Pinedo Pinedo

CICLO 

Huaman Reina

: IX

Cajamarca, septiembre del 2020

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD  NACIONAL DE CAJAMARCA ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

PRINCIPALES MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS I. 

 

INTRODUCCION La extracción extracción de proteínas es el primer paso en un estudio de proteómica y a su vez el más importante, puesto que los análisis de geles en dos dimensiones requiere de proteínas bien resueltas y reproducibles gel a gel. En el caso de tejidos vegetales, este proceso se dificulta aún más debido a su

bajo

contenido proteico en comparación con con otros sistemas, la presencia de  proteasas y enzimas que catalizan procesos oxidativos, y la acumulación de elevadas cantidades de polisacáridos, lípidos, compuestos fenólicos, y otros metabolitos secundarios que pueden interferir en el anál análisis isis de las proteínas en la electroforesis . Los protocolos más utilizados comprenden la extracción con tampones acuosos y el uso de solventes orgánicos (TCA-acetona, fenol, entre otros), otros ), aunqu aunquee ambos protocolos se pueden p ueden combinar como en Wei et al. 2009. El método ideal debe ser muy reproducible reprodu cible y debe proporcionar el mayor número de proteínas en una concentración detectable, y al mismo tiempo, reducir el nivel de contaminantes y reducir al mínimo la degradación de las proteínas y la formación de artefactos producidos por proteólisis. Por lo tanto, no hay una metodología global para la extracción, depende de muchos

factores. Una

metodología que sirve para una planta no tiene por qué ser igualmente útil para otra. Es imperativo entonces obtener el método particular para el caso particular.

II. 

OBJETIVO  

Conocer los principales métodos de extracción de las proteínas.

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD  NACIONAL DE CAJAMARCA ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

III. 

MARCO TEÓRICO 3.1.Extracción de proteínas Es un proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de la proteína o péptidos de interés. Los factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento son solubilidad, pH, grado de oxidación, presencia de metales pesados, polaridad y fuerza iónica de la solución,  presencia de proteasas, temperatura y actividad de la molécula. (Paxton 1991)

3.2.Purificación de las proteínas La metodología empleada en la extracción de proteínas determina su naturaleza y estabilidad, permitiendo validar los resultados obtenidos en procedimientos  posteriores. En particular, la extracción de proteínas vegetales presenta problemas inherentes a la estructura de la célula vegetal, pues comparada con los tejidos animales y las células bacterianas, tiene menor contenido de proteínas y contienen en sus vacuolas peptidasas, alcaloides y compuestos polienólicos (flavonoides, taninos) que pueden interferir en la actividad proteica. En consecuencia, la estrategia de extracción depende de las características específicas de la proteína en estudio y de su localización (Michaud & Asselin, 1995). La primera etapa en el aislamiento de una proteína es su liberación de las células que la contienen. El método elegido depende de las características mecánicas del tejido de procedencia, así como de la localización celular de la proteína de interés. Como métodos de ruptura mecánica de las células vegetales para liberar sus  proteínas se pueden mencionar:  

trituración con arena o alúmina

 

trituración en mezclador de alta velocidad

 

homogeneizador a pistón

   prensa

francesa

 

sonicación

 

congelación con nitrógeno líquido y macerado (Voet, 1992)

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD  NACIONAL DE CAJAMARCA ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

La diversidad de proteínas involucradas en procesos de crecimiento, desarrollo y defensa impide la formulación de un procedimiento de extracción universal que  permita recuperar todas las proteínas de un tejido vegetal. Sin embargo, la solubilidad de las proteínas de plantas, que está relacionada con la localización intracelular, permite formular diferentes métodos de extracción.

3.3.Métodos de extracción. Extracción con buffer acuoso Extracción con detergentes Precipitación directa con TCA Precipitación con acetona Precipitación con TCA-acetona

3.3.1.  Sulfato de amonio:  Se tomaron las hojas y las semillas de Pentacalia nítida y se maceraron en nitrógeno liquido hasta obtener un polvo fino (24), a este se s e le hicieron 3 lavados con acetona, para 0,1 g de material vegetal se agrega 1 ml de acetona por cada lavado, se homogenizó y se centrifugó a 10.000 gravedades por 3 minutos, este pre tratamiento permitió extraer del material vegetal clorofilas y carotenoides y otros compuestos, a continuación se dejó secar el material vegetal toda la noche para que se evapore la acetona en su totalidad.De este material vegetal se tomó 1 g para realizar la extracción con buffer fosfato 0,1 M con KCl 1 mM, EDTA 2 mM y Polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1,5% y a un pH 7.5 (27), se dejó en extracción a 4 °C por 4 horas, después se centrifugó a 10.000 gravedades por 5 min a 4 °C, el extracto acuoso obtenido se precipitó toda la noche a 4°C con sulfato de amonio al 70% agregándolo en polvo y disolviéndolo.

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD  NACIONAL DE CAJAMARCA ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

Pasado este tiempo se centrifugó a 10.000 gravedades por 10 minutos a 4°C y el pellet se resuspendió en buffer fosfato, posteriormente se dializó en una membrana de diálisis (Spectra/Por® 6 MWCO 1KDa) con buffer fosfato a 4°C por 4 horas, finalmente el extracto dializado se pasa por un filtro de 0,22 µm. Este procedimiento de precipitación de la proteína con sulfato de amonio se utiliza para realizar los ensayos de actividad antimicrobiana y para la cromatografía.  

3.3.2. TCA-Acetona:  Las semillas y hojas de Pentacalia nítida se maceraron en nitrógeno líquido, luego se les agregó 0,0025g de  polivinilpolipirrolidona (PVPP) por cada 1 g de material vegetal,  posteriormente a este material vegetal se le realizaron 3 lavados con acetona fría, centrifugando a 10.000 gravedades por 3 min a 4°C entre cada lavado. Por cada 0,1 g de material vegetal se adicionó 1 ml de buffer fosfato con 1,5% PVPP, 10mM KCl y 2 mM EDTA, pH 7.5, se dejó en extracción por 2 horas a 4°C, después se centrifugó a 12.000 gravedades por 20 minutos a 4°C al sobrenadante se adicionó la solución de precipitación que contiene 10% de ácido tricloroacetico (TCA) y 0,07% de  betamercaptoetanol en 2 ml de acetona fría, luego se sonicó la muestra por 30 min y se dejó precipitar toda la noche a -20°C. Después se centrifugó a 12.000 gravedades por 20 minutos a 4 °C, se descartó el sobrenadante y al pellet se le realizó tres lavados con 400 µL de acetona fría centrifugando a 10.000 gravedades por 5 minutos a 4°C entre cada lavado, finalmente el remanente de

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD  NACIONAL DE CAJAMARCA ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

acetona presente en el pellet se dejó secar y este se resuspendió en  buffer fosfato.

3.3.3.  Fenol-Tris:  A partir de 0,1 g de material vegetal macerado en nitrógeno líquido y con 2,5% de Polivinilpolipirrolidona (PVPP), se le agregó 0,2 ml de buffer que contiene: Tris-HCl 500 mM, EDTA 50 mM, Sucrosa 700 mM, KCl 100 mM, 2% de  betamercaptoetanol y Pefabloc 4 mM a un pH 88,, se agitó en hielo  por 5 min y se aagregó gregó 0,2 0, 2 ml de buffer Tris saturado satu rado con fenol y se dejó 10 min a temperatura ambiente, posteriormente se centrifugó a 10.000 gravedades por 10 minutos. Se recuperó r ecuperó la fase superior (fenólica) y se adicionó 0,2 ml de buffer de extracción, se agitó y se centrifugó 10.000 gravedades por 10 min después se recuperó la fase fenólica; a esta fase se le adicionaron 4 volúmenes de solución de precipitación (Acetato de amonio 0,1 M en metanol) y se 11 dejó toda la noche a -20°C, después se centrifugó centrifu gó a 10.000 gravedades por 10 min, se realizaron 3 lavados con solución de precipitación fría y un lavado con acetona fría, se deja secar el pellet y resuspendió (30). Para prevenir la proteólisis durante la extracción se debe utilizar alguno/s de los  procedimientos siguientes: extraer con buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato), extraer con TCA frío al 10 % (p/v), adicionar un cóctel de inhibidores de peptidasas al buffer de extracción,

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD  NACIONAL DE CAJAMARCA ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

trabajar a baja temperatura durante períodos cortos de tiempo, usar buffers de pH por encima o por debajo del óptimo, adicionar agentes protectores como dimetil sulfóxido (10 %, v/v) o glicerol (25 % v/v) o agentes reductores

3.4.Métodos de coagulación de la proteína por el calor   Método A  En un reactor se mezcla la materia prima con agua, proporción en peso 1 : 1, se agita a la vez que se calienta calien ta hasta 97℃ , manteniéndose esta temperatura durante 5 minutos. Se centrifuga durante 30 minutos a 3500 r.p.m. y se separa el líquido sobrenadante de la fase sólida, formada a su vez por dos estratos: pulpa y caparazón triturado del crustáceo. Posteriormente el estrato formado por el caparazón triturado es sometido a sucesivos lavados con agua a través de un tamiz metálico de 0,8 mm al objeto de recuperar los restos de pulpa adheridos. Método A, Este método modifica el anterior en el sentido de tratar el liquido sobrenadante sobr enadante  procedente de la centrifugación con CIH 1 N hasta pH = 4,5 buscando la  precipitación de la fracción de proteína contenida en dicha fase Iíquida (LÓPEZBENITO y GIL, 1974).

3.5.Métodos de precipitación ácida Métodos B y C  Se utilizaron dos tipos de ensayos, uno empleando ácido clorhídrico 1 N y el otro con ácido fosfórico 1 N. En ambos casos se trató la materia prima con agua en  proporción 1 : 1 en peso, se agitó manteniendo, dur durante ante dos horas por adición adic ión de ácido, el pH de toda la masa a 4,5 y se centrifugó para separar la fase líquida de la pulpa y fracción de caparazón triturado.

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD  NACIONAL DE CAJAMARCA ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

Métodos B, y C  Son métodos modificados de los anteriores en los que el Iíquido procedente de la centrifugación es sometido a un tratamiento por el calor (97°C) durante 5 minutos, al objeto de proceder a la separación por coagulación de la proteína residual contenida en dicha fase Iíquida.

3.6.Métodos de hidrólisis enzimática Se ensayaron tres enzimas para alcanzar la solubilización de la proteína del patexo: pronasa, papaína y pancreatina (LOPEZ, 1997). La proporción de materia prima/agua en peso era siempre de 1 : 1, y las condiciones de trabajo las siguientes: Pronasa: pH = 7,O; temperatura de hidrólisis: 50°C; tiempo: 4 1/2 horas;  proporción de enzima con respecto al peso de patexo triturado (materia  prima): 0,05 %. Papaína: pH = 6,5; temperatura de hidrólisis: 65°C; tiempo: 3 horas;  proporción de enzima con respecto al peso de patexo triturado (materia  prima): 1 %. Pancreatina: pH = 8,5; temperatura de hidrólisis: 45°C; tiempo: 3 horas;  proporción de enzima con respecto al peso de patexo triturado (materia  prima): 1 %. En los tres procedimientos, una vez finalizado el tiempo de hidrólisis y al objeto de inactivar el enzima, se procede a elevar la temperatura de la masa hasta 85"C, permaneciendo en estas condiciones durante 15 minutos. Se centrifuga a 3500 r.p.m. durante media hora y se separan de esta forma tres fases: un Iíquido sobrenadante que contiene la proteína solubilizada, y una fase sólida que consta de dos estratos, uno superior formado por  producto no solubilizado y otro inferior procedente de la trituración del caparazón del crustáceo. Finalmente la fase Iíquida se liofiliza a una

 

UNIVERSIDAD UNIVERSIDAD  NACIONAL DE CAJAMARCA ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

temperatura de placas de 55°C para obtener el concentrado de proteína desecado.

IV. 

CONCLUSIÓN Se logró conocer los diferentes métodos de extracción de proteínas, se  puede extraer de plantas y animales de tejido, levaduras y microorganismos, los más comunes son de vegetales y animales.  

V. 

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

LOPEZ, B. (1997). Métodos de extracción de proteína de patexo.  Voet, V. D. (1992). Bioquímica.Técnicas de purificación de las proteínas. Barcelona. España.: Ediciones Omega.