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MÁSTER INTERUNIVERSITARIO EN INGENIERÍA AMBIENTAL ESPECIALIDAD EN DIRECCION DE ESTACIONES DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES
TRABAJO FINAL DE MÁSTER MÁSTER: STER:
Realizado por: CARLOS VICENTE GARCÍA GRUPO AGUAS DE VALENCIA EDAR QUARTQUART-BENAGER BENAGER
Directores: DANIEL AGUADO GARCÍA JOAQUÍN SERRALTA SEVILLA
Valencia, 2011
DATOS Autor: Carlos Vicente García Dirección: Ronda del Parque nº 14 5ªE CP 44002 TERUEL e-mail:
[email protected] Teléfono: 600317795 Empresa: Grupo Aguas de Valencia, Gran Vía Marqués del Turia, 19 CP46005 Valencia Valencia
Resumen
RESUMEN __________________________________________________________________________________________________________
Resumen
Resumen
RESUMEN El problema de la eutrofización causa deterioros de los ecosistemas acuáticos. La solución a este problema pasa por la minimización de los vertidos y del exceso de nutrientes, principalmente nitrógeno y fósforo, en las aguas vertidas a cauces naturales (ríos, lagos, mares). Las estaciones de tratamiento de aguas residuales son las encargadas de eliminar gran cantidad de estos nutrientes, reduciendo considerablemente su volumen en los vertidos a los ecosistemas acuáticos. La implantación de esquemas de tratamiento para la eliminación biológica de nitrógeno, es necesaria para abordar la minimización del problema de la eutrofización. Sin embargo, el diseño de muchas estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR), realizadas cuando la legislación no exigía la eliminación de nutrientes, no permite la eliminación biológica de nitrógeno mediante el proceso nitrificación/desnitrificación. Actualmente, la normativa vigente obliga a muchas de estas EDAR a buscar soluciones con el fin de cumplir los requisitos de vertido. Las soluciones pasan por la construcción de un nuevo reactor o la construcción de una cámara anóxica, y la instalación de una corriente de recirculación interna, soluciones todas ellas que suponen una elevada inversión económica, además de un largo tiempo de ejecución. El objetivo principal de este trabajo es estudiar la eliminación biológica de nitrógeno en plantas que no hayan sido diseñadas para ello (sin zona anóxica y/o sin recirculación interna). Para ello se ha realizado un estudio en planta piloto en el que se pretende mediante aireación intermitente alcanzar concentraciones de nitrógeno admisibles por la legislación con un consumo energético mínimo, es decir, trabajando con un tiempo de retención celular (TRC) aerobio bajo y concentraciones de oxígeno disuelto bajas. En este estudio se muestra la utilidad de integrar diversas técnicas, como son las técnicas microscópicas moleculares (hibridación in situ FISH), técnicas respirométricas, y técnicas microscópicas simples (contraste de fases, tinciones) a los sistemas de eliminación biológica de nitrógeno, mostrando la utilidad de dichas técnicas para el seguimiento y control de los procesos biológicos. Complementado además con resultados analíticos y operacionales demostrando con todo ello que la aireación intermitente es un sistema perfectamente válido para la eliminación biológica de nitrógeno y la optimización energética. Además, se utilizará el software DESASS para la simulación de la planta piloto, ajustando los parámetros cinéticos para reproducir los resultados experimentales obtenidos mediante las técnicas mencionadas anteriormente.
Resumen
El trabajo desarrollado en el presente estudio supone un conocimiento más profundo de los sistemas de eliminación de nitrógeno, además de dar solución a otro de los principales problemas que actualmente tiene lugar en las estaciones depuradoras de agua residual como es la optimización energética y ahorro económico.
Índice
ÍNDICE __________________________________________________________________________________________________________
Índice
Índice
ÍNDICE
1- INTRODUCCIÓN ................................................................................. 3 1.1-
La eutrofización ................................................................................................ 3
1.2-
El nitrógeno en sistemas acuáticos ................................................................... 5
1.3-
El nitrógeno en las aguas residuales ................................................................. 6
1.4-
El fósforo en las aguas residuales ..................................................................... 8
1.5-
Legislación ......................................................................................................... 8
1.6-
Eliminación biológica de nitrógeno en aguas residuales .............................. 10
1.6.1-
Nitrificación y sus factores................................................................................. 10
1.6.2-
Metabolismo implicado en el proceso de nitrificación..................................... 11
1.6.3-
Proceso de desnitrificación ................................................................................ 12
1.6.4-
Metabolismo implicado en el proceso de desnitrificación ............................... 13
1.6.5-
Esquemas del proceso de eliminación biológica de nitrógeno ......................... 14
1.6.6-
Esquemas de eliminación biológica conjunta de nitrógeno y fósforo. ........... 15
1.7-
Eliminación físico-química de nitrógeno en aguas residuales...................... 18
1.8- Control del proceso nitrificación/desnitrificación mediante aireación intermitente. .............................................................................................................. 19 1.91.10-
Técnicas microscópicas ................................................................................... 20 Hibridación in situ (FISH) .......................................................................... 22
1.10.1Organismos responsables de la nitrificación y sondas FISH utilizadas para su identificación. .................................................................................................................... 23 1.10.2Organismos responsables de la desnitrificación y sondas FISH utilizadas para su identificación. ....................................................................................................... 25
1.11-
Respirometría .............................................................................................. 26
1.11.1-
1.12-
Análisis de los diferentes tipos de respirómetros. ......................................... 26
Software de simulación de EDAR: DESASS .............................................. 28
1.12.1-
Características del software ........................................................................... 28
1.12.2-
Modelos utilizados.......................................................................................... 29
1.12.3-
Aplicaciones.................................................................................................... 29
2- OBJETIVO ........................................................................................... 33 3- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................. 37 3.1-
Descripción de la planta piloto....................................................................... 37
3.2-
Antecedentes: Prediseño, montaje y puesta en marcha de la planta piloto. 39
Índice
3.3-
Condiciones de operación .............................................................................. 41
3.4-
Fases del estudio .............................................................................................. 42
3.5-
Método de identificación y cuantificación de las poblaciones bacterianas . 43
3.5.1-
Condiciones de hibridación ............................................................................... 43
3.5.2-
Hibridación de las muestras ............................................................................... 44
3.5.3-
Cuantificación de las poblaciones bacterianas .................................................. 46
3.6-
Tinciones para la detección de bacterias PAO .............................................. 47
3.6.1-
Tinción de poli-fosfatos (Azul de metileno) ..................................................... 47
3.6.2-
Tinción de PHB (Sudan Black) .......................................................................... 48
3.7-
Caracterización química ................................................................................. 49
3.7.1-
Determinación de la concentración de sólidos en suspensión, SST y SSV. ..... 49
3.7.2-
Determinación de la Demanda Química de Oxígeno, DQO ............................ 49
3.7.3-
Determinación de Nitrógeno Total, NT. ............................................................ 49
3.7.4-
Determinación de nitrato, NO3-......................................................................... 49
3.7.5-
Determinación de nitrito, NO2-. ........................................................................ 50
3.7.6-
Determinación de amonio, NH4+. ...................................................................... 50
3.7.7-
Determinación de fósforo total, PT. ................................................................... 50
3.8-
Respirometría .................................................................................................. 51
3.8.1-
Respirómetro BM-T ........................................................................................... 51
3.8.2-
Modos de ensayo del respirómetro BM-T ......................................................... 53
3.8.3-
Parámetros respirométricos determinados........................................................ 54
4- RESULTADOS ..................................................................................... 60 4.1-
Resultados analíticos y de operación ............................................................. 60
4.2- Resultados de la identificación y cuantificación de bacterias nitrificantes mediante la técnica FISH. ......................................................................................... 65 4.2.1-
Bacterias amonioxidantes (AOB) ....................................................................... 65
4.2.2-
Bacterias nitritoxidantes (NOB) ........................................................................ 67
4.3-
Visualización al microscopio óptico .............................................................. 69
4.3.1-
Bioindicación del fango activo........................................................................... 69
4.3.2-
Tinción de poli-fosfatos (Azul de metileno) ..................................................... 71
4.3.3-
Tinción de polihidroxibutiratos, PHB (Sudan Black) ....................................... 72
4.4-
Determinación de parámetros cinéticos mediante técnicas respirométricas73
4.4.1-
Ensayos respirométricos biomasa autótrofa. ..................................................... 73
4.4.1.1-
Determinación de YA .................................................................................................. 73
Índice
4.4.1.2- Determinación de la tasa máxima de respiración de las autótrofas (Rsmáx auto) y tasa máxima de respiración por sólido suspendido volátil (Rspmáx auto) ................................... 75 4.4.1.3-
Determinación de la tasa máxima de consumo de amonio (RN). .............................. 75
4.4.1.4-
Determinación de la tasa específica global de consumo de amonio (AUR). ........... 76
4.4.1.5-
Determinación de la biomasa autótrofa (XA) ............................................................. 76
4.4.1.6-
Determinación de la tasa específica de nitrificación máxima (qN) ........................... 77
4.4.1.7-
Determinación de la tasa máxima de crecimiento de la biomasa autótrofa (μa,max) . 77
4.4.1.8-
Determinación de la tasa de crecimiento específico de la biomasa autótrofa (μa) ... 77
4.4.1.9-
Determinación del tiempo de retención mínimo para la nitrificación (TRCnitrificación) 78
4.4.2-
Ensayos respirométricos biomasa heterótrofa. ................................................. 78
4.4.2.1-
Determinación de YH.................................................................................................. 78
4.4.2.1- Determinación de la tasa máxima de respiración de las heterótrofas (Rsmáx hetero) y tasa máxima de respiración por sólido suspendido volátil (Rspmáx hetero) ............................ 80
4.4.3-
4.5-
Análisis e interpretación de los resultados de respirometría ........................... 81
Diseño y simulación de la planta piloto mediante el software DESASS. ..... 82
4.5.1-
Simulación de la planta piloto con nitrificación en una etapa. ........................ 84
4.5.2-
Simulación de la planta piloto con nitrificación en dos etapas. ....................... 89
5- CONCLUSIONES ................................................................................ 98 6- BIBLIOGRAFÍA ................................................................................ 102
Índice de Figuras
Índice de Figuras
INDICE DE FIGURAS Figura 1- Origen de los vertidos causantes de la eutrofización..................................... 4 Figura 2- Ciclo del nitrógeno en la naturaleza. ............................................................. 5 Figura 3- Fracciones del nitrógeno en el agua residual ................................................. 7 Figura 4- Fracciones del fósforo en el agua residual ...................................................... 8 Figura 5- Esquema del proceso Ludzack-Ettinger modificado ................................... 14 Figura 6- Esquema BARDENPHO ................................................................................ 14 Figura 7- Esquema A2/O ............................................................................................... 15 Figura 8- Esquema UCT ................................................................................................ 16 Figura 9- Esquema UCT modificado............................................................................. 16 Figura 10- Esquema JHB ............................................................................................... 17 Figura 11- Esquema ISAH ............................................................................................. 17 Figura 12- Foto Planta Piloto ........................................................................................ 38 Figura 13- Foto equipo de bombeo planta piloto ........................................................ 40 Figura 14- Respirómetro BM-T .................................................................................... 51 Figura 15- Esquema respirómetro ................................................................................ 52 Figura 16- Elementos vaso reactor del respirómetro ................................................... 53 Figura 17- Gráfica de determinaciones de amonio, nitrato y nitrito durante el periodo de estudio ......................................................................................................... 61 Figura 18- Porcentaje de eliminación de DQO, NT y PT de la planta piloto ........... 62 Figura 19- Evolución del pH y la concentración de oxígeno en varios ciclos de operación de la planta piloto. ........................................................................................ 63 Figura 20- Evolución de los sólidos suspendidos volátiles del reactor biológico ....... 64 Figura 21- Fotos con las sondas Nso1225 amonioxidantes de la clase β-proteobacteria 600x (Figura 21A) y EUBmix 338 (Figura 21B) ........................................................... 65 Figura 22- Fotos con las sondas Nso1225 amonioxidantes de la clase β-proteobacteria 600x (Figura 22A) y EUBmix 338 (Figura 22B) ........................................................... 66 Figura 23- Porcentaje Hibridación AOB ...................................................................... 66 Figura 24- Fotos con la sonda Ntspa662, nitritoxidantes flecha blanca 600x (Figura 24A) y Eubacterias flecha blanca 600x (Figura 24B) sondas EUBmix 338, 600x ..... 67 Figura 25- Fotos con la sonda Ntspa662, nitritoxidantes flecha blanca 600x (Figura 25A) y Eubacterias flecha blanca 600x (Figura 25B) sondas EUBmix 338, 600x ..... 67 Figura 26- Porcentaje Hibridación NOB ...................................................................... 68 Figura 27- Foto del flóculo de una muestra tomada el 09/09/11 de la planta piloto. Objetivo 10x ................................................................................................................... 69 Figura 28- Foto de Rotaria sp. de una muestra tomada el 30/08/11 de la planta piloto. Objetivo 10x ................................................................................................................... 70 Figura 29- Foto del flóculo de una muestra tomada el 27/09/11 de la planta piloto. Objetivo 10x ................................................................................................................... 70 Figura 30- Fotos tinción poli-fosfatos objetivo 100x .................................................. 72 Figura 31- Foto tinción Sudan Black objetivo 100x.................................................... 72 Figura 32- Gráfica obtención de YA mediante respirometría ...................................... 73
Índice de Figuras
Figura 33- Obtención de la pendiente de YA .............................................................. 74 Figura 34- Gráfica de obtención de la Rsmáx de las bacterias autótrofas ................... 75 Figura 35- Gráfica de obtención de YH mediante respirometría ................................. 78 Figura 36- Obtención de la pendiente YH .................................................................. 79 Figura 37- Gráfica de obtención de la Rsmáx de las bacterias heterótrofas ............... 80 Figura 38- Esquema planta piloto para la simulación en DESASS ............................. 82 Figura 39- Caudales y cargas de entrada a la planta piloto......................................... 83 Figura 40- Cinética de la biomasa heterótrofa en la simulación de la nitrificación en una etapa. ....................................................................................................................... 85 Figura 41- Cinética de la biomasa autótrofa en la simulación de la nitrificación en una etapa. ....................................................................................................................... 85 Figura 42- Cinética de la biomasa PAO en la simulación de la nitrificación en una etapa. .............................................................................................................................. 86 Figura 43- Resultados del efluente en la simulación de la nitrificación en una etapa. ........................................................................................................................................ 87 Figura 44- Resultados del fraccionamiento del nitrógeno en el efluente del reactor en la simulación de la nitrificación en una etapa. ....................................................... 88 Figura 45- Resultados del fosfato y biomasa PAO en el efluente del reactor en la simulación de la nitrificación en una etapa. ................................................................ 88 Figura 46- Resultados de la salida del reactor en la simulación de la nitrificación en una etapa. ....................................................................................................................... 89 Figura 47- Cinética de la biomasa heterótrofa en la simulación de la nitrificación en dos etapas. ...................................................................................................................... 90 Figura 48- Cinética de la biomasa autótrofa en la simulación de la nitrificación en dos etapas. ...................................................................................................................... 91 Figura 49- Cinética de la biomasa PAO en la simulación de la nitrificación en dos etapas. ............................................................................................................................. 91 Figura 50- Resultados del efluente en la simulación de la nitrificación en dos etapas. ........................................................................................................................................ 92 Figura 51- Resultados del fraccionamiento del nitrógeno en el efluente del reactor en la simulación de la nitrificación en dos etapas........................................................ 93 Figura 52- Resultados del fosfato y biomasa PAO en el efluente del reactor en la simulación de la nitrificación en dos etapas. ................................................................ 93 Figura 53- Resultados de la salida del reactor en la simulación de la nitrificación en dos etapas. ...................................................................................................................... 94
Índice de Tablas
INDICE DE TABLAS Tabla 1- Grado de eutrofia en sistemas lénticos OCDE, 1982....................................... 4 Tabla 2- Requisitos de vertido de EDAR (Directiva 91/271/CEE) .............................. 10 Tabla 3- Requisitos de vertido de EDAR en zonas sensibles (Directiva 91/271/CEE) 10 Tabla 4- Sondas FISH bacterias nitrificantes ............................................................... 24 Tabla 5- Sondas FISH bacterias desnitrificantes .......................................................... 25 Tabla 6- Composición agua residual sintética .............................................................. 37 Tabla 7- Parámetros de diseño iniciales ....................................................................... 39 Tabla 8- Condiciones de operación de la planta piloto ............................................... 42 Tabla 9- Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución tampón de hibridación en la técnica FISH ...................... 45 Tabla 10- Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución tampón de lavado en la técnica FISH .............................. 45 Tabla 11- Sondas FISH de bacterias nitrificantes utilizadas para la identificación y cuantificación................................................................................................................. 45 Tabla 12- Parámetros de la biomasa autótrofa y heterótrofa obtenidos mediante respirometría .................................................................................................................. 55 Tabla 13- Fórmulas y fuentes bibliográficas de la biomasa autótrofa ......................... 56 Tabla 14- Tabla resumen caracterizaciones físico-químicas de la planta piloto ....... 64 Tabla 15- Valores para el cálculo del rendimiento biomasa autótrofa ....................... 73 Tabla 16- Valores para el cálculo del rendimiento biomasa heterótrofa .................... 79 Tabla 17- Tabla resumen parámetros respirométrico .................................................. 81
Índice de Tablas
Introducción
1- INTRODUCCIÓN
Introducción
2
Introducción
1- INTRODUCCIÓN 1.11.1- La eutrofización El origen de las aguas residuales hace referencia a toda combinación de líquidos o aguas que transportan residuos y que producen una contaminación al agua de carácter físico, químico o biológico. Así pues, la producción de aguas residuales se ha visto incrementada de forma exponencial en las últimas décadas, de igual forma que la industrialización y explotación de los recursos en nuestra sociedad. El agua residual puede llegar eventualmente a formar parte del agua subterránea, superficial o pluvial, con la consiguiente contaminación de estos flujos hidrológicos. Gracias al tratamiento de las aguas residuales en Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR), la incorporación de agua residual al medio se ha visto reducida. Si bien es cierto, que el tratamiento de las aguas residuales tiene años de historia, es en la actualidad, cuando la concienciación y principalmente la legislación de los estados, ha provocado un aumento en los porcentajes de agua residual tratada, así como en la calidad del agua efluente de las EDAR. A pesar de ello, los vertidos de aguas residuales urbanas constituyen, por su importancia, la segunda fuente de contaminación de medios acuáticos en forma de eutrofización (Comisión Europea 1998). La eutrofización consiste en un desarrollo excesivo de algas en una masa de agua superficial estancada, que origina una alteración de sus características físico-químicas iniciales. Los responsables de este fenómeno son principalmente los nutrientes que reciben los organismos vegetales y que ven incrementada continuamente su concentración en las aguas continentales como consecuencia de los vertidos de aguas residuales (Villaseñor 2001) (Figura 1). La eutrofización es un proceso natural, sin embargo puede verse acelerada debido a la contaminación del agua por agricultura, vertidos de aguas residuales, etc. (Figura 1). La proliferación exagerada de algas da lugar a problemas como aumento de turbidez, incremento de pH, descomposición de las algas muertas agotando el oxígeno, generación de sustancias tóxicas por parte de algunos microorganismos. La solución de los problemas de eutrofización pasa, principalmente, por la limitación de la entrada de nutrientes (nitrógeno y fósforo) y la eliminación de los presentes en el sedimento.
3
Introducción
Figura 1- Origen de los vertidos causantes de la eutrofización
La clasificación de eutrofia de sistemas lóticos es complicada por lo que la mayoría de clasificaciones eutróficas aparecen en sistemas lénticos, así pues encontramos tres tipos de clasificación: TSI “Trophic State Index” determinado a partir del disco de Secchi, concentración de clorofila y de fósforo (Carlson 1977), modelo basado en los aportes de nutrientes esperados y las condiciones hidrológicas (Vollenweider 1976), o bien en base a los niveles de clorofila, transparencia y fósforo propuesto por la (OCDE 1982). Esta última clasificación es la que se muestra en la Tabla 1. Tabla 1- Grado de eutrofia en sistemas lénticos OCDE, 1982.
4
Introducción
1.21.2- El nitrógeno en sistemas acuáticos El nitrógeno es esencial para todos los organismos, es parte fundamental de moléculas como proteínas y ácidos nucleicos y es un nutriente indispensable en el crecimiento de organismos fotosintéticos. En la química del agua, los compuestos del nitrógeno, NH4+, NO2-, NO3- y nitrógeno orgánico, representan un papel muy importante puesto que son ellos los verdaderamente responsables del crecimiento de los organismos animales y vegetales en el medio acuático (Figura 2). En condiciones normales, los compuestos nitrogenados del agua provienen fundamentalmente de la degradación de la materia orgánica muerta.
Figura 2- Ciclo del nitrógeno en la naturaleza.
En condiciones del medio alteradas, los aportes adicionales de nitrógeno proceden mayoritariamente de los vertidos urbanos y de ciertas instalaciones industriales, así como del uso creciente de fertilizantes y pesticidas en la agricultura. En este sentido, los vertidos de compuestos nitrogenados deben reducirse paulatinamente, tanto en industrias como en la agricultura y ganadería. En la naturaleza, y en presencia de oxígeno, el nitrógeno amoniacal se transforma en nitrito y éste, rápidamente, en nitratos, que es la forma más oxidada que se encuentra el nitrógeno en el agua.
5
Introducción
Para conocer la calidad de un agua potable, los mejores indicadores son el contenido en amoniaco, en materia orgánica, en nitritos y en bacterias. La reglamentación española considera al amoniaco como un componente no deseado en el agua potable y establece como valor orientativo de calidad 0'05 mg/l y como valor limite tolerable 0'5 mg/l. En cuanto a nitratos, la Directiva Comunitaria de 15/7/80 fija un nivel guía de 25 mg/l y una concentración máxima admisible de 50 mg/l. Los nitritos no son aceptables en las aguas potables. Proceden de la oxidación incompleta del amoniaco y de la reducción bacteriana incompleta de los nitratos. Un agua que contenga nitritos puede considerarse un agua contaminada por materias fecales. La reglamentación española establece como valor orientador de calidad la ausencia de nitritos en un agua de consumo, y como valor máximo tolerable hasta 0'1 mg/l. Todas los valores superiores a estos determinan la contaminación del agua. Los nitratos se pueden transformar en nitritos en función de reacciones químicas y biológicas del aparato digestivo. Los nitritos pasan rápidamente a la sangre y se fijan a la hemoglobina impidiendo la oxigenación de los tejidos. Esta enfermedad, metahemoglobinemia perjudica principalmente a niños. Los iones nitrito pueden formar compuestos nitrogenados en el organismo, que, en un porcentaje elevado, hay indicios de que sean cancerígenos. Por otra parte, el nitrógeno puede ser tóxico para los peces. La Directiva Europea de 18/7/78, fija la concentración máxima en nitrito en el agua apta para la vida piscícola en 0,03 mg/l. En forma de nitritos, el nitrógeno es perjudicial para los mamíferos. El análisis de todos los compuestos nitrogenados citados es imprescindible para la determinación de la calidad de las aguas, tanto destinadas a consumo humano como procedentes de procesos de depuración, siendo necesario el adoptar medidas de tratamiento para su eliminación o reducción de concentración.
1.31.3- El nitrógeno en las aguas residuales Siendo más específicos y desde el enfoque de las aguas residuales son tres las formas en las que se presenta el nitrógeno (Figura 3). Así podemos distinguir: -Nitrógeno orgánico: Se encuentra constituido fundamentalmente por urea y proteínas. La descomposición bacteriana y la hidrólisis pueden favorecer la conversión de este nitrógeno orgánico en nitrógeno amoniacal antes de que el agua residual llegue a la EDAR estando ligada esta conversión al tiempo de residencia que el agua residual permanece en los colectores de la red de alcantarillado.
6
Introducción
Presenta concentraciones en las aguas residuales urbanas entre los 10 y 20 mg/l. -Nitrógeno amoniacal (NH4+, NH3): El nitrógeno amoniacal se puede presentar en forma de amonio (NH4+) o en forma de amoniaco (NH3), en función del valor de pH del agua residual. Se encuentra presente en aguas residuales urbanas en concentraciones entre 30 y 65 mg/l. Esta forma de nitrógeno es oxidada a nitrato en los reactores biológicos en el proceso de nitrificación, siendo vital el funcionamiento de esta etapa para una posterior eliminación biológica de nitrógeno. -Nitrógeno nítrico (NO2-, NO3-): El nitrógeno nítrico puede presentarse en forma de nitrito (NO2-) o de nitrato (NO3-). El nitrito es inestable y fácilmente oxidable a nitrato, por lo que su presencia en aguas residuales suele ser despreciable. La presencia de nitratos puede deberse a la contribución de las aguas subterráneas donde sus niveles pueden ser notables, o a la oxidación del amonio en presencia de oxígeno. Esta última vía es poco probable en la entrada a la EDAR, ya que el oxígeno presente en los sistemas de recogida de aguas residuales es muy bajo debido a la gran demanda, además la cantidad de nitrato presente en el influente suele ser baja o nula, debido a que puede usarse como aceptor de electrones en ausencia de oxígeno, situación habitual en los sistemas de alcantarillado. Esta propiedad de aceptor de electrones hace que el nitrato sea un elemento importante para el proceso de desnitrificación en la eliminación biológica de nitrógeno en el tratamiento secundario de las EDAR.
Figura 3- Fracciones del nitrógeno en el agua residual
La contribución de cada una de estas fracciones puede cambiar sustancialmente en función del sistema a analizar: agua residual influente, licor mezcla, agua decantada, agua efluente, fango digerido, etc.
7
Introducción
1.41.4- El fósforo en las aguas residuales En las aguas residuales es posible encontrar el fósforo en distintas formas (Figura 4): - Ortofosfatos (PO43-, HPO42-, H2PO4-, H3PO4): Suelen encontrarse en aguas residuales en unas concentraciones típicas entre 3 y 7 mg/l. En esta forma, el fósforo es fácilmente asimilable por la biomasa. Los ortofosfatos pertenecen a la fracción inorgánica del fósforo presente en las aguas residuales. - Poli-fosfatos (PO33-)n: Son polímeros formados por monómeros de fosfato. Son almacenados intracelularmente, y degradados a ortofosfatos. No suelen encontrarse en aguas residuales, pero si en los reactores de fangos activos de las estaciones depuradoras de aguas residuales. - Fósforo precipitado (me-P): Fracción de ortofosfatos que forma precipitados con metales. Esta fracción suele ser importante en el reactor de fangos activos. - Fósforo orgánico: Es la fracción del fósforo asociada a la materia orgánica. Su concentración típica está en torno a 3 mg/l. Dentro del fósforo orgánico se encuentran especies como los ácidos nucleicos, los fosfolípidos y el ATP.
Figura 4- Fracciones del fósforo en el agua residual
1.51.5- Legislación La legislación referente a la protección de las aguas ha tenido una evolución del derecho de aguas en aras de la protección ambiental, teniendo una consideración progresiva del agua como recurso natural. Así ya la ley de aguas de 1985 otorga a la calidad de las aguas un valor sin precedentes, es decir, compatibilizar la gestión del agua con la protección ambiental. Más tarde hay una reforma de la ley de aguas de 1999. Finalmente como legislación más genérica cabe destacar la transposición de la directiva marco 2000, a través del texto refundido de la ley de aguas (TRLA) que se corresponde con el Real Decreto legislativo 1/2001, la cual es una norma de contenido esencialmente ambiental.
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Introducción
Centrando la normativa de protección de aguas en el ámbito de las aguas residuales, encontramos en primer lugar la normativa a nivel europeo. La normativa aplicable es la Directiva 91/271/CEE de saneamiento y depuración de aguas residuales. Esta Directiva tiene como objetivos la construcción de infraestructuras de saneamiento y depuración, así como lograr determinados niveles de emisión de las aguas una vez depuradas. La Directiva 98/15/CE, por la que se modifica la Directiva 91/271/CEE en relación con determinados requisitos establecidos en su anexo I y la Directiva 2000/60/CE más conocida como directiva marco del agua. A su vez esta Directiva 91/271 marca una serie de obligaciones consistentes en que las aglomeraciones urbanas deben en determinados plazos, dotarse de sistemas de colectores que recojan las aguas residuales, y además, someter esas aguas residuales a tratamientos de depuración adecuados, exigiendo como regla general en poblaciones de más de 5000 habitantes, plantas de tratamiento secundario. La normativa vigente en materia de aguas residuales a nivel estatal queda marcada por el Real decreto-ley 11/1995 de tratamiento de aguas residuales, que a su vez queda desarrollado por el Real Decreto 509/1996. También de régimen estatal es el Real Decreto 1620/2007 de régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas. Así como la Orden de 12 de noviembre de 1987, sobre normas de emisión, objetivos de calidad y métodos de medición de referencia relativos a determinadas sustancias nocivas o peligrosas contenidas en los vertidos de aguas residuales. Más focalizado en la legislación autonómica valenciana, encontramos como normativa vigente la Ley 2/1992 reguladora de la evaluación, tratamiento y reutilización de las aguas residuales y el Decreto 266/1994, regulador del canon de saneamiento. Así pues los aspectos competenciales en materia de aguas residuales han sido tradicionalmente de carácter local, aunque hay un progresivo desplazamiento a instancias territoriales superiores (interés supramunicipal, normativa autonómica). La autorización de vertido es una competencia local (art 101 TRLA), los valores de emisión vienen fijados en la legislación estatal y autonómica. En la Directiva 91/271, como en el Real Decreto ley 11/1995, se desarrolla la aplicación de tratamientos a las aguas residuales antes de su vertido a las aguas continentales o marítimas. También esta normativa define el concepto de “zona sensible”, por lo que los vertidos procedentes de una EDAR deberán cumplir las limitaciones expuestas en la Directiva 91/271/CEE (ver Tablas 2 y 3), en base a la catalogación de la situación local, limitando la concentración o porcentaje de reducción de nutrientes (nitrógeno y fósforo), en caso de tratarse de una “zona sensible”. 9
Introducción
Tabla 2- Requisitos de vertido de EDAR (Directiva 91/271/CEE)
Tabla 3- Requisitos de vertido de EDAR en zonas sensibles (Directiva 91/271/CEE)
1.61.6- Eliminación biológica de nitrógeno en aguas residuales La eliminación biológica de nitrógeno en las aguas residuales necesita que se lleven a cabo dos procesos: la nitrificación, transformación del nitrógeno amoniacal en nitratos, y la desnitrificación, transformación de nitratos en nitrógeno gas. 1.6.11.6.1-
Nitrificación y sus factores
El nitrógeno presente en un agua residual se encuentra mayoritariamente en forma amoniacal. El vertido de un agua residual con alto contenido en amonio a un medio acuático puede producir un agotamiento de los recursos de oxígeno de las aguas receptoras al producirse la oxidación del amoníaco a nitrato. Una forma de evitar este agotamiento de oxígeno en el medio receptor consiste en oxidar el nitrógeno antes de su descarga en una estación depuradora de aguas residuales. El proceso de nitrificación en EDAR se ve limitado principalmente por tres factores: -
Temperatura: El crecimiento de las bacterias nitrificantes varía con la temperatura, situándose el valor óptimo en el rango 26-30 ºC. El valor de la temperatura afecta a los valores de las constantes de equilibrio, ácido/base, gas/líquido, a la solubilidad de las sustancias, a los coeficientes de difusión y a la actividad enzimática. La influencia de la temperatura en las diferentes constantes biológicas o físicas se expresa habitualmente mediante una expresión modificada de la ecuación de Arrhenius, aplicable a todos los procesos biológicos.
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Introducción
KT y K20 = Valor del parámetro a las temperaturas T y 20ºC respectivamente. η = Coeficiente que depende del proceso. T = Temperatura en ºC. -
Limitaciones en la transferencia y difusión de oxígeno: En el caso de los cultivos en suspensión, la transferencia de materia entre fases puede limitar el crecimiento, es decir, el oxígeno se suministra en fase gas y tiene que llegar a la fase líquida para ser consumido.
-
pH: El pH óptimo de las bacterias está entre 7.5 y 8.5, aunque la nitrificación biológica se puede llevar a cabo en un rango más amplio (entre 6-10). En la limitación del crecimiento de las bacterias nitrificantes debido al pH se diferencian dos causas. La primera es que el pH afecta a la actividad enzimática. La segunda es que la concentración de protones afecta a los equilibrios ácido/base.
1.6.21.6.2-
Metabolismo implicado en el proceso de nitrificación
Los compuestos nitrogenados inorgánicos más comunes usados como donadores de electrones son el amoníaco (NH3) y el nitrito (NO2-) que se oxidan aeróbicamente por las bacterias nitrificantes. Un grupo de organismos oxida el amoniaco a nitrito y otro oxida el nitrito a nitrato, la oxidación completa implica la pérdida de ocho electrones (8e-). Los electrones de los compuestos nitrogenados entran en una cadena de transporte de electrones, y el flujo de electrones establece un potencial de membrana y una fuerza protón-motriz que está ligada a la síntesis de ATP. Sin embargo, debido al potencial de reducción de sus donadores de electrones, las bacterias nitrificantes se enfrentan con problemas bioenergéticos, debido al alto poder de reducción de sus pares NH2OH/NH3 (0V) y NO3-/NO2- (+0,43V). De esta forma las bacterias nitrificantes deben ceder los electrones a sus cadenas de transporte de electrones a nivel de los últimos pasos, lo que limita la producción de ATP por parte de cada par de electrones introducidos. Hay varias enzimas importantes relacionadas con la oxidación de compuestos nitrogenados reducidos. En las bacterias oxidadoras de amoniaco, el NH3 se oxida por la amoniaco monooxigenasa que produce NH2OH y H2O. Luego la hidroxalamina oxidoreductasa oxida NH2OH a NO2-, extrayéndose cuatro electrones en el proceso. La amoniaco monooxigenasa es una proteína integral de la membrana, mientras que la hidroxilamina oxidoreductasa es periplásmica. En la reacción llevada a cabo por la amoniaco oxigenasa, se requiere el suministro exógeno de dos electrones para reducir un átomo de oxígeno a agua.
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Introducción
NH3 + O2 + 2H+ + 2e- NH2OH + H2O Así por cada cuatro electrones generados en la oxidación de NH3 a NO2-, sólo dos llegan a la oxidasa terminal. Las bacterias oxidadoras de nitritos emplean la enzima nitrito oxidasa para oxidar nitrito a nitrato, a través de una cadena de electrones corta, debido al alto potencial del par NO3-/NO2- hasta la oxidasa terminal. Se obtienen pequeñas cantidades de energía por lo que el crecimiento neto de las bacterias nitrificantes es relativamente bajo. Las aguas residuales o los fangos suplementados con nitrato para estimular la desnitrificación, pueden oxidar el amoniaco a nitrógeno gas (N2). 5 NH4+ + 3NO3- 4 N2 + 9 H2O + H2+ Esta reacción de oxidación anóxica de amoniaco dependiente del nitrato es muy exotérmica, liberando una gran cantidad de energía que se supone ligada a la conservación de la energía en el microorganismo responsable. Esta reacción no es conocida en metabolismos de bacterias nitrificantes conocidas.
1.6.31.6.3-
Proceso de desnitrificación
Normalmente este proceso se lleva a cabo con la finalidad de eliminar nitrógeno del agua residual. Una vez que se ha oxidado el amonio a nitrato, este último puede ser reducido a nitrógeno gas mediante la desnitrificación biológica. El proceso de desnitrificación se puede ver afectado principalmente por tres factores: -
Concentración de oxígeno: El oxígeno inhibe el proceso de desnitrificación ya que es utilizado por los microorganismos como aceptor de electrones antes que el nitrato, por tanto son necesarias condiciones de anoxia en el sistema. En sistemas con elevados tiempos de retención celular y concentraciones bajas de oxígeno disuelto, se puede llevar a cabo la nitrificación y desnitrificación simultáneas, ya que pueden aparecer condiciones de anoxia en una parte del reactor o dentro de los flóculos.
-
Relación C/N: Es importante considerar la concentración de sustrato asimilable para tener un proceso desnitrificante eficiente, ya que la materia carbonosa es el dador de electrones en el proceso de desnitrificación.
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Introducción
Relaciones C/N bajas pueden dar lugar a desnitrificaciones incompletas, mientras que relaciones altas dan lugar a desnitrificaciones completas y materia orgánica residual. -
pH: El intervalo de pH óptimo está entre 7 y 9 aproximadamente situándose la condición óptima alrededor de 7.5. Valores por debajo de 7 pueden provocar un aumento de óxidos nitrosos, especialmente de N2O como productos finales de la desnitrificación. En el proceso de desnitrificación se consumen protones (H+), por lo que la acidez disminuye y puede dar lugar a un aumento del pH.
1.6.41.6.4-
Metabolismo implicado en el proceso de desnitrificación
Los compuestos nitrogenados inorgánicos son muy comunes como aceptores de electrones en la respiración anaerobia. Uno de los aceptores de electrones alternativos más común es el nitrato NO3-, que se convierte a formas más reducidas de nitrógeno, N2O, NO y N2. Como estos productos de la reducción del nitrato son todos gaseosos se pierden con facilidad del medio, y por ello este proceso se llama desnitrificación. Dos vías son las existentes para la reducción del nitrato: la reducción asimilatoria del nitrato, donde el nitrato se reduce al nivel de oxidación del amoniaco para su uso como fuente de nitrógeno en el crecimiento o la vía que nos es de interés, y la reducción desasimilatoria del nitrato, por la que el nitrato se usa como un aceptor de electrones alternativo en la generación de energía. El producto final de la reducción desasimilatoria es N2 o N2O. La desnitrificación es beneficiosa en el tratamiento de aguas residuales porque convierte NO3- en N2, decreciendo significativamente la cantidad de nitrógeno disponible. La enzima responsable del primer paso en la reducción del nitrato, la nitrato reductasa desasimilatoria, es una proteína unida a membrana y que sólo se sintetiza en condiciones anóxicas. En consecuencia, el proceso de desnitrificación es anóxico y la reducción desasimilatoria se restringe a procariotas. El primer producto de la reducción de nitratos es el nitrito, NO2-, y otra enzima, la nitrito reductasa es responsable del siguiente paso. En el proceso desasimilatorio son posibles dos vías, una a amoniaco y otra a N2. La vía a amoniaco no tiene lugar en la práctica del tratamiento de aguas aunque la realizan muchas bacterias. La vía a nitrógeno gas comprende dos formas gaseosas nitrogenadas intermediarias, el óxido nítrico (NO), y el óxido nitroso (N2O).
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Introducción
1.6.51.6.5-
Esquemas del proceso de eliminación eliminación biológica de nitrógeno
La instalación típica para la eliminación biológica de nitrógeno consiste en dos tanques en serie, proceso Ludzack-Ettinger modificado (Figura 5). El primer tanque recibe el agua influente a tratar, la recirculación de fangos y el caudal de recirculación interna procedente del segundo tanque, en el cual la mayor parte del nitrógeno se encuentra en forma de nitratos. Aquí se realiza parte de la degradación de la materia orgánica, utilizando para ello los nitratos como aceptores de electrones, que se reducen a nitrógeno gaseoso. Este tanque se mantiene en condiciones anóxicas. En el segundo tanque que se mantiene en condiciones aerobias, se produce simultáneamente la degradación de la materia orgánica y la oxidación del nitrógeno amoniacal a nitrato. Desde este mismo tanque se recircula un importante caudal al tanque anóxico. El agua que sale de este tanque, tras su decantación, es el resultado final del tratamiento biológico. Los fangos decantados son recirculados al tanque anóxico. Recirculación de nitratos
Anóxico
Aerobio
Recirculación de fangos
Figura 5- Esquema del proceso LudzackLudzack-Ettinger modificado
Existen diversas variantes sobre este esquema. Uno de los primeros esquemas utilizados fue el BARDENPHO (Figura 6). Estos sistemas son resistentes a problemas de bulking y presentan una buena eliminación de nitrógeno cuando la recirculación de nitratos es la adecuada. Recirculación de nitratos
Anóxico
Aerobio
Anóxico
Recirculación de fangos
Figura 6- Esquema BARDENPHO
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Aerobio
Introducción
1.6.61.6.6-
Esquemas de eliminación eliminación biológica conjunta de nitrógeno y fósforo.
La eliminación biológica de fósforo requiere la alternancia de una fase anaerobia y una aerobia, llevándose a cabo simultáneamente la eliminación de fósforo y de materia orgánica. La eliminación biológica de fósforo también puede combinarse con los procesos de nitrificación-desnitrificación. La eliminación conjunta de nitrógeno y fósforo necesita de tres reactores: anaerobio, anóxico y aerobio, situados por este orden. En el reactor anaerobio es muy importante evitar la presencia de nitratos, ya que inhiben la liberación de fósforo, permitiendo a las bacterias heterótrofas desnitrificantes asimilar los ácidos grasos volátiles (AGV), e impidiendo el consumo por parte de las PAO, y por tanto, en la zona aerobia las PAO no podrán ni crecer ni acumular poli-fosfatos, puesto que no disponen de sustrato. El A2/O (Figura 7), es el esquema más sencillo para la eliminación conjunta de nitrógeno y fósforo. En el tanque anaerobio tiene lugar la entrada del agua influente, las bacterias captan los ácidos grasos volátiles (AGV) y sueltan fósforo almacenado intracelularmente. En el tanque anóxico las bacterias reducen los nitratos a nitrógeno gas. Posteriormente, en el reactor aerobio, el fósforo es almacenado intracelularmente en forma de poli-fosfatos, consiguiendo la eliminación neta del fósforo.
Recirculación de nitratos
Anaerobio
Aerobio
Anóxico
Recirculación de fangos
Figura 7- Esquema A2 A2/O
En el esquema anterior el fango recirculado se introduce en el tanque anaerobio. El esquema UCT (Universidad de Ciudad del Cabo) (Figura 8), introduce el fango recirculado en el tanque anóxico, evitando la entrada de nitratos en el tanque anaerobio a través de la corriente de recirculación de fangos.
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Introducción
Recirculación de nitratos
Anaerobio
Aerobio
Anóxico
Recirculación de fangos
Figura 8- Esquema UCT
En el esquema UCT modificado (Figura 9), se trata de separar las recirculaciones ricas en nitratos, de forma que se asegure la menor concentración posible de nitratos en el reactor anaerobio. Una compartimentación del tanque anóxico permite tratar separadamente la desnitrificación de los fangos recirculados y del licor mezcla procedente del tanque aerobio.
Anaerobio
Anóxico
Anóxico
Aerobio
Recirculación de fangos
Figura 9- Esquema UCT modificado
El esquema JHB (Johanesbourg) (Figura 10), introduce otro reactor anóxico previo al reactor anaerobio, de forma que se trata separadamente los nitratos del licor mezcla y del fango recirculado. Este esquema es interesante cuando las relaciones DBO5/NKT y DBO5/P-PO4 del influente son desfavorables. De esta forma, la materia orgánica del influente puede ser utilizada por las PAO y el fango recirculado es desnitrificado sin mezclar con el influente, para ello el fango debe tener una elevada concentración permitiendo la desnitrificación por respiración endógena.
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Introducción
Recirculación de nitratos
Anóxico
Anaerobio
Anóxico
Aerobio
Recirculación de fangos
Figura 1010- Esquema JHB
Por último, el esquema ISAH (Institut für Sieldlungswasserwirtschaft und Abfalltechnikder Univeritat Hannover) (Figura 11), se utiliza cuando es necesario adicionar sustrato en el tanque donde se desnitrifica el fango recirculado, de forma que se aporta parte del efluente del tanque anaerobio.
Recirculación de nitratos
Anaerobio
Anóxico
Aerobio
Anóxico
Recirculación de fangos
Figura 1111- Esquema ISAH
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Introducción
1.71.7- Eliminación físicofísico-química de nitrógeno en aguas residuales Aunque en la mayoría de los casos el tratamiento biológico es la tecnología más adecuada para la eliminación de nitrógeno en las aguas residuales, los procesos físico químicos pueden ser técnica y económicamente factibles en ciertas ocasiones. Los principales procesos físico-químicos son: Cloración al break-point: El proceso consiste en la adición de cloro al agua residual para oxidar el amonio a nitrógeno gas. La dosificación de cloro debe ser la correcta. Es necesario tener en cuenta que antes de la oxidación del amonio a nitrógeno gas, se oxida la materia orgánica y otros componentes. Además, el cloro residual debe ser eliminado del efluente mediante el uso de SO2 o carbón activado. El utilizar carbón activado supondrá un alto coste económico. Otro inconveniente de este proceso es la necesidad de un minucioso control del pH para evitar la formación de tricloruro de nitrógeno. Además, en la cloración al break-point se han identificado una serie de compuestos clorados perjudiciales para la salud llamados trihalometanos. Estos compuestos se forman fundamentalmente por la presencia de ácidos fúlvicos provenientes de la degradación de las sustancias químicas naturales que actúan como precursores y por la presencia de compuestos acetilénicos de bajo peso molecular. Air stripping: Este método utiliza el equilibrio NH4+/NH3 para eliminar el nitrógeno de las aguas residuales: NH3 + H2O ↔ NH4+ + OHEl proceso consiste en basificar el agua provocando que el equilibrio se desplace hacia la formación de NH3 como gas disuelto. El siguiente paso consiste en airear la disolución para desplazar el NH3 a la atmósfera. Los problemas asociados con este tratamiento son la baja eficacia del proceso, la formación de carbonato cálcico si se emplea para basificar el Ca(OH)2 y la posible contaminación atmosférica por la producción de amoniaco. Intercambio iónico: El proceso se basa en hacer pasar el efluente del tratamiento secundario de la planta depuradora por un intercambiador iónico con una alta selectividad por el ión amonio. La resina más utilizada es la zeolita natural clinoptilolita. Existen otras resinas que poseen una mayor selectividad por el ión amonio pero nunca se han utilizado en el tratamiento de las aguas residuales. Los inconvenientes de este tratamiento son la necesidad de la regeneración del intercambiador y de la filtración previa del agua a tratar para prevenir una rápida colmatación.
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1.81.8- Control del proceso aireación intermitente. intermitente.
nitrificación/desnitrificación
mediante
La construcción de las EDAR años atrás, en un contexto en el que las exigencias legislativas eran más permisivas en cuanto a la eliminación de nitrógeno y fósforo que en la actualidad, supuso en el diseño de muchas de ellas la ausencia de sistemas para la eliminación biológica de dichos nutrientes. En la actualidad esta deficiencia supone un serio problema ya que muchas EDAR deben adaptar sus sistemas de eliminación para cumplir la legislación vigente. Actualmente una de las principales necesidades de muchas de estas EDAR es la de conseguir una zona anóxica que permita la desnitrificación. Las soluciones a esa necesidad pasan por la construcción de un nuevo reactor o la construcción de una cámara anóxica y la instalación de una corriente de recirculación interna, soluciones todas ellas que suponen una elevada inversión económica, además de un largo tiempo de ejecución. Otra solución alternativa, que se va estudiar e intentar optimizar en este proyecto, consiste en llevar a cabo los procesos de nitrificación/desnitrificación en el mismo reactor mediante la implantación de un sistema de aireación intermitente. De esta manera el reactor aerobio, sigue siendo aerobio en los ciclos de aireación llevando a cabo la nitrificación, y una vez comienza el ciclo de parada el reactor pasa a ser un reactor anóxico con la finalidad de reducir los nitratos del efluente mediante la desnitrificación. La intermitencia de estos ciclos bien regulados por tiempo consigue reducir los valores de nitrógeno total en las EDAR entre un 30-50 % (EPSAR, 2010). La alternancia de las etapas puede ser controlada por ciclos de tiempo o a partir de las mediciones de sondas de nutrientes o sondas de potencial red-ox. Además la desnitrificación permite ahorrar 2,86 gr O2/gr N-NO3- eliminado, lo que energéticamente supone un ahorro de entre un 8-10 % (EPSAR, 2010). Este sistema también mejora el funcionamiento de los decantadores secundarios, teniendo lugar menos problemas de levantamiento de fango debidos al proceso de desnitrificación, además de una considerable disminución del manto de fangos en los mismos. Ello a su vez conlleva la disminución de la turbidez en el efluente de la EDAR. La presencia de condiciones anaerobias, y su alternancia con condiciones aerobias, da lugar a que los organismos acumuladores de poli-fosfatos (PAO) que son capaces de almacenar fósforo intracelularmente en forma de gránulos de polifosfatos, lleven a cabo la eliminación biológica de fósforo. Consiguiendo así un
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significante ahorro en la dosificación de coagulante para la eliminación por vía química. El ahorro de reactivo puede alcanzar entre un 15-20 % (EPSAR, 2010)
1.91.9- Técnicas microscópicas Las técnicas microscópicas más utilizadas en el tratamiento de aguas residuales son el campo claro y el contraste de fases. Estas dos técnicas son con las que suele contar un microscopio óptico del laboratorio de una EDAR. Además de estas técnicas, existen otras técnicas más extendidas en el campo de investigación, como la microscopía de fluorescencia utilizada en este proyecto y que se desarrolla más adelante. El campo claro: Es la iluminación normal. Los componentes de la muestra se visualizan gracias a las diferencias de contraste que existen entre ellos y el medio que los rodea. Las diferencias de contraste se producen porque las células o elementos más grandes, como los flóculos del fango activo, absorben o dispersan la luz en diferentes grados. Por esta razón, esta iluminación se emplea con tinciones o muestras en las que los microorganismos son pigmentados, ya que el contraste se incrementará debido al color. El contraste de la preparación también puede controlarse en campo claro con el diafragma del condensador (diafragma de apertura). El contraste de fases: Es una técnica que se utiliza para estudiar preparaciones de densidades homogéneas, en las que la baja la capacidad de absorción de luz de sus elementos (las células y el medio), hace que la imagen obtenida no presente diferencias de luminosidad entre ellos. El contraste de fases permite la visualización de células sin necesidad de tinción. Este tipo de óptica se basa en el hecho de que las células poseen índices de refracción distintos al medio y por lo tanto producen un desvío en los rayos de luz que las atraviesan, que son retardados. Este efecto es amplificado por un anillo especial que posee el objetivo de los microscopios de contraste de fases, lo que da lugar a la formación de una imagen oscura con un fondo brillante. Campo oscuro: Es un tipo de microscopio óptico, en el que se ha modificado el sistema de iluminación, de manera tal que la luz incide sobre la muestra sólo desde los lados. La única luz que es capaz de entrar en el objetivo es la que, al ser dispersada por la muestra, incide sobre el objetivo; de ahí que los microorganismos se observen brillantes sobre un fondo oscuro, y pueden observarse con ellos objetos de difícil visualización en campo claro o contraste de fases. Se utiliza para preparaciones con muy poco contraste, en las que la muestra se verá como un negativo fotográfico sobre un fondo oscuro.
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Contraste de polarización: En estos microscopios la luz es polarizada y aunque no necesita objetivos especiales, sí de un polarizador situado entre la fuente de luz y el condensador, y de un analizador entre el objetivo y el ocular. Se utilizan para la observación de materiales birrefringentes, tal es el caso de algunas disciplinas como la Mineralogía o la Petrografía. Contraste interferencial de Normarski: En esta técnica se combina la luz polarizada con un principio similar al del contraste de fases, dando como resultado una imagen similar a la aportada por un contraste de fases de gran resolución pero con un marcado efecto de relieve y a color. Este tipo de óptica, aunque de resultados muy satisfactorios, requiere un equipamiento caro, constituido por accesorios como un condensador especial y prismas de polarización, que hacen que su uso sea muy restringido. Microscopía de fluorescencia: La microscopía de fluorescencia se utiliza para visualizar muestras capaces de emitir fluorescencia, es decir, capaces de emitir una determinada longitud de onda cuando previamente ha incidido sobre ellas una luz de menor longitud de onda. La fluorescencia puede ser debida a las características que presentan algunos microorganismos debido a ciertos componentes celulares (autofluorescencia) o mediante la adición de sustancias capaces de teñir la preparación (fluorocromos). En este segundo caso, la muestra estará marcada con colorantes fluorescentes, o bien la fijación del colorante se realiza con un anticuerpo marcado (inmunofluorescencia). En cualquier caso, la fluorescencia se define como la propiedad que poseen algunas sustancias denominadas fluorescentes, las cuales bajo la acción de radiaciones de onda corta (luz ultravioleta), pueden emitir otras radiaciones de longitud de onda más largas denominadas de fluorescencia (radiación visible). Para que la emisión sea selectiva, los filtros de fluorescencia habrán de ser adecuados. Normalmente, se emplea un filtro que delimita la banda de excitación y un segundo filtro o filtro de “barrera” que sólo deja pasar la fluorescencia y elimina los restos de luz de excitación. Las técnicas basadas en la microscopía de epifluorescencia están adquiriendo cada vez mayor auge gracias al desarrollo, entre otras, de las técnicas de estimación de la biomasa viva y de determinación de la actividad biológica, de gran utilidad en el campo de los procesos de depuración de aguas residuales.
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1.101.10- Hibridación in situ situ (FISH) La hibridación in situ con sondas u oligonucleótidos 16S rDNA/23S rDNA marcadas con fluorocromos (FISH) es una técnica que permite identificar microorganismos pertenecientes a un grupo taxonómico específico. Uno de los sistemas estudiados con esta técnica FISH en el campo de la ingeniería ambiental, es la depuración de aguas residuales y más concretamente los tratamientos biológicos, en la que la finalidad es la de tener una mejor identificación, comprensión y entendimiento del estado del licor mezcla. Esta técnica se basa en la hibridación directa de la bacteria diana con una sonda complementaria de una región del gen 16S rRNA o 23S rRNA. El elevado número de moléculas de rRNA (103-105) es una ventaja en la aplicación de la técnica de hibridación al aumentar su sensibilidad. Una secuencia de DNA (sonda) puede unirse con la secuencia de ARN complementaria (16S rRNA o 23S rRNA) y se produce un híbrido DNA:RNA. La sonda está marcada de tal forma que los híbridos formados se pueden detectar fácilmente con un microscopio de epifluorescencia. La especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles taxonómicos, como son dominio, phylum, clase, género, especie para la identificación de bacterias en sus diferentes comunidades naturales. La parte más crítica de la técnica FISH es el diseño de sondas, que deben ser lo suficientemente específicas para unirse únicamente a la bacteria que se quiere identificar en presencia de otras bacterias, en muchos casos con moléculas de rRNA muy homólogas. El tamaño de las sondas oscila entre 15 y 30 nucleótidos. Para asegurar la especificidad de las sondas, los dos parámetros determinantes van a ser la temperatura y la concentración de formamida en el tampón de hibridación. En la mayoría de protocolos la temperatura de hibridación se mantiene constante y es la concentración de formamida la que favorecerá las condiciones de especificidad de la sonda. La formamida hace que disminuya la temperatura de unión de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno. Este compuesto disminuye la temperatura de fusión de los híbridos DNA:RNA en 0,72 ºC por cada 1% de formamida utilizada, y permite realizar la hibridación entre 30 y 50 ºC. El primer paso necesario para llevar a cabo esta técnica es la fijación de las bacterias. De esta forma se conserva su morfología y se favorece el acceso de las sondas. Para permeabilizar las células se utilizan detergentes como el SDS (sodio dodecil sulfato). En función de la pared celular de la bacteria (Gram+ o Gram-) se utiliza un reactivo para la fijación. Para las bacterias Gram-negativas se emplea el paraformaldehido (PFA) y el etanol para las Gram+positivas. La sonda que se utiliza en la técnica FISH está formada por una pequeña secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, en cuyo extremo, normalmente el 5´, se marca con un fluorocromo. 22
Introducción
Una vez que se ha realizado la hibridación y se han marcado las bacterias que interesa identificar, se procede al lavado de la muestra para eliminar el exceso de sonda que no ha hibridado. Después de la hibridación se puede realizar una tinción con un fluorocromo específico del DNA, DAPI, que permitirá teñir todas las células presentes en las muestras hibridadas y no hibridadas. Para observar la muestra hibridada se emplea el microscopio de epifluorescencia.
1.10.1Organismos responsables de la nitrificación y sondas FISH utilizadas 1.10.1para su identificación. La nitrificación está catalizada por procariotas aerobios quimilitotrófos: bacterias oxidadoras de amonio del dominio Bacteria (AOB), bacterias oxidadoras del amonio del dominio Archaea (AOA) y bacterias oxidadoras de nitrito (NOB). La técnica más adecuada para la identificación de AOB, AOA y NOB es la hibridación in situ con sondas ADN:RNA marcadas con fluorocromos (FISH). Las bacterias oxidadoras del amonio a nitrito (AOB) de la subclase beta-proteobacteria, comprende los géneros Nitrosomonas y Nitrosospira. En la mayoría de EDAR el amonio es oxidado por bacterias del género Nitrosomonas (incluido Nitrosococcus mobilis). Las especies más comunes de AOB están relacionadas con N. europaea, N. eutropha, N. mobilis y N. oligotropha. Existe otro grupo de oxidadoras de amonio a nitrito que no se detectan con esta sonda, que pertenecen a la subclase alfaproteobacteria, que incluye el género Nitrosococcus excepto N. mobilis, que pertenece al grupo de beta-proteobacteria oxidadoras de amonio. Las bacterias oxidadoras de nitrito a nitrato (NOB) pertenecen a 4 grupo filogenéticos diferentes: Nitrococcus, Nitrospira, Nitrospina y Nitrobacter. Las alfa-proteobacterias oxidadoras de amonio a nitrito y las oxidadoras de nitrito a nitrato de los géneros Nitrococcus y Nitrospina son bacterias halófilas y, por tanto, no se espera que sean dominantes en sistemas de tratamiento de aguas residuales domésticas. Bacterias oxidantes del amonio (AOB): Las diferencias locales en las concentraciones de sustratos (micronichos) dentro de los flóculos pueden afectar a la distribución y actividad de las AOB en las EDAR. Bacterias relacionadas con Nitrosococcus mobilis parecen estar presentes en reactores que tratan elevadas concentraciones de amonio y con concentraciones de sales elevadas. En los flóculos de los fangos activos las AOB relacionadas con el género Nitrosomonas forman, en general, agregados celulares compactos de forma esférica. Células individuales dentro de éstos agregados se pueden visualizar sólo con aumentos de 600x y 1000x. El diámetro de la mayoría de estos agregados es de 10-50 μm. También pueden existir agregados menos compactos con más espacios dentro de ellos. Células aisladas de AOB también pueden ser visualizadas ocasionalmente en flóculos, pero pueden ser obviadas cuando existen agregados celulares densos de AOB. 23
Introducción
Bacterias oxidantes del nitrito (NOB): Las células de Nitrobacter están presentes en muchos reactores y pueden ser aisladas por cultivo, pero normalmente sus densidades no son altas en EDAR. En reactores que temporalmente contienen elevadas concentraciones de nitritos, por ejemplo SBR, las concentraciones de Nitrobacter pueden ser elevadas, probablemente porque estas NOB están mejor adaptadas a concentraciones altas de nitritos, mientras que Nitrospira está adaptada a concentraciones bajas de nitritos y de oxígeno. Nitrobacter pueden formar también agregados celulares densos. En los flóculos de los fangos activos, las NOB a menudo se encuentran relacionadas espacialmente con las AOB, lo que refleja la relación simbiótica mutualista de estos dos grupos funcionales. Las sondas más utilizadas para la identificación de bacterias encargadas de la nitrificación son las siguientes:
Tabla 4- Sondas FISH bacterias nitrificantes
Sonda
Secuencia (5´(5´-3´)
Especificidad
Referencia
Sondas utilizadas para identificar Dominio Archaeabacteria ARCH917 GTGCTCCCCCGCCAATTC Loy et al. (2002) Eucaryota EUK516 ACCAGACTTGCCCTCC Amann et al (1990) Sondas utilizadas para identificar phyllum y clases del Dominio Bacteria Bacteria EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Amann (1990) Planctomycetes EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Daims et al. (1999) Verrumicrobiales EUB338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Daims et al. (1999) Control EUB338 NONEUB ACTCTACGGGAGGCAGC Wallner et al (1993) Ntspa712 CGCCTTCGCCACCGGCCTTCC Phylum Nitrospira Daims et al. (2001) Sondas utilizadas para identificar subclases de la clase Proteobacteria α-Proteobacteria ALF1b CGTTCGYTCTGAGCCAG Manz et al (1992) β-Proteobacteria BET42a GCCTTCCCACTTCGTTT Manz et al (1992) γ-Proteobacteria GAM42a GCCTTCCCACATCGTTT Manz et al (1992) β-Proteobacteria NSO1225 CGCGATTGTATTACGTGTGA Mobarry et al (1996) β-Proteobacteria NSO1225* CGCCATTGTATTACGTGTGA Alonso et al (2009) β-Proteobacteria NSO190 CGATCCCCTGCTTTTCTCC Mobarry et al (1996)
Sondas utilizadas para identificar géneros de α-Proteobacteria Nitrobacter sp NIT3 CCTGTGCTCCATGCTCCG Wagner et al (1996) Competidora CNIT3 CCTGTGCTCCAGGCTCCG Wagner et al. (1996) Sondas utilizadas para identificar géneros de β-Proteobacteria amoniooxidantes Nitrosomonas spp NSM156 TATTAGCACATCTTTCGAT Mobarry et al (1996) Nitrosomonas NEU CCCCTCTGCTGCACTCTA Wagner et al. (1995) Nitrosospira spp NSV443 CCTGTGCTCCATGCTCCG Mobarry et al (1996)
24
Introducción
Sondas utilizadas para identificar géneros del phylum Nitrospira Nitrospira spp Ntspa662 GGAATTCCGCGCTCCTCT Competidora CNtspa662 GGAATTCCGCTCTCCTCT Nitrospira spp NSR1156 CCCGTTCTCCTGGGCAGT Sondas utilizadas para identificar especies del género Nitrosomonas N. europaea NSE1472 ACCCCAGTCATGACCCC N. halófilos NEU23a CCCCTCTGCTGCACTCTA N. mobilis NmV TCCTCAGAGACTACGCGG
Daims et al. (2001) Daims et al. (2001) Schramm et al (1998 Juretschko (1998) Wagner et al (1996) Demaneche (2008)
1.10.2Organismos responsables de la desnitrificación y sondas FISH 1.10.2utilizadas para su identificación. identificación. La mayoría de las bacterias capaces de reducir el nitrato utilizándolo como aceptor de electrones son heterótrofas facultativas. También existen algunas bacterias autótrofas capaces de realizar la desnitrificación. Los géneros más comunes capaces de realizar el proceso de desnitrificación son: Pseudomonas, Bacillus,
Spirillum, Hyhomicrobium, Acinetobacter, Propionobacterium, Corynebacterium, Cytophaga, Thiobacillus y Alcaligenes. Los géneros más abundantes son Pseudomonas (P.fluorescens, P. aeruginosa, P.denitrificans) y Alcaligenes siendo frecuentemente encontrados en aguas residuales (Bitton, 1999). Las sondas más utilizadas para la identificación de las bacterias responsables de la desnitrificación son las siguientes: Tabla 5- Sondas FISH bacterias desnitrificantes
Sonda
Secuencia (5´(5´-3´)
Especificidad
Sondas utilizadas para identificar Desnitrificantes RRP1088 GACTTGCATGCCTAATCC
25
Rhodobacter, Rhodovulum, Roseobacter, Paracoccus
Referencia Kim et al (2004)
Introducción
1.111.11- Respirometría La respirometría es una herramienta ampliamente utilizada caracterización del proceso de degradación aeróbica de un agua residual.
para
la
La respirometría es la medición e interpretación de la velocidad de consumo de oxígeno por parte de los microorganismos (biomasa) en estudio bajo condiciones definidas y controladas. Las medidas respirométricas están basadas en la determinación de los cambios que se producen en la velocidad de respiración de los microorganismos presentes cuando son expuestos a un pulso de sustrato. La velocidad total de respiración de los microorganismos, puede ser dividida en una velocidad de respiración endógena y una exógena. Cuando no hay ningún tipo de sustrato oxidable, los microorganismos oxidan su propia biomasa con el objeto de generar energía para las funciones de mantenimiento celular. Al agregar un sustrato determinado, los microorganismos lo oxidan observándose un aumento en la velocidad de consumo de oxígeno. Debido a que la respirometría es una técnica rápida y poco costosa, ha sido aplicada en diferentes campos como por ejemplo, en la determinación de parámetros cinéticos y estequiométricos que caracterizan la biodegradación aeróbica de los compuestos de carbono, nitrógeno y en el estudio de la toxicidad de aguas residuales (Vanrolleghem et al. 1994).
1.11.11.11.1-
Análisis de los diferentes tipos de respirómetros.
Un respirómetro se define como un reactor biológico destinado a la medida de velocidades de consumo de oxígeno. El parámetro más usado para cuantificar esta velocidad es la OUR (Oxygen Uptake Rate), que se define como la cantidad de oxígeno consumida por litro de reactor y por unidad de tiempo. Existen muchos tipos de respirómetros de complejidad y funcionamiento muy diverso. Los respirómetros más utilizados se describen a continuación: Respirómetro Continuo En un respirómetro continuo el aire circula de manera continua en el recipiente donde se lleva a cabo la determinación. Se mide el caudal y concentración de oxígeno en el aire de entrada y a la salida de forma permanente, para así poder determinar por diferencia el consumo instantáneo de oxígeno. A partir de la curva de consumos instantáneos de oxígeno frente al tiempo se podrán obtener por derivación las velocidades instantáneas de consumo de oxígeno.
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Introducción
Respirómetro Discontinuo (Batch) En un respirómetro discontinuo el aporte de oxígeno depende de dos valores de consigna, un máximo y un mínimo de concentración de oxígeno dentro del recipiente donde se lleva a cabo la respirometría. Se inyecta aire hasta alcanzar el valor máximo de concentración de oxígeno establecido. Una vez alcanzado se deja de inyectar oxígeno y se espera a que los microorganismos lo consuman, hasta llegar a la consigna mínima. Se mide el tiempo que emplean los microorganismos en consumir el oxígeno, con el que se obtiene la velocidad instantánea de consumo de oxígeno. Respirómetro manométrico o de Warburg En un respirómetro manométrico el oxígeno utilizado se mide con respecto al tiempo, anotando la disminución de presión en el recipiente donde se está realizando la respirometría, que tiene volumen constante, es hermético y se ha de mantener a una temperatura constante. En el recipiente se introduce la muestra a analizar dejando una cámara de aire y, además, se ha de colocar un vaso con una solución de hidróxido potásico para que absorba el anhídrido carbónico producido, de tal forma que la disminución de la presión sea una medida de la concentración de oxígeno consumido. Respirómetro Volumétrico De forma análoga al respirómetro de Warburg, el oxígeno consumido se mide en función de la disminución del volumen que se produzca en el recipiente adecuado que mantenga la presión y la temperatura constantes. Respirómetro electrolítico El respirómetro electrolítico está formado por un recipiente dotado en su interior de un absorbedor de CO2 (recipiente con sosa), una célula electrolítica y un manómetro. A medida que los microorganismos consumen el oxígeno para la oxidación de la materia orgánica, se produce una disminución de presión en el sistema, que es registrada por el manómetro. Éste, a su vez, a través de un sistema de control, activará la célula electrolítica en función de dicha disminución de presión, tratando así de mantener la presión constante. La cantidad de oxígeno liberado en la electrolisis es proporcional a la cantidad de energía eléctrica que ha sido necesaria suministrar. Registrando esta energía se puede inferir directamente el consumo de oxígeno.
27
Introducción
1.121.12- Software de simulación de EDAR: DESASS DESASS (Design and Simulation of Activated Sludge Systems) es un software específico de simulación y diseño de EDAR que tiene implementado una ampliación del modelo de eliminación biológica de nutrientes nº 1 (Biological Nutrient Removal Model, Nº 1, BNRM1. Seco et al., 2004). Se trata de un simulador de estaciones depuradoras configurado bajo windows, diseñado y optimizado para la investigación de procesos de tratamiento de aguas residuales y la evaluación de sistemas de tratamiento existentes. Es un programa que permite evaluar esquemas completos de tratamiento de aguas residuales, tanto en la línea de agua como en la de fangos. Incluye además la posibilidad de considerar los procesos biológicos que tienen lugar en los decantadores y espesadores junto con los procesos de sedimentación y compresión del fango. Además, este software posee muchas herramientas que permiten realizar simulaciones utilizando muchas condiciones de operación, y controlar el impacto de las diferentes condiciones en el proceso de depuración. Así como, la comparación de diferentes alternativas como se verá más adelante.
1.12.11.12.1-
Características del software
Entre sus principales características se puede destacar su capacidad para simular una gran variedad de configuraciones de plantas permitiendo fijar los volúmenes, los caudales y las diferentes cargas contaminantes. Asimismo, permite la simulación dinámica de variaciones de cargas diarias y estacionales, y permite la introducción de las condiciones iniciales de los elementos en régimen transitorio. Permite comparar de manera sencilla los resultados para condiciones de verano e invierno, en régimen estacionario. Por otro lado, permite simular los procesos de sedimentación en los decantadores y espesadores, además de los procesos biológicos que se pueden producir en ellos. Además, permite diseñar los sistemas de aireación, mediante la introducción de tres tipos de maquinarias: difusores, turbinas y venturi. Incluyendo un programa auxiliar para la actualización de la base de datos de la maquinaria utilizada en dicho sistema. Para una fácil interpretación de los resultados obtenidos, permite representar gráficamente tanto en régimen estacionario como en régimen transitorio, así como la evolución de las variables del modelo en cada elemento.
28
Introducción
1.12.21.12.2-
Modelos utilizados
El modelo biológico utilizado considera componentes y procesos que incluyen los procesos biológicos de eliminación de materia orgánica, nitrógeno y fósforo del agua residual, junto con los procesos de hidrólisis, fermentación y digestión de los fangos. El modelo también incluye los procesos de precipitación y de intercambio de gases con la atmósfera. El programa permite representar las situaciones de pH extremas que se suelen producir en los fermentadores y digestores aerobios, utilizando una metodología sistemática para el cálculo del pH en los distintos elementos de un esquema de tratamiento. Además tiene implementado un modelo de sedimentación con el objeto de representar los procesos de sedimentación y espesado del fango que tiene en cuenta el proceso de compactación que se produce en el fondo de los decantadores y espesadores. El modelo del decantador incluye las zonas de clarificación, sedimentación y compresión del fango, de forma que se pueden obtener no sólo las concentraciones de sólidos en el efluente y en la recirculación de fangos, sino también el perfil de concentraciones, mediante la división del decantador en capas horizontales. De esta manera, es posible conocer la posición del manto de fangos en cada momento y la capacidad de almacenamiento de fangos del decantador. La inclusión de este modelo en DESASS permite la simulación de los procesos de desnitrificación que con frecuencia tienen lugar en los decantadores secundarios. 1.12.31.12.3-
Aplicaciones
El programa DESASS se ha desarrollado de modo que se permite el cálculo tanto de las condiciones estacionarias, es decir, el diseño, como de condiciones transitorias, es decir la simulación. Por lo que respecta al diseño, DESASS permite el cálculo del estado estacionario para las condiciones de invierno y de verano simultáneamente, ofreciendo así una fácil comparación entre cada una de las estaciones. En régimen estacionario el programa desarrolla una solución basándose en las condiciones medias establecidas en planta, tales como la calidad del agua de entrada, los caudales de recirculación interna y de lodos, y las dimensiones de la planta. En cuanto a la simulación, el programa es capaz de simular la evolución de la planta teniendo en cuenta la variación diaria en la entrada. También se puede realizar una simulación con entrada constante para ver cómo evoluciona el sistema frente a alguna modificación en las condiciones de operación. Además, se puede simular la variación temporal de los caudales de recirculación y de purga del fango de los decantadores. 29
Introducción
Algunas posibilidades de optimización en sistemas de fangos activados en funcionamiento son la disminución de la concentración de oxígeno en el reactor biológico y de la recirculación interna en periodos de baja carga para evitar una excesiva concentración de nitratos en el tanque anóxico. Así como, el establecimiento de los valores de purga y de recirculación adecuados para mantener la concentración deseada de sólidos suspendidos en el reactor biológico.
30
Objetivo
2- OBJETIVO
Objetivo
32
Objetivo
2- OBJETIVO La mayor exigencia en el tratamiento de aguas residuales tanto urbanas como industriales, junto con el ahorro energético, suponen dos de los retos más importantes que actualmente tienen lugar en las EDAR, es por ello que la investigación se ha dirigido en estos últimos años a nuevos procesos de tratamiento que aumenten la capacidad de los sistemas de fangos activos sin olvidar la optimización energética. El presente proyecto se sitúa en el problema de la eliminación biológica de nitrógeno, y de cómo esta puede llevarse a cabo en plantas que no hayan sido diseñadas para ello (sin zona anóxica y/o sin recirculación interna). En este proyecto se pretende operar una planta piloto a escala de laboratorio mediante aireación intermitente para alcanzar concentraciones de nitrógeno admisibles por la legislación con un consumo energético mínimo, es decir, trabajando con un tiempo de retención celular (TRC) aerobio bajo y concentraciones de oxígeno disuelto bajas. Para llevar a cabo dicho objetivo se ha operado la planta piloto con ciclos de aireación intermitente controlados por tiempo, y consigna de oxígeno comandada por un controlador. La utilización de técnicas microscópicas como la hibridación de fluorescencia in situ (FISH) va a suponer una herramienta muy potente a la hora de realizar un estudio más exhaustivo de este proceso y por tanto tener un conocimiento más amplio sobre el comportamiento de estos sistemas, mediante la identificación y cuantificación de bacterias nitrificantes en el sistema. La simulación del proceso con la ayuda del software DESASS, en base a la composición del agua influente y los resultados analíticos del efluente permitirá obtener los valores de los parámetros de las bacterias con vistas a una posible optimización del proceso. Así pues con el fin de llevar a cabo el estudio y desarrollo del objetivo principal de este proyecto, se plantean una serie de objetivos específicos: - Puesta a punto de la planta piloto. - Caracterización del agua influente, efluente y licor mezcla de la planta piloto. - Identificación de poblaciones bacterianas del licor mezcla responsables de la eliminación biológica de nitrógeno, mediante la técnica de hibridación in situ (FISH)
33
Objetivo
- Simulación de la planta piloto en DESASS, ajustando los parámetros del modelo para reproducir los resultados analíticos obtenidos en laboratorio. - Utilización de técnicas respirométricas como herramienta complementaria, para apoyar los resultados analíticos y microscópicos, haciendo especial hincapié en los parámetros referidos a la biomasa autótrofa. - Realización de un análisis exhaustivo de los resultados que permita extraer las conclusiones pertinentes en este proceso y así profundizar en el conocimiento de los sistemas de eliminación biológica de nitrógeno.
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Materiales y Métodos
3- MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
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Materiales y Métodos
3- MATERIALES Y MÉTODOS 3.13.1- Descripción de la planta piloto La planta piloto consiste en un sistema de fangos activados, en el que diferenciamos las siguientes partes (Figura 12): -
Depósito de agua de entrada Equipo planta piloto de bombas peristálticas Reactor biológico Agitador mecánico Controlador y sondas de medida Decantador secundario Depósito de agua de salida
Depósito de agua de entrada: Se trata de un tanque de alimentación de agua influente con una capacidad para 50 litros. El agua residual utilizada es sintética porque facilita el control del proceso, ya que no tienen lugar variaciones inesperadas en la composición y concentración, y evita otros posibles problemas como inhibiciones. El depósito se encuentra aislado de la luz solar para evitar la proliferación de algas. La composición del agua residual sintética de entrada (Tabla 6) se prepara tres veces por semana. Tabla 6- Composición agua residual sintética
AGUA RESIDUAL SINTÉTICA Compuesto Concentración (mg/l) mg/l) CH3COONa 250 NH4Cl 150 Na2HPO4•12H2O 37,5 K2PO4 12,5 KCl 8,74 CaCl2•2H2O 8,74 MgSO4•7H2O 7,3 FeSO4•7H2O 1,26 ZnCl2 0,2 CoCl2 0,2 Equipo planta piloto bombas peristálticas: Se trata del equipo piloto “Bio Kontroll mark 2” (Figura 13), el cual consta de dos bombas peristálticas con posibilidad de funcionar en continuo, o bien, alternando ciclos de operación y espera regulables en diez velocidades cada uno de ellos.
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Materiales y Métodos
Este equipo bombea con la bomba A, desde el depósito de agua de entrada hasta el reactor biológico, y con la bomba B, la recirculación de fangos externa del decantador secundario al reactor biológico.
Figura 1212- Foto Planta Piloto
Reactor biológico: El reactor biológico es un tanque de metacrilato de 40 litros de capacidad el cual, tiene dos entradas de agua por la parte inferior, para la introducción del agua influente y la recirculación, y cuatro salidas a diferentes alturas correspondiendo con 18 litros de volumen la salida utilizada y utilizando el resto de salidas superiores como reboses de seguridad. La aireación del reactor es llevada a cabo por cuatro difusores de pecera, formando ángulos entre sí de 90º en el fondo del reactor. El bombeo de aire se lleva a cabo a través de un aireador de pecera. Agitador mecánico: El reactor biológico posee también una agitación mecánica a través de una pala que gira a través de un taladro mecánico con velocidades regulables. Controlador y sondas de medida: La instrumentación utilizada parte de un controlador SC200 (Hach Lange) que controla las dos sondas instaladas en el reactor biológico, una de pH y otra de oxígeno. Esta última se encuentra conectada por relé al aireador de pecera para controlar la consigna de oxígeno fijada. El registro de datos de pH, temperatura y oxígeno se almacena cada minuto, obteniendo el valor medio alcanzado en dicho tiempo de cada medida.
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Materiales y Métodos
Además el aireador y la agitación mecánica se encuentran conectados a un reloj temporizador que marca los ciclos de aireación intermitente. Decantador secundario: El agua de salida del reactor fluye por gravedad al decantador secundario de metacrilato con una capacidad de volumen de 5 litros. Dicho decantador tiene forma troncocónica y es estático. Posee dos salidas una inferior para la recirculación de fangos al reactor biológico, a través de la bomba B y otra superior para el agua efluente a través de un deflector. Depósito de agua de salida: Recoge el efluente del decantador secundario que fluye por gravedad a este depósito. Se trata de un tanque de almacenamiento de agua con una capacidad para 50 litros, que permite tener una muestra de salida integrada.
3.23.2- Antecedentes: Prediseño, montaje y puesta en marcha de la planta piloto. En un primer momento antes de comenzar la realización del proyecto, se llevó a cabo un prediseño del reactor biológico y sus parámetros operacionales mediante una plantilla Excel, con el objetivo de obtener los parámetros cinéticos resultantes, así como la calidad del agua de salida. Los parámetros de diseño empleados fueron los siguientes: Tabla 7- Parámetros de diseño iniciales
Q entrada Volumen reactor TRC SS DQO entrada DQO salida
40 l/d 25 l 9 días 2500 mg/l 300 mg/l 25 mg/l
También estos parámetros sirvieron para el diseño del reactor biológico de metacrilato, el cual, todavía estaba pendiente de construir. Así pues, se diseñó el reactor de metacrilato en función de los volúmenes y caudales previstos, de forma que este volumen coincidiera con una de las salidas, disponiendo también de otras salidas a distintos volúmenes de trabajo, tanto superiores como inferiores por si fuera necesaria su utilización.
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Materiales y Métodos
Se trabajó con el equipo piloto de bombas peristálticas “Bio Kontroll mark 2” para llevar a cabo la calibración de los caudales de ambas bombas, ya que el funcionamiento semicontinuo de este equipo presenta 10 posiciones de operación y 10 posiciones de espera, por lo que cada bomba cuenta con 100 posibles caudales. Se calibraron un 40% de los caudales de cada bomba, para tener un amplio margen de posibilidades en los caudales de entrada y recirculación (Figura 13).
Figura 1313- Foto equipo de bombeo planta piloto
Una vez construida y probada la planta piloto, la puesta en marcha se llevó a cabo utilizando como influente agua decantada de la EDAR Quart-Benàger y llenando el reactor biológico con licor mezcla de dicha EDAR. Posteriormente se cambió el agua influente de la planta piloto por un agua residual sintética para evitar problemas de choques de carga, inhibiciones y, para tener una entrada de agua homogénea. En un principio la aireación se mantuvo continua sin ninguna consigna de oxígeno, para favorecer el crecimiento de las bacterias autótrofas. Para ir adaptando el fango activo a la aireación intermitente se introdujeron paulatinamente los ciclos de marcha y paro. Comenzando por 15 min/15 min, hasta llegar progresivamente al ciclo de oxigenación intermitente elegido para este estudio que fue de 15 min marcha/75 min paro. Uno de los problemas observados durante la puesta en marcha de la planta piloto fue el levantamiento y estancamiento del fango en el decantador secundario. La planta piloto operaba con aireación continua, por lo que en el reactor se llevaba cabo la nitrificación y el licor mezcla rico en nitratos llegaba al decantador secundario, en este, tenía lugar el proceso de desnitrificación causando el levantamiento del fango. Además el decantador secundario es estático y tiene un deflector para el paso del efluente produciendo un estancamiento del fango. Este problema se solucionó con la implantación de los ciclos de marcha y paro, que redujeron la concentración de nitratos considerablemente, con lo que se evitaron problemas de levantamiento del fango por desnitrificación en el decantador secundario.
40
Materiales y Métodos
3.33.3- Condiciones de operación En el transcurso de la puesta en marcha de la planta piloto, se fijaron los parámetros con los que se iba a trabajar a lo largo del estudio. La temperatura de la planta se mantuvo en 25ºC, gracias a la climatización del laboratorio. El caudal de entrada se fijó en 20 l/d con agua residual sintética (cuya composición se muestra en la Tabla 6), con lo que el tiempo de retención hidráulico (TRH) es: TRH = Volumen reactor / Caudal entrada = 18 l / 20 l/d = 0,9 d-1 Al disponer de un único reactor biológico, como sucede en muchas plantas de tratamiento, resulta potencialmente interesante la implantación de ciclos de aireación intermitente con el objetivo de poder llevar a cabo la eliminación de nitrógeno mediante el sistema nitrificación/desnitrificación. Para ello el reactor biológico aerobio tiene que trabajar con ciclos de aireación intermitente convirtiéndose en los ciclos de parada en un reactor anóxico. La aireación intermitente se reguló por tiempo con ciclos alternados de 15 minutos de aireación y 75 minutos de paro. Además durante el periodo de marcha se dispone de agitación mediante pala mecánica a una velocidad de 20 giros/minuto. Durante el periodo anóxico se detuvo la agitación simulando el funcionamiento de una planta industrial durante la parada de las soplantes. El tiempo de retención (TRC) se fijó en 18 días, por lo que el tiempo de retención aerobio (TRCaerobio) con el que se ha operado es de 3 días. Para mantener este TRC se purgaba diariamente 1l de licor mezcla del reactor. TRCaerobio = 15 min/90 min * 18 d = 3 días Junto a este tiempo de retención celular tan bajo, se llevó a cabo el control de oxígeno con una consigna de 1 ppm comandada por el controlador SC200 para conseguir unas condiciones de trabajo límites para llevar a cabo la eliminación biológica de nitrógeno y que permitan a su vez un significante ahorro energético. Además mediante estas condiciones límite se pretendía estudiar la posibilidad de llevar a cabo la eliminación biológica de nitrógeno vía nitrito, dando lugar a un lavado de las bacterias nitritoxidantes. Por último se muestra un cuadro resumen con las condiciones de operación de la planta piloto (Tabla 8).
41
Materiales y Métodos
Tabla 8- Condiciones de operación de la planta piloto
PARÁMETROS OPERACIONALES Q entrada Q salida Q recirculación Temperatura TRH TRC Q purga Consigna de oxígeno Ciclos de aireación y agitación mecánica
Valores y Unidades 20 l/d 20 l/d 64 l/d 25 ºC 0,9 d-1 ≈ 18 días ≈ 1 l/d 1 ± 0,2 mg/l 15 min marcha / 75min paro
3.43.4- Fases del estudio − Fase de crecimiento de la biomasa autótrofa En el inicio de la puesta en marcha de la planta piloto la aireación se mantuvo continua sin ninguna consigna de oxígeno, para favorecer el crecimiento de las bacterias autótrofas. − Fase de adaptación a la aireación intermitente Para ir adaptando el licor mezcla a la aireación intermitente se introdujeron paulatinamente los ciclos de marcha y paro, así como la consigna de oxígeno. Comenzando por 15 min/15min, hasta llegar progresivamente al ciclo de oxigenación intermitente utilizado durante este estudio que fue de 15min marcha/75 min paro, ya que después de probar varias combinaciones de intermitencia, estas condiciones de trabajo permitían llevar a cabo simultáneamente la eliminación biológica de nitrógeno en valores admisibles, y un significante ahorro energético. Para esta fase fue importante el control y monitorización del pH y oxígeno mediante las sondas presentes en el reactor, así como los resultados analíticos obtenidos para elegir correctamente el ciclo de intermitencia ideal. − Fase de desarrollo del estudio: Aireación Intermitente Durante esta fase se realizan ensayos físico-químicos (DQO, NH4+, NO3-, NO2-, NT, PO43-, PT, SS, SSV) para obtener resultados del estado de eliminación biológica de nitrógeno, fosfóro y materia orgánica, y conocer si el sistema se encuentra en buenas condiciones. A su vez se identifican y cuantifican las bacterias amonioxidantes (AOB) y nitritoxidantes (NOB) mediante técnicas microscópicas moleculares, para ver si existe una población nitrificante en el sistema que permita llevar a cabo la eliminación biólogica de nitrógeno.
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Materiales y Métodos
Se realizan observaciones microscópicas del licor mezcla para realizar una bioindicación del fango activo y tinciones simples para la identificación de organismos acumuladores de polifosfatos. Se determinan parámetros cinéticos de la biomasa autótrofa y heterótrofa, para ver el estado de la biomasa mediante ensayos respirométricos. Durante esta fase también tiene lugar la simulación de la planta piloto, ajustando los parámetros cinéticos para reproducir los resultados experimentales obtenidos. − Fase de análisis de datos Esta fase está presente durante las tres fases anteriores del proyecto, para ir adaptando y analizando los resultados del proceso. Finalmente se estudian todos los resultados obtenidos y simulados, con el objetivo de obtener las conclusiones pertinentes.
3.53.5- Método de identificación y cuantificación de las poblaciones bacterianas 3.5.13.5.1-
Condiciones de hibridación
Las condiciones de hibridación son un factor muy importante a tener en cuenta a la hora de realizar la hibridación. El efecto de la temperatura, así como el medio iónico en el que se encuentra el ADN o el ARN, permite la separación de las cadenas o regiones bicatenarias, en el caso del ADN, o en una sola cadena monocatenaria en el caso del ARN. Las condiciones de fusión y la renaturalización de los ácidos nucleicos se ven influenciadas básicamente por cuatro factores: - Temperatura: En condiciones normales, la temperatura de fusión del ADN es bastante alta, superior a 70 ºC, dependiendo de la secuencia primaria del ADN. Sin embargo, la técnica FISH requiere temperaturas de hibridación menores para evitar el estrés térmico y mantener así la integridad de las células. - pH: Para realizar las pruebas de hibridación se suele emplear un pH próximo a la neutralidad, sin embargo se puede utilizar un pH elevado para obtener condiciones de elevada restricción. Este último término se refiere a la homología que existe entre el oligonucleótido o sonda que se utiliza en la técnica FISH y la secuencia de ARN a la cual va dirigida esa sonda. Cuanto mayor sea el grado de restricción mayor será la homología entre la sonda y la secuencia “diana”, y por lo tanto mayor grado de unión entre el híbrido ADN-ARN.
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Materiales y Métodos
- Concentración de los cationes del medio: Estos cationes interactúan electrostáticamente con los ácidos nucleicos, de forma que cuanta más alta es la concentración, más estable es el híbrido. En la técnica FISH se utiliza el EDTA para complejar los cationes divalentes como el Ca2+. - Presencia de solventes orgánicos: La desnaturalización de los ácidos nucleicos se produce entre los 80 y los 100 ºC. A esta temperatura de hibridación las muestras biológicas se deteriorarían. Los disolventes orgánicos reducen la estabilidad térmica de los ácidos nucleicos de doble cadena, pudiéndose llevar a cabo la hibridación a temperaturas más bajas. Normalmente se emplea formamida. 3.5.23.5.2-
Hibridación de las muestras
Los pasos a seguir son los siguientes: - Aplicación de las muestras a los portaobjetos FISH 1- Poner un volumen de 3 μl de muestra fijada en el portaobjetos. 2- Secar al aire. 3- Deshidratar en EtOH al 50% durante 3min (por inmersión). 4- Deshidratar en EtOH al 80% durante 3min (por inmersión). 5- Deshidratar en EtOH al 98% durante 3min (por inmersión). - Hibridación in situ 1- Preparar la solución de hibridación con formamida (Tabla 9) en un eppendorf de 2ml. 2- De la solución de hibridación con formamida, reservar en un eppendorf 6 x (10−n) μl, siendo n el volumen de sonda utilizada en cada pocillo. 3- Añadir al eppendorf reservado 6 μl de sonda (6 pocillos por porta = 6 μl de sonda) 4- Poner un trozo de papel de celulosa dentro de un tubo Sarstedt de 50ml y echar sobre el papel la solución de hibridación sin sonda. 5- Poner 9 μl de la solución de hibridación más 1 μl de sonda en cada pocillo y repartir homogéneamente por todo el campo. 6- Introducir el porta dentro del tubo Sarstedt, manteniendo siempre la posición horizontal. 7- Incubar a 46 ºC durante hora y media. 8- Preparar 50 ml de la solución de lavado (Tabla 10), y atemperar a 48 ºC. 9- Sacar del horno y rápidamente lavar los portas e introducirlos dentro del tubo con la solución de lavado. 10- Incubar en un baño a 48 ºC durante 15 − 20min. 11- Lavar con agua destilada. 12- Secar al aire en la oscuridad. 13- Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a −20 ºC dentro de un tubo Sarstedt de 50 ml. 44
Materiales y Métodos
Tabla 9- Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación preparación de la solución tampón de hibridación en la técnica técnica FISH
Tabla 1010- Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución tampón de lavado en la técnica FISH
Las sondas utilizadas en este trabajo son las que se muestran en la Tabla 11, donde se incluye el nombre de la sonda, la secuencia de nucleótidos y la referencia donde ha sido descrita la sonda.
Tabla 1111- Sondas FISH de bacterias nitrificantes utilizadas para la identificación y cuantificación
Sonda
Secuencia (5´(5´-3´)
Especificidad
Referencia
Sondas utilizadas para identificar phyllum y clases del Dominio Bacteria Bacteria EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Amann (1990) Planctomycetes EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Daims et al. (1999) Verrumicrobiales EUB 338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Daims et al. (1999) Sondas utilizadas para identificar subclases de la clase Proteobacteria β-Proteobacteria NSO1225 (*) CGCCATTGTATTACGTGTGA Alonso et al (2009) Sondas utilizadas para identificar géneros de α-Proteobacteria Nitrobacter spp NIT3 CCTGTGCTCCATGCTCCG Wagner et al (1996) Competidora CNIT3 CCTGTGCTCCAGGCTCCG Wagner et al. (1996) Sondas utilizadas para identificar géneros del phylum Nitrospira Nitrospira spp Ntspa662 GGAATTCCGCGCTCCTCT Daims et al. (2001)
45
Materiales y Métodos
3.5.33.5.3-
Cuantificación de las poblaciones bacterianas
La técnica FISH además de ser empleada para la identificación de los grupos de bacterias, también permite obtener datos cuantitativos de las poblaciones microbianas presentes en el fango mediante un software desarrollado en la Tesis Doctoral de Borras (2008). Los pasos a seguir a partir de la hibridación de las muestras con las sondas pertinentes son los siguientes: - Observación en el microscopio y toma de imágenes: Una vez realizada la hibridación, los portaobjetos deben ser examinados bajo un microscopio de epifluorescencia o un microscopio con focal láser, con los filtros adecuados según los fluorocromos utilizados. Mediante una cámara digital acoplada al microscopio se toman imágenes de entre 20 y 40 campos representativos de la muestra hibridada. Las imágenes son captadas en color debido al uso de los fluorocromos de la técnica FISH, y por lo general la intensidad no es muy alta. Así que es importante tomar las imágenes con un tiempo de exposición elevado de manera que la intensidad de las mismas sea lo más alta posible, sin llegar a saturar las áreas de interés de la imagen, lo que provocaría la pérdida de la información de intensidad de la señal. - Cuantificación de los datos mediante software: El procesado y análisis de las imágenes tomadas se realiza con un software desarrollado en MATLAB, que permite el tratamiento de las imágenes no sólo basándose en la apariencia de las imágenes, sino en la información numérica que en ella contiene: la información de cada píxel individual. Las imágenes son introducidas en este software de cuantificación, y el resultado es un informe detallado de los porcentajes de áreas ocupadas por las bacterias presentes en la muestra hibridada. - Análisis de los resultados: El informe debe ser revisado cuidadosamente con el fin de detectar posibles resultados erróneos o estadísticamente incoherentes. El resultado final es un número que representa el porcentaje en área de una especie bacteriana en la muestra, acompañado de su desviación estándar.
46
Materiales y Métodos
3.63.6- Tinciones para la detección de bacterias PAO 3.6.13.6.1-
Tinción de polipoli-fosfatos (Azul de metileno)
La tinción con Azul de Metileno para la visualización de poli-fosfatos se llevó a cabo mediante el método descrito por Seviour y Blackall (1999). Reactivos A. Solución 1 (solución de Loeffler): - 0,3 g de azul de metileno - 100 ml de etanol 60% B. Solución 2 - 10 mg hidróxido potásico - 100ml de agua destilada Mezclar las soluciones 1 y 2 en partes iguales. Procedimiento -
Poner unos 20 µl de muestra (1 gota aproximadamente) en un porta, y extenderla sobre una superficie aproximada a la del cubre. Se deja secar al aire el mínimo tiempo posible. Aplicar la mezcla de las soluciones 1 y 2 durante 10-30 segundos. Lavar con abundante agua destilada. Secar el porta y examinar con aceite de inmersión, en campo claro y a 1000x aumentos.
Resultados Inclusiones de poli-fosfatos: Puntos color Rosa brillante-Violeta. Citoplasma: ligeramente azulado.
47
Materiales y Métodos
3.6.23.6.2-
Tinción de PHB (Sudan Black)
La tinción con Sudan Black se utiliza para la visualización de lípidos en la muestra, entre ellos el PHA (Gerhardt, 1981). Reactivos A. Solución 1 - 0,3 g de Sudan Black B (IV) - 100 ml de etanol al 60% B. Solución 2 - 0,5 g de safranina O - 100 ml de agua destilada Procedimiento -
Poner unos 20 µl de muestra (1 gota aproximadamente) en un porta, y extenderla sobre una superficie aproximada a la del cubre. Se deja secar al aire durante aproximadamente 30 minutos. Aplicar la solución 1 durante 10 minutos y añadir más solución si se seca el porta. Lavar durante 1 segundo con agua. Aplicar durante 10 segundos la solución 2. Lavar con abundante agua. Secar el porta y examinar con aceite de inmersión, en campo claro y a 1000x aumentos.
Resultados Gránulos de PHB: puntos intracelulares de color Negro-Azul oscuro. Citoplasma: Rosa claro-sin teñir.
48
Materiales y Métodos
3.73.7- Caracterización química 3.7.13.7.1SSV.
Determinación de la concentración de sólidos en suspensión, SS SST y
La concentración de sólidos suspendidos totales (SST) se determina a partir de la filtración y eliminación de la humedad en estufa a 105ºC durante al menos una hora. El incremento en el peso del filtro representará a los sólidos suspendidos totales. La concentración de los sólidos suspendidos no volátiles (SSNV) se obtiene mediante la calcinación a 550ºC en mufla durante al menos 15 minutos de los sólidos suspendidos totales. Así los sólidos suspendidos volátiles (SSV) se obtienen por diferencia entre los sólidos suspendidos totales, y los sólidos suspendidos no volátiles. 3.7.23.7.2-
Determinación de la Demanda Química de Oxígeno, DQO
Para la determinación de la demanda química de oxígeno (DQO) se han utilizado kits comerciales Hach-Lange, cuyo principio de determinación se basa en que las sustancias oxidables reaccionan con la solución de ácido sulfúrico y dicromato de potasio en presencia del sulfato de plata como catalizador. El cloruro se enmascara con sulfato de mercurio. Es un método colorimétrico que evalúa la coloración verde del Cr3+. Los rangos utilizados pertenecen a los kits LCK314 (Rango 15-150 mg DQO/l), LCK 414 (Rango 5-60 mg DQO/l) y LCK514 (Rango 100-2000 mg DQO/l). 3.7.33.7.3-
Determinación Determinación de Nitrógeno Total, NT.
Para la determinación de nitrógeno total (NT) se han utilizado los kits comerciales Hach-Lange, cuyo principio está basado en que el nitrógeno ligado inorgánica y orgánicamente se oxida a nitrato mediante digestión con peroxidisulfato. Los iones nitrato reaccionan en una solución de ácido sulfúrico y fosfórico con 2,6-dimetilfenol formando un nitrofenol. Los rangos utilizados pertenecen a los kits LCK138 (Rango 1-16 mg N/l), LCK238 (Rango 5-40 mg N/l) y LCK338 (Rango 20-100 mg N/l). 3.7.43.7.4-
Determinación de nitrato, NO3-.
Para la determinación de nitrato (NO3-) se han utilizado los kits comerciales Hach-Lange, cuyo principio se basa en soluciones que contienen ácido sulfúrico y fosfórico en los que los iones nitrato reaccionan con 2,6-dimetilfenol formando 4nitro-2,6-dimetilfenol. El rango utilizado pertenece al kit LCK339 (Rango 0,23-13,50 mg NO3-N/l). 49
Materiales y Métodos
3.7.53.7.5-
Determinación de nitrito, NO2-.
Para la determinación del nitrito (NO2-) se han utilizado los kits comerciales Hach-Lange cuyo principio se basa en que en solución ácida los nitritos reaccionan con aminas aromáticas primarias formando sales de diazonio. Estas forman compuestos aromáticos que contienen un grupo amino o un grupo hidroxilo, colorantes azoicos intensamente coloreados. El rango utilizado pertenece al kit LCK341 (Rango 0,015-0,6 NO2-N/l). 3.7.63.7.6-
Determinación de amonio, NH4+.
Para la determinación de amonio (NH4+) se han utilizado los kits comerciales Hach-Lange cuyo principio se basa en que los iones amonio reaccionan, a un pH 12,6, con iones hipoclorito e iones salicilato, en presencia de nitroprusiato sódico como catalizador, formando azul de indofenol. El rango utilizado pertenece a los kits LCK304 (Rango 0,015-2 mg NH4-N), LCK305 (Rango 1-12 mg NH4-N), LCK303 (Rango 2-47 mg NH4-N).
3.7.73.7.7-
Determinación de fósforo total, PT.
Para la determinación de fósforo total (PT) se han utilizado los kits comerciales Hach-Lange cuyo principio se basa en que los iones fosfato reaccionan en solución ácida con iones molibdato y antimonio formando un complejo antimonilfosfomolibdato que, mediante ácido ascórbico, se reduce a azul de fosfomolibdeno. El rango utilizado pertenece a los kits LCK 349 (Rango 0,05-1,5 mg PO4-P/l), LCK348 (Rango 0,5-5 mg PO4-P/l), LCK350 (Rango 2-20 mg PO4-P/l).
50
Materiales y Métodos
3.83.8- Respirometría 3.8.13.8.1-
Respirómetro BMBM-T
La respirometría es una técnica que mide el consumo de oxígeno de las bacterias contenidas en un fango activo por si mismas (endógena) o en su fase de degradación de un sustrato orgánico (exógena). Este consumo de oxígeno se mide principalmente bajo dos variantes: - Velocidad de consumo de oxígeno (tasa de respiración) - Oxígeno total o parcial consumido en la degradación de un sustrato. La tecnología BM-T combina la respirometría tradicional con una técnica diseñada por Surcis, la cual permite la medida y cálculo de parámetros de control y proceso de depuración por fangos activos, si bien no permite calcular todos los parámetros necesarios para llevar a cabo el diseño de un reactor biológico.
Figura 1414- Respirómetro BMBM-T
El analizador BM-T (Figura 14) consta de un vaso reactor en el que se introduce fango del reactor biológico a estudio, para llevar a cabo los ensayos respirométricos del proceso de depuración. Se trata de un sistema batch provisto de recirculación, en donde existen tres modos de ensayo (Estático OUR, Cíclico OUR y Dinámico R). La bomba de recirculación está provista de tres velocidades y una posición de paro. En el modo estático y cíclico OUR, la recirculación no ejerce influencia en la medida final (batch). En el modo dinámico R la recirculación funciona ininterrumpidamente y por ello el sistema de medida debe calibrarse (batch modificado).
51
Materiales y Métodos
Figura 1515- Esquema respirómetro
En el recinto superior del vaso reactor (Figura 16) se sitúa el difusor de aire proporcionando el nivel de oxígeno adecuado que se transfiere al recinto de medida. Por medio de una placa divisoria, el recinto de medida está protegido de la influencia de posibles burbujas que pudieran producir interferencias en el cabezal del sensor, así como de la aspiración de aire desde la atmósfera por el efecto centrífugo del sistema de agitación. En este recinto, el sensor de oxígeno realiza las medidas instantáneas de oxígeno disuelto resultante de la respiración de los microorganismos a lo largo de los ciclos de medida de cada uno de los modos de ensayo. El vaso reactor además está dotado de una cámara de termostatización que a modo de camisa rodea sus recintos. Por esta cámara circula agua termostatizada procedente de la unidad termostática (Figura 15). El sistema de aireación está dotado de un regulador en porcentaje que permite programar un nivel de oxígeno acorde con el objetivo de la aplicación de respirometría. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que el modo dinámico R debe calibrarse para cada nivel de caudal de oxígeno.
52
Materiales y Métodos
Figura 1616- Elementos vaso reactor del respirómetro
El oxímetro manda las señales de las medidas de oxígeno en curso al ordenador en donde, por medio de un programa específico se procesan para llevar a cabo la generación automática de respirogramas y el cálculo de tasas de respiración, consumo de oxígeno y fracción biodegradable de la DQO. Así mismo, por medio del programa se auto-generan archivos exportables con sus correspondientes respirogramas.
3.8.23.8.2-
Modos de ensayo del respirómetro BMBM-T
Como ya se ha mencionado el BM-T está dotado de tres modos distintos de ensayo: - Modo OUR Estático - Modo OUR Cíclico - Modo R Dinámico El modo utilizado para llevar a cabo los ensayos de este estudio fue el modo R dinámico que se explica a continuación.
53
Materiales y Métodos
Modo R Dinámico En líneas generales, el sistema de medida puede considerarse como un sistema batch con reactor de mezcla completa en donde la aireación y recirculación se mantienen activas durante todo el ensayo. De este modo, en el recinto inferior se crea un oxígeno resultante de las características del conjunto global que el sensor de oxígeno está midiendo de forma continuada. Para el ensayo R se necesita fango activo sin carga orgánica ni amónica (a ser posible fango en fase endógena) y una cantidad determinada de muestra. El ciclo del ensayo R transcurre en dos etapas: 1- En la primera etapa se utiliza solamente fango activo libre de carga. En esta etapa se fija y almacena en la memoria el oxígeno de referencia o línea base “cb”. 2- Una vez determinada la línea base “cb”, el programa nos da la orden para que se añada la muestra a analizar. De este modo el fluido que en un principio era solo fango ahora pasa a estar constituido por fango más muestra (F + M). Tan pronto empieza a reaccionar la muestra añadida con el fango activo el oxígeno inicial empezará a descender “cs” como señal de que se está llevando a cabo una oxidación biológica (salvo que no exista materia biodegradable) y automáticamente empezará a generarse un respirograma con los valores de la tasa de respiración por oxidación del sustrato (Rs: respiración exógena). Así mismo, automáticamente se calcula el oxígeno consumido (OC) a lo largo del tiempo y la fracción biodegradable de la DQO (en caso de que esté calibrado para ello). La ventaja que adquiere el modo R dinámico es que, una vez calibrado, los ensayos pueden llevarse de forma muy rápida con la utilización de pequeñas cantidades de muestra. Para ello, el programa está dotado de un algoritmo de corrección y extrapolación.
3.8.33.8.3-
Parámetros respirométricos determinados
Los ensayos respirométricos mediante el modo dinámico R nos van a permitir obtener los parámetros tanto de la biomasa autótrofa, como heterótrofa que se muestran en la Tabla 12. Los ensayos R en modo dinámico se van a realizar para obtener dos parámetros principales tanto en biomasa autótrofa, como en biomasa heterótrofa. En primer lugar la obtención del rendimiento (Y).
54
Materiales y Métodos
Para determinar el rendimiento (Y) se realizan ensayos con un litro de licor mezcla endógeno al que se añaden diferentes concentraciones de sustrato, cloruro de amonio en el caso de la biomasa autótrofa y acetato de sodio en el caso de la biomasa heterótrofa, ya que es el sustrato que están recibiendo en el agua residual influente. En el ensayo se mide el oxígeno consumido (OC) para degradar las concentraciones de sustrato aportadas (DQODEG) y mediante la fórmula del rendimiento obtenemos el valor de dicho parámetro. Y = 1 – (OC/ DQODEG) En segundo lugar, se va a obtener la tasa máxima de respiración tanto de biomasa autótrofa como heterótrofa. En este ensayo dinámico se introduce también un litro de licor mezcla endógeno y en esta ocasión, se introduce una concentración de sustrato suficiente para conseguir que en ningún momento del ensayo sea el sustrato el factor limitante para conseguir la tasa máxima, el sustrato a añadir es cloruro de amonio en el caso de las biomasa autótrofa y acetato de sodio en el caso de la biomasa heterótrofa, ya que es el sustrato que están recibiendo en el agua residual influente. De esta forma se obtiene la tasa máxima de respiración de cada uno de los tipos de biomasa, que queda determinada por el punto más alto de consumo de oxígeno por parte de la biomasa en el respirograma. Tabla 1212- Parámetros de la biomasa autótrofa y heterótrofa obtenidos mediante respirometría AUTÓTROFAS Tasa máxima de respiración de nitrificantes
Rsmáx auto
mg O2/lh
Tasa máxima de respiración de nitrificantes por SSV
Rspmáx auto
mg O2/g SSVh
RN
mg NH4/lh
AUR
mg NH4/g SSVh
Tasa máxima de consumo de amonio Tasa global específica de consumo de amonio Fracción de nitrificantes
FN
Concentración de la biomasa autótrofa
XA
mg SSVXA /l
Rendimiento de la biomasa autótrofa
YA
mg DQO/mg DQO
Tasa máxima específica de nitrificación
qN
mg NH4/g SSV d
μa,max
d-1
μa
d-1
TRCnitrificación
d-1
Tasa máxima de respiración de heterótrofas
Rsmáx het
mg O2/lh
Tasa máxima de respiración de heterótrofas
Rspmáx het
mg O2/g SSV h
XH
mg DQO/mg DQO
Tasa máxima de crecimiento de la biomasa autótrofa Tasa específica de crecimiento de la biomasa autótrofa Tiempo de retención mínimo para la nitrificación HETERÓTROFAS
Concentración de la biomasa heterótrofa
55
Materiales y Métodos
El resto de parámetros se obtienen a partir de estos parámetros mediante fórmulas bibliográficas (Tabla 13), salvo la fracción de nitrificantes (FN) que se obtiene gracias a la cuantificación realizada de la biomasa nitrificante mediante la técnica FISH. Tabla 1313- Fórmulas y fuentes bibliográficas de la biomasa autótrofa
AUTÓTROFAS
Fuente bibliográfica
Respirometría
Rsmáx auto
mg O2/lh
x
Rspmáx auto = Rsmáx auto/ SSV
Rspmáx auto
mg O2/g SSV h
x
RN = Rsmáx auto/ 4,57
RN
mg NH4/lh
Henze et al. - 2000
AUR = RN/ SSV
AUR
mg NH4/g SSVh
Surcis
FISH
FN
XA = FN * SSV
XA
mg SSVXA/l
W.W. Eckenfelder, J.L. Musterman. 1995
Respirometría
YA
mg DQO/mg DQO
x
qN = (RN * 24 )/ XA
qN
mg NH4/g SSV d
μa,max = YA * qN
μa,max
d-1
μa = μa,max . [SN /(KN + SN)].[DO / (KDO + DO)]
μa
d-1
EPA office. 2000
TRCnitrificación = 1/ μa
TRCnitrificación
d-1
EPA office. 2000
x
56
Adrianus van Haandel et Jeroen van der Lubbe. 2007 Adrianus van Haandel et Jeroen van der Lubbe. 2007
Materiales y Métodos
57
4- RESULTADOS RESULTADOS
Resultados
59
Resultados
4- RESULTADOS 4.14.1- Resultados analíticos y de operación La operación de la planta piloto se llevó a cabo desde el 12 de Junio de 2011 hasta el 30 de Septiembre de 2011. Las analíticas más repetidas a lo largo del estudio fueron las correspondientes a la concentración de amonio, nitrato y nitrito en el efluente de la planta piloto, parámetros importantes para el control de la eliminación de nitrógeno. En la figura 17 se muestran los valores analíticos obtenidos de amonio, nitrato y nitrito a lo largo de la experimentación. Como se puede observar en la figura, la gráfica aparece dividida en dos partes bien diferenciadas por una línea vertical. El tiempo previo a esta línea se corresponde con la puesta en marcha y adecuación de la planta piloto. Durante este tiempo la planta fue operada con aireación continua por lo que el efluente mostró amonio en concentraciones próximas a cero, y nitratos con una alta concentración. A partir de este estado hay una adaptación progresiva a la aireación intermitente hasta los valores fijados, 15 minutos de aireación y 75 de paro, que quedó implementada a partir del día 7 de Julio de 2011. Los valores de amonio y nitrato obtenidos analíticamente en el efluente una vez establecidos los ciclos de marcha paro definitivos oscilan entre 4-6 mg/l. Al final de un ciclo de aireación (en el cual tiene lugar la nitrificación), el amonio tiene baja concentración mientras que el nitrato presenta una concentración alta en el rango de valores mencionado. Lo contrario ocurre justo tras finalizar un ciclo de parada (antes del comienzo del siguiente ciclo de aireación): la concentración de amonio en el reactor se incrementa y la concentración de nitrato disminuye debido al proceso de desnitrificación que ha tenido lugar durante la etapa de anoxia. Las concentraciones reflejadas en la figura 17 se corresponden con muestras integradas durante un día, por lo que las fluctuaciones mencionadas de concentración de amonio y nitrato debidas a los ciclos de aireación intermitente se ven amortiguadas. Así las muestras integradas presentan valores de amonio, nitrato y nitrito más o menos constantes como refleja la figura 17. También cabe destacar que durante todo el estudio el nitrito mantuvo en valores inferiores a 1 mg N-NO2/l, por lo que se deduce que casi todo el nitrito era nitrificado a nitrato por las bacterias nitritoxidantes.
60
Resultados
NH4 sal
Valores de Amonio, Nitrato y Nitrito Efluente
NO3sal NO2 sal
35.00
Concentración (mg/l)
30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 14/06/2011
04/07/2011
24/07/2011
13/08/2011
02/09/2011
22/09/2011
Fecha (dd/mm/aaaa) Figura 1717- Gráfica de determinaciones de amonio, nitrato y nitrito durante el periodo de estudio
La demanda química de oxígeno (DQO), nitrógeno total (NT) y fósforo total (PT) se encuentran regulados por legislación (Directiva 91/271/CEE), la cual fija unos requisitos de vertido para estos parámetros que se han de cumplir en el efluente de una EDAR. -
DQO: El límite admisible en DQO se fija en 125 mg/l o un 70% de eliminación. Los valores del efluente de la planta piloto presentan concentraciones muy por debajo del límite admisible (Tabla 14) y presentan porcentajes de eliminación de DQO superiores al 90% (Figura 18). Los valores demuestran la existencia de una población de bacterias heterótrofas bien desarrollada capaz de eliminar la materia orgánica.
-
Nitrógeno Total: El nitrógeno total es el parámetro más importante a tener en cuenta en este estudio ya que el objetivo de este estudio es conseguir la eliminación biológica de nitrógeno mediante aireación intermitente. El límite admisible por la legislación es de 15 mg/l o un porcentaje de eliminación de 70-80%. Así pues, pese a las condiciones límite de trabajo debidas al bajo TRC aerobio y a la relativamente baja consigna de oxígeno (1ppm) la concentración de nitrógeno total a la salida se encuentra en torno a los 10 mg/l (Tabla 14), lo que nos indica que se está cumpliendo con el objetivo de eliminar nitrógeno ligado a un consumo energético mínimo. 61
Resultados
%elim DQO
% de Eliminación DQO, NT y PT
%elim NT %elim PT
100 90 80 70
% Eliminación
60 50 40 30 20 10 0 28/08/2011
04/09/2011
11/09/2011
18/09/2011
25/09/2011
Fecha (dd/mm/aaaa) Figura 1818- Porcentaje de eliminación de DQO, NT y PT de la planta piloto
-
Fósforo total: En un principio la planta piloto había sido diseñada para la eliminación biológica de materia orgánica y nitrógeno, por lo que la determinación de fósforo se realizó para comprobar que éste, no era un factor limitante en el proceso. Al analizar los resultados del fósforo total y de fosfato, aparece una eliminación de fósforo superior a la esperada, ya que los rendimientos de eliminación se sitúan en torno al 40 % (Figura 18). Estos resultados hacen sospechar que no sólo está actuando la toma de nutrientes por parte de las bacterias heterótrofas y autótrofas para su metabolismo sino que puede existir una población de organismos acumuladores de poli-fosfatos (PAO). La proliferación de bacterias PAO en la planta piloto es posible por la alternancia de condiciones aerobias y anaerobias que favorecen la eliminación de fósforo. La presencia de estos organismos acumuladores de poli-fosfatos se confirmó a través de la observación microscópica mediante tinciones (como se explicará posteriormente en el apartado 4.3.2).
62
Resultados
Desnitrificación
Nitrificación
Figura 1919- Evolución del pH y la concentración de oxígeno en varios ciclos de operación de la planta piloto.
Uno de los resultados interesantes obtenidos es la relación ación de los ciclos de marcha y paro de la oxigenación con el pH. Laa nitrificación consume alcalinidad, lo que podemos observar a través de la caída del pH en los momentos en los que la aireación air se encuentra funcionando. Tras estos periodos, s, cuando ya no se airea y el oxígeno se ha consumido, el licor mezcla se encuentra en anoxia, anoxia, teniendo lugar el proceso de desnitrificación, recuperando la alcalinidad perdida perdida y mostrando una subida de pH. (Figura 19) Trabajando con TRC de 18 días, los sólidos suspendidos volátiles (SSV) se han mantenido alrededor de 1000 mg/l (Figura 20). El porcentaje de volatilidad se encuentra en valores de 73-78 73 78 % si bien el licor mezcla se esperaba que tuviera una volatilidad mayor al recibir un influente sintético sintético con menor cantidad de sólidos no volátiles. Sin embargo, se ha mantenido siempre alrededor de los valores mencionados lo cual podría ser debido a: la formación de sales inorgánicas y precipitados, a la existencia de polifosfatos almacenados intracelularmente intracelularmente por las bacterias PAO y en menor medida por la posible mineralización del fango causada por el elevado tiempo de retención celular.
63
Resultados
SS
Sólidos Suspendidos Volátiles
%V
1400
80
75
%Volátil
SS (mg/l)
1200 70
1000 65
800 31/07/2011
60 10/08/2011
20/08/2011
30/08/2011
09/09/2011
19/09/2011
29/09/2011 Fecha
Figura 2020- Evolución de los sólidos suspendidos volátiles del reactor biológico
Los parámetros físico-químicos determinados durante el tiempo de experimentación nos dan información del estado real de la planta piloto, de su rendimiento de eliminación y de su evolución a lo largo del tiempo. En la Tabla 14 quedan recogidos los resultados analíticos de las caracterizaciones completas realizadas en la planta piloto. Del resto de parámetros determinados no mencionados anteriormente cabe destacar la baja turbidez del efluente marcada por la ausencia de flóculos en suspensión y una buena calidad del clarificado, así como valores de pH superiores a 7,5. Tabla 1414- Tabla resumen resumen caracterizaciones físicofísico-químicas de la planta piloto 30/08/11
09/09/11
16/09/11
23/09/11
27/09/11
pH
7,73
7.74
7.92
7.66
7.71
Conductividad (µS/cm)
1190
1160
1160
1170
1160
Turbidez (NTU)
1,56
1.21
1.90
2.13
2.16
DQOENT (mg DQO/l) DQO/l)
225
225
225
225
225
DQOSAL (mg DQO/l) DQO/l)
12.40
12.00
14.10
16.80
11.60
%elim DQO
94.49
94.67
93.73
92.53
94.84
NTENT (mg N/l)
37.50
37.50
37.50
37.50
37.50
NTSAL (mg N/l)
14.00
11.30
11.00
10.13
10.40
62.67
69.87
70.67
72.99
72.27
(mg NN-NH /l)
3,90
5,58
4,98
4.43
4,52
NO3-SAL (mg N-NO3-/l)
8,10
4,30
3,66
4.23
4,26
NO2-SAL (mg N-NO2-/l)
0,648
0,624
0,664
0.272
0,584
PTENT (mg P/l)
7.50
7.50
7.50
7.50
7.50
PTSAL (mg P/l)
4.90
4.41
4.15
4.68
4.67
34.67
41.20
44.67
37.60
37.73
4,65
4,22
3,83
4.35
4,57
%elim NT 4+SAL
NH
4+
%elim PT 34 SAL
PO
34
(mg P-PO /l)
64
Resultados
4.24.2- Resultados de la identificación y cuantificación de bacterias nitrificantes mediante la técnica FISH. Los resultados con la sonda EUBmix 338 han resultado positivos al hibridar un porcentaje muy alto de las células del flóculo y filamentosas (Figura 21B, 22B, 24B y 25B). Esto indicó que el área teñida con la sonda EUBmix 338 perteneciente al dominio Eubacteria representa un porcentaje muy alto sobre el total de bacterias presentes en la muestra.
4.2.14.2.1-
Bacterias amonioxidantes (AOB)
Con la técnica de hibridación in situ con sondas marcadas con fluorocromos (FISH) se han identificado comunidades bacterianas oxidantes de amonio a nitrito (amonioxidantes) muy desarrolladas, con las típicas formaciones de agregados celulares densos con forma esférica (Figura 21A y 22A). -
Sonda Nso1225: Amonioxidantes de la clase β-proteobacteria (Nitrosomonas)
En las figuras 21A y 22A se visualizó la hibridación de bacterias amonioxidantes de la clase β-proteobacteria del género Nitrosomonas (color rojo) mediante la sonda de hibridación Nso1225, mientras que las figuras 21B y 22B muestran una imagen del mismo campo en la que se utilizó la sonda EUBmix 338 para detectar bacterias pertenecientes al dominio Eubacteria (color verde).
Figura 2121- Fotos con las sondas Nso1225 amonioxidantes de la clase β-proteobacteria 600x (Figura 21A) y EUBmix 338 (Figura 21B) 21B)
65
Resultados
Figura 2222- Fotos con las sondas Nso1225 amonioxidantes de la clase β-proteobacteria 600x (Figura 22A) y EUBmix 338 (Figura 22B) 22B)
Los resultados del análisis de imagen con las sondas Nso1225 (color rojo) y EUBmix 338 (color verde) muestran un porcentaje de hibridación de 4%±0.6 de bacterias amonioxidantes de la clase β-proteobacteria (Figura 23). 10 % HYB
9
Media
8 7 % HYB
6 5 4 3 2 1 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Campo
Figura 2323- Porcentaje Hibridación AOB
66
Resultados
4.2.24.2.2-
Bacterias nitritoxidan nitritoxidantes xidantes (NOB)
Con la técnica de Hibridación in situ con sondas marcadas con fluorocromos (FISH) se han identificado comunidades bacterianas oxidantes de nitrito a nitrato (nitritoxidantes) del género Nitrospira, con las típicas formaciones de agregados celulares densos con forma esférica (Figuras 24A y 25A, color rojo). No se han detectado agregados celulares del género Nitrobacter. - Sonda Ntspa662 + competidora: Género Nitrospira (Sublinaje 1-IV) - Sonda NIT3 + competidora: Nitrobacter sp. En las figuras 24A y 25A se visualizó la hibridación de bacterias nitritoxidantes del género Nitrospira (color rojo) mediante la sonda de hibridación Ntspa662, mientras que en las figuras 24B y 24B muestran una imagen del mismo campo en la que se utilizó la sonda EUBmix 338 para detectar bacterias pertenecientes al dominio Eubacteria (color verde).
Figura 2424- Fotos con la sonda Ntspa662, nitritoxidantes flecha blanca 600x (Figura 24A) y Eubacterias flecha blanca 600x (Figura 24B) 24B) sondas EUBmix 338, 338, 600x
Figura 2525- Fotos con la sonda Ntspa662, nitritoxidantes flecha blanca 600x (Figura 25A) y Eubacterias flecha blanca 600x (Figura 25B) sondas EUBmix 338, 338, 600x
67
Resultados
Los resultados del análisis de imagen con las sondas Ntspa662 (color rojo) y EUBmix 338 (color verde) muestran un porcentaje de hibridación de 3%±1,0 de bacterias nitritoxidantes del phylum Nitrospira. 14 % HYB
12
Media
% HYB
10 8 6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Campo
Figura 2626- Porcentaje Hibridación NOB
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos de los porcentajes de hibridación, se puede afirmar que existe una comunidad bacteriana de amonioxidantes (AOB) bien desarrollada con un porcentaje 4%±0.6 respecto del total de la comunidad de bacterias viables del fango activo. Se ha detectado la presencia de una comunidad bacteriana de nitritoxidantes del género Nitrospira, con un porcentaje del 3%±0,7, respecto del total de la comunidad de bacterias viables del fango activo.
68
Resultados
4.34.3- Visualización al microscopio óptico 4.3.14.3.1-
Bioindicación del fango activo.
En base a los parámetros físico-químicos obtenidos y la observación de la decantabilidad del fango en el reactor biológico, se observa una situación de buena depuración, con un buen clarificado presentando una turbidez baja y ausencia de flóculos en suspensión. La observación tiene lugar con el microscopio óptico de contraste de fases con el objetivo 10x, el cual es el normalmente utilizado para las observaciones del flóculo. Se presentan los macroflóculos de un tamaño medio, con una buena macroestructura del mismo y con un buen equilibrio entre bacterias formadoras de flóculo y bacterias filamentosas (Figura 27).
Figura 2727- Foto del flóculo de una muestra tomada el 09/09/11 de la planta piloto. piloto. Objetivo 10x
En cuanto a la microscopía del flóculo presenta formas irregulares, tamaño grande (> 500 µm) la mayor parte de ellos. Se trata de un fango maduro multinucleado, que presenta núcleos con pequeñas zonas anaerobias, el resto del flóculo aparece como grandes zonas aerobias, por lo que se observa que la oxigenación es buena, no hay deficiencia de oxígeno. Buenos ejemplos de la microscopía del flóculo son las Figuras 27 y 29, que cumplen estas características. En el espacio interflocular se observa también un crecimiento de bacterias dispersas de pequeño tamaño y morfología cocobacilar.
69
Resultados
En cuanto a la microbiota, en el examen microscópico se observan arcelas, indicadoras de una buena nitrificación. Rotaria sp, bioindicadoras de una buena aireación y una buena calidad del efluente. La Figura 28 muestra un rotífero del género Rotaria, este organismo se alimenta a base de detritus y los parámetros bioindicadores asociados son una elevada edad del fango y una buena calidad del agua tratada.
Figura 2828- Foto de Rotaria sp. de una muestra tomada el 30/08/11 de la planta piloto. Objetivo 10x
En el examen microscópico se observa una población de bacterias filamentosas entre los que cabe destacar tipo 1851, tipo 1853, tipo 021N y Nostocoida. La Figura 29 muestra un flóculo maduro, multinucleado, con la presencia de filamentos del tipo 1851 y en el que podemos observar la estabilidad en cuanto a tamaño y características del flóculo a lo largo de la experimentación.
Figura Figura 2929- Foto del flóculo de una muestra tomada el 27/09/11 de la planta piloto. Objetivo 10x
70
Resultados
Además se observan abundantes bacterias cocobacilares de tamaño medio candidatas al phyllum β-proteobacteria. En base a las visualizaciones realizadas con el microscopio óptico de contraste de fases se puede afirmar que el licor mezcla muestra una buena calidad con un fango maduro, con la presencia de una buena macroestructura a nivel de flóculo que le confiere una buena sedimentabilidad dando lugar a un clarificado con una turbidez baja y presentando, por tanto, síntomas de una buena depuración. Además, no existe una proliferación excesiva de ningún morfotipo de bacterias filamentosas, lo que se traduce en una inexistencia de problemas asociados a estas como bulking o foaming. Además se presenta en la microbiota organismos asociados a una buena nitrificación (arcelas). También la presencia de otro tipo de microfauna (Rotaria sp.) son indicativos de un fango maduro y con buenas condiciones de aireación.
4.3.24.3.2-
Tinción de polipoli-fosfatos (Azul de metileno)
Analizando los resultados analíticos correspondientes al fósforo (Tabla 14), se evidenció un porcentaje de eliminación del mismo superior al correspondiente por la toma por parte de las bacterias para llevar a cabo su crecimiento, lo que hizo sospechar de la presencia de organismos acumuladores de poli-fosfatos (PAO). Para detectar la presencia de estos organismos se llevó a cabo la tinción de polifosfatos (Azul de metileno). Esta tinción es la más específica para la identificación de gránulos de poli-fosfatos. La tinción únicamente utiliza un colorante (Azul de metileno), por lo que no existe un contraste de coloración muy definido en cuanto a resultados positivos (color violeta) y negativos (color azul). A pesar de ello, produce un buen resultado de la tinción de poli-fosfatos, y permite su observación de forma sencilla y rápida. La figura 30 muestra flóculos de bacterias que han resultado positivos a la tinción de Azul de Metileno. Dada la forma de agruparse de las bacterias, el tamaño y forma de las mismas, además de su respuesta ante la tinción, se trata de una agrupación de bacterias con fenotipo PAO.
71
Resultados
Figura 3030- Fotos tinción polipoli-fosfatos objetivo 100x
4.3.34.3.3-
Tinción de polihidroxibutiratos, PHB (Sudan Black)
La tinción de polihidroxibutiratos (PHB) nos sirvió para confirmar los resultados de la presencia de PAO en el licor mezcla de la planta piloto que da como resultado la eliminación biológica de fósforo en los valores ya señalados en la Figura 17. Los colorantes del grupo Sudan se utilizan para la tinción de lípidos. Este colorante es más soluble en los lípidos que en la solución colorante, por eso se introduce en los lípidos. En particular, Sudan Black se utiliza para detectar la presencia de PHB, aunque hay que tener en cuenta que tiñe todos los lípidos presentes en la muestra y no sólo el PHB. La Figura 31 muestra flóculos de bacterias con inclusiones de PHB, identificado por el color negro tras la tinción con Sudan Black. La muestra fue obtenida de la fase anóxica/anaerobia de ahí la abundancia de inclusiones de PHB.
Figura 3131- Foto tinción Sudan Black objetivo 100x
72
Resultados
4.4Determinación ción de parámetros cinéticos mediante técnicas 4.4- Determina respirométricas 4.4.14.4.1-
Ensayos respirométricos biomasa autótrofa.
4.4.1.14.4.1.1- Determinación de YA Para determinación de la YA realizamos tres ensayos respirométricos dinámicos con diferentes concentraciones de cloruro de amonio para contrastar que el resultado obtenido es adecuado en un amplio rango de concentraciones. Así los resultados gráficos obtenidos se muestran en la Figura 32.
YA 40
Rsp (mg O/gSSVh)
35 30 25 YA C1
20
YA C2
15
YA C3
10 5 0 0:00:00
0:07:12
0:14:24
0:21:36
Tiempo (min) Figura 3232- Gráfica obtención de YA mediante respirometría
En este caso YAC1, YAC2, YAC3 se corresponden con tres concentraciones diferentes de cloruro de amonio. Dichos ensayos dan lugar a los siguientes resultados: Tabla 1515- Valores para el cálculo del rendimiento biomasa autótrofa NH4+ (mg N-NH4+/l)
YA C1 YA C2 YA C3
22 33 44
OC (mg O2/l) 89,41
YA
YA
(mg DQO/mg N)
(mg DQO/mgDQO)
0,024
0,11
135,67
0,021
0,10
176,13
0,026
0,12
73
Resultados
Para obtener los valores de YA (Rendimiento de las autótrofas) utilizamos la siguiente fórmula: YA = 1 –
,
Finalmente agrupamos estos valores en una gráfica a la que agregamos la línea de tendencia, con el valor de R cuadrado (Figura 33). Obteniendo el valor del rendimiento global de las autótrofas como: YA = 1 – pendiente = 1- 0,8625 = 0,1375 mg DQO/mg DQO Las unidades de YA se transforman a unidades habituales (mg DQO/ mg N-NH4+). YA = 0,1357
#
%$# $%
4,57
# $%
0,63 mg DQO.mg N
y = 0.862x + 3.666 R² = 0.998
AUTÓTROFAS YA Pendiente
OC (mg O/l)
#
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0
50
100
150 NH4+ (mg DQO/l)
200
250
Figura 3333- Obtención de la pendiente de YA
El valor de la YA se encuentra por encima de los valores esperados, ya que el rango de valores típicos obtenidos en otras investigaciones son superiores al obtenido, así el ASM2d propone valores para la YA de 0,24 mg DQO/mg N a 20ºC, muy por debajo del valor obtenido. Este resultado es debido al posible consumo de amonio por parte de la biomasa tanto autótrofa como heterótrofa para llevar a cabo el crecimiento, sin que este amonio sea nitrificado y por tanto, el consumo de oxígeno no sea de 4,57 mg O2, sino de 1mg O2 dando lugar a un consumo de oxígeno durante el ensayo menor al resultado descrito.
74
Resultados
4.4.1.24.4.1.2- Determinación de la tasa máxima de respiración de las autótrofas (Rsmáx auto) y tasa máxima de respiración por sólido suspendido volátil (Rspmáx auto) Para determinar la tasa máxima de respiración se realiza un ensayo respirométrico dinámico en el que se añade una solución de cloruro de amonio concentrada para conseguir que este sustrato no sea el factor limitante en el ensayo. Los resultados gráficos obtenidos son los siguientes (Figura 34):
Rsmáx autotrófas
Rsmáx autotrófas 40 35 Rs (mg O2/lh)
30 25 20 15 10 5 0 0:00:00
0:07:12 0:14:24 Tiempo (hh:mm:ss)
0:21:36
Figura 3434- Gráfica de obtención de la Rsmáx de las bacterias autótrofas
Tasa máxima de respiración de nitrificantes (Rsmáx auto) = 35,705 mg O2/lh Tasa máxima de respiración de nitrificantes por SSV (Rspmáx auto): Rspmáx auto =
/á1 23 445
=
6, # 7 /9: ;,
