Primer Informe

“USO Y CUIDADO DEL ESPECTROFOTÓMETRO DE ABSORCIÓN UV-VISIBLE OBTENCIÓN DEL ESPECTRO DE AZOSULFAMIDA CURVA DE RINGBOWN” 1.- OBJETIVOS  Operar correctamente el espectrofotómetro de absorción UV-Visible MODELO GENESYS 10S UV-VIS MARCA THERMO SCIENTIFIC.  Adquirir experiencia en la obtención de espectros de absorción.  Demostrar la interacción de la energía radiante y la materia a través de los espectros de absorción.  Determinar la longitud de onda óptima de la sustancia y sus aplicaciones analíticas.  Determinar la zona de trabajo y la concentración óptima. 2. FUNDAMENTO Las radiaciones ultravioleta y visible tienen en común el que la absorción en ambas regiones provoca la excitación de electrones a niveles de energía superiores. Para excitar a los electrones fuertemente unidos se requiere, en general fotones energéticos (de longitud de onda corta), mientras que los electrones unidos lábilmente (deslocalizados) pueden excitarse con radiación de longitud de onda más larga.1 La mayor parte de los trabajos analíticos se realizan con soluciones de manera que vamos a desarrollar la relación que existe entre la concentración de la solución y su capacidad de absorber radiación. 2 Para poder comprender e interpretar los espectros electrónicos de absorción es preciso tener en cuenta que tipo de transiciones electrónicas pueden tener lugar cuando se absorbe radiación ultravioleta o visible. En esta región pueden darse seis tipos de bandas de absorción (sin tener en cuenta los espectros de resonancia de carga y resonancia electrónica de los iones y radicales orgánicos inestables) que se deben a las transiciones electrónicas siguientes: π >> π*; n >> π*; σ >> σ*; n >> σ*, de trasferencia de carga y transiciones de campo ligando. Los distintos tipos de transiciones pueden identificarse claramente por la zona del espectro donde aparecen, por sus intensidades relativas y, en algunos casos por los desplazamientos observados al variar el disolvente. 3 Las intensidades de absorción suelen expresarse en términos de absortividades molares.

ϵ = A/bC Siendo: A= Absorbancia b= camino óptico, en cm C= concentración molar El valor de la absortividad molar depende del tamaño de la especia absorbente y de la probabilidad de la transición Para que haya interacción, el fotón debe chocar con la molécula dentro de un espacio de dimensiones aproximadas al tamaño de la molécula y la probabilidad de la transición es proporcional al número de impactos que producen absorción.3

Fundamento de la espectrofotometría de absorción UV-VISIBLE

3. PARTE EXPERIMENTAL MATERIALES: Equipos y reactivos:       

Espectrofotómetro UV – Visible: Modelo GENESYS 10S UV- Visible Cubeta de Cuarzo de 1cm Solución estándar de Azosulfamida 500µg/ml Pipetas de diferentes volúmenes Fiolas de diferentes volúmenes Agua destilada Propipeta

4 CÁLCULOS Con ayuda del espectrofotómetro GENESYS 10S UV-VISIBLE se determinó el %Transmitancia, mientras que para el cálculo de las Absorbancias se usó la siguiente fórmula: 2-log (%T), esto para graficar la curva espectral. La curva espectral nos determina la longitud de onda máxima para nuestra sustancia. Se completó el siguiente recuadro para una solución de azosulfamida de diferentes concentraciones: Concentración 1 λ(nm) %T 450 43.3 455 41.3 460 38.3 465 34.7 470 30.9 475 27.1 480 23.6 485 20.5 490 17.9 495 15.5 500 13.7 505 12.2 510 11 515 10.1 520 9.5 525 9.3 530 9.2 535 9.5 540 10.3

A 0.364 0.384 0.417 0.460 0.510 0.567 0.627 0.688 0.747 0.810 0.863 0.914 0.959 0.996 1.022 1.032 1.036 1.022 0.987

Concentración 2 λ(nm) %T 450 62.2 455 61.2 460 59.6 465 57.5 470 55 475 52.5 480 49.8 485 47.3 490 44.8 495 42.5 500 40.5 505 38.8 510 37.3 515 36.2 520 35.4 525 35 530 35 535 35.4 540 36.4

A 0.206 0.213 0.225 0.240 0.260 0.280 0.303 0.325 0.349 0.372 0.393 0.411 0.428 0.441 0.451 0.456 0.456 0.451 0.439

545 550 555 560 565 570 575 580 585 590 595 600

11.3 12.9 15.2 18.2 22.1 26.7 31.9 37.6 43.5 49.3 54.9 60

0.947 0.889 0.818 0.740 0.656 0.573 0.496 0.425 0.362 0.307 0.260 0.222

545 550 555 560 565 570 575 580 585 590 595 600

37.7 39.7 31.8 45.3 48.7 52.4 56 59.6 53.2 66.3 69.2 70.5

0.424 0.401 0.498 0.344 0.312 0.281 0.252 0.225 0.274 0.178 0.160 0.152

La curva de Ringbown nos determina la concentración óptima y la concentración mínima y máxima, es decir la zona de trabajo. Para ello se calculó las Absortancias de la azosulfamida de diferentes concentraciones, usando la fórmula Absortancia = 100 - %T. Se completó el siguiente recuadro: Diferentes concentraciones [ ] µg/ml %T A 0.1 95.6 4.4 0.5 98.9 1.1 1 90.1 9.9 2 83.5 16.5 4 60 40.0 6 61.1 38.9 8 85.4 14.6 10 44.2 55.8 15 28.9 71.1 20 24.6 75.4 30 12.7 87.3 40 8 92.0 50 2.4 97.6 80 0.3 99.7 100 0.1 99.9

5. RESULTADOS Con los datos obtenidos se obtienen las siguientes gráficas:

%T vs Longitud de onda

Curva Espectral De Azosulfamida Absorbancia vs Longitud de onda

En esta gráfica se observa que en la solución de concentración 2 existen 2 picos, mientras que en la solución de concentración 1 no observamos ningún pico. La aparición de estos picos puede deberse a posibles causas:  

interacción del operador y el aparato de medición condiciones experimentales fluctuantes

   

variabilidad inherente en los instrumentos de medición una calibración incorrecta del instrumento de medición un error consistente en el uso del instrumento condiciones experimentales inadecuadas

También podemos observar que en la soluciónes de concentración 1 y 2 la longitud de onda óptima es de 530nm. Curva de Ringbown Según el gráfico se determina una concentración óptima de 9.5µg/ml y una zona de trabajo que va desde 1.6 a 50µg/ml.

6. DISCUSION El registro de la variación del coeficiente de absortividad molar є, o de la absorbancia A, o de la transmitancia T, en función de la longitud de onda da origen a lo que se denomina " espectro " o curva espectral de una sustancia química e indica las características de absorción de dicha sustancia con relación a la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva espectral se presenta como Absorbancia vs longitud de onda y el espectro se denomina espectro de absorción, o en función de la transmitancia, denominándose el espectro, espectro de transmisión. 4 En esta práctica se realizó tanto el espectro de absorción como el espectro de transmisión de la azosulfamida, obteniendo a partir de ella la longitud de onda óptima, la cual fue de 530nm; esto nos servirá para el trazo de la curva de Ringbown. Para obtener el intervalo óptimo y adecuado de concentraciones con el menor error por lectura primero se construye la curva de Ringbown que consiste en construir una gráfica de absortancia (100%-T) vs la concentración. 5 Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración.5 En el caso de la curva de Ringbown se obtuvo como concentración óptima 9.5µg/ml aproximadamente, la concentración mínima fue de 1.6µg/ml y la concentración máxima fue de 50µg/ml. 7. CONCLUSIONES



El buen manejo y cuidado del espectrofotómetro determina la efectividad de nuestros resultados al momento de analizar las muestras. Es indispensable antes de analizar una sustancia calibrar el instrumento, usando el blanco (solvente) al 100% T.



Las diferentes sustancias tienen diferentes comportamientos frente las radiaciones electromagnéticas por lo cual al llevarlas al espectrofotómetro este nos brinda las absorbancias de cada concentración de las sustancias.



La longitud de onda máxima obtenida en las dos concentraciones de azosulfamida fue de 530nm.



Determinando la curva de Ringbown podemos demostrar mediante trazos y rectas en la gráfica, que no todas las concentraciones cumplen con la ley de Lambert- Beer; es decir, se halla la concentración óptima y la zona de trabajo óptima (concentraciones mínima y máxima).

8. CUESTIONARIO 1.- Describa cada uno espectrofotómetro UV-V. 6

de

los

sistemas

que

componen

el

Los cinco componentes esenciales de la radiación UV-VIS instrumentos son los siguientes.     

Una fuente de radiación estable. Selector de longitud de onda. Portamuestras. Detector o transductor de la radiación. Procesamiento de señales y dispositivo de salida.

Fuentes de radiación Una fuente de radiación espectrofotométrica debe proporcionar una salida estable de alta energía en un amplio intervalo de longitudes de onda. No hay una fuente barata disponible que puede proporcionar una salida estable durante toda la gama de UV-visible (190 nm a 780 nm). Se utilizan normalmente fuentes continuas para las mediciones de absorción molecular. Algunos ejemplos de fuentes continuas comúnmente utilizados están:

(a) Lámpara de deuterio para el rango UV. (b) Lámpara de tungsteno para el rango visible.







Las lámparas halógenas de tungsteno, que tienen una temperatura radiante T de 3000 K y por lo tanto tienen un espectro radiante máximo a una longitud de onda de aproximadamente 1,2 µm; son ampliamente utilizados en el visible y por encima de los 330 nm. Las lámparas de deuterio (lámparas de descarga de gas) que emiten fuertemente en la región UV por debajo de los 330 nm, el espectro continuo de deuterio tiene líneas de emisión atómica en superposición. Las lámparas de arco de xenón que le dan un continuo que va desde menos de 190 nm y por encima de 1000 nm.

Selectores de longitud de onda En las mediciones espectrofotométricas tenemos que usar una banda estrecha de longitudes de onda de la luz. Esto mejora la selectividad y la sensibilidad del instrumento. Instrumentos menos costosos usan un filtro para aislar la energía radiante y proporcionar una amplia banda de longitudes de onda. En muchas aplicaciones es necesario variar continuamente la longitud de onda en un rango definido. Esto puede lograrse mediante el uso de monocromadores. Compartimientos de muestras Muestras líquidas Las muestras líquidas están usualmente contenidas en celdas fotométricas y estas se ubican en compartimientos o contenedores especiales. Los contenedores pueden ser calentados o enfriados con el fin de controlar la temperatura del líquido en la celda de muestra. Muestras gaseosas Los gases y vapores se miden en celdas para gases similares a los utilizados para líquidos. Generalmente, el paso de luz a través de la celda es mucho mayor. Los gases a cualquier presión se encuentran en celdas cerradas para su medición.

Cubetas o celdas comúnmente empleadas en espectrofotometría UV-VIS.

Muestras sólidas Las muestras sólidas se mantienen en compartimientos especiales. Cuando se miden sus absorbancias, se experimentan dificultades, por ejemplo en la adecuación de la muestra y la longitud de los caminos de referencia. Detectores Los detectores se utilizan para convertir una señal luminosa a una señal eléctrica que puede ser adecuadamente medida y transformada en una salida. Los detectores usados en la mayoría de los instrumentos generan una señal, que es lineal en la transmitancia, es decir, que responden linealmente a la

potencia radiante que incide sobre ellos. Los valores de transmitancia se pueden cambiar logarítmicamente en unidades de absorbancia por una disposición eléctrica o mecánica en la señal de lectura del dispositivo. Adquisición y procesamiento de datos La señal eléctrica procedente del transductor está convenientemente amplificada o procesada antes de ser enviada a la grabadora para dar una salida. La resta del espectro del disolvente del espectro de la solución se hace electrónicamente. La gráfica de salida entre la longitud de onda y la intensidad de absorción es la resultante del proceso de sustracción y es característico de la especie absorbente. 2. ¿En qué consiste el calibrado del instrumento?

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La calibración de espectrofotómetros consiste en realizar un conjunto de operaciones que tienen como finalidad determinar la magnitud de los errores que comete el instrumento al realizar las mediciones, dichos errores son obtenidos al comparar los resultados de cada medición con los valores certificados de un material de referencia, tomando en cuenta que las mediciones son realizadas bajo las mismas o similares condiciones y empleando la misma metodología. De la calibración se obtiene la incertidumbre, de esta y de la tolerancia se derivan los factores de corrección que el instrumento requiere, lo que resulta ser un indicativo de sí el instrumento demanda o no un ajuste. Calibración de la longitud de onda: Es la determinación de la exactitud en la escala de longitud de onda. Calibración de la escala fotométrica: Similarmente a la calibración de la escala de longitud de onda, es posible utilizar un patrón para la calibración de la escala fotométrica, es decir la escala de transmitancia o de absorbancia del instrumento. Linealidad de la escala fotométrica: Esta prueba determina la exactitud de los instrumentos para medir absorbancias con el incremento de la concentración, evidentemente, los problemas de linealidad en los espectrofotómetros producen resultados incorrectos. Ruido fotométrico: El ruido fotométrico es una medición de la relación Señal/Ruido de un instrumento. Esta prueba es monitoreada como una función del tiempo, determina la variación entre la absorbancia a través de un periodo corto tiempo en una longitud de onda establecida. Estabilidad fotométrica: Este parámetro provee una indicación de cuán estable es el espectrofotómetro en un amplio tiempo de medición. Es la diferencia entre el pico mínimo y el pico máximo en un periodo no menor de 1 hora.

Línea base plana: Esta prueba determina las variaciones del valor fotométrico a lo largo de toda la distribución espectral o en el intervalo deseado con el compartimiento de muestras vacío. Ancho de banda espectral: Se compara el ancho de banda espectral seleccionado por el instrumento y el ancho de banda determinado por cálculo, cuyo valor corresponde a la diferencia de longitudes de onda del punto medio de la banda. Luz extraviada: La luz extraviada es cualquier radiación que llega al detector y que no posee una longitud de onda similar a la seleccionada. El detector no puede diferenciar entre la luz extraviada y la luz proveniente de la muestra y por tanto une ambas señales, dando indicaciones incorrectas. 3. ¿Qué es la precisión fotométrica?

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Se denomina precisión fotométrica a la medida de la dispersión de una serie de mediciones de transmitancia o absorbancia alrededor de la media y se expresa como coeficiente de variación porcentual. 4. ¿A qué se debe la diferencia de los espectros de la sustancia estudiada? Uno de los principales factores que determinan la diferencia de un espectro y otro es la concentración, ya que en nuestro caso se analizó la misma sustancia pero a dos concentraciones diferentes. Existe una relación directa entre la concentración de la sustancia y la absorbancia, efectivamente esto se observa en nuestra gráfica en la cual podemos deducir que aquel espectro que tiene una absorbancia mayor es la que se encontraba a una concentración mayor. 5. Si se traza la curva espectral de tres soluciones de concentraciones distintas de una misma sustancia ¿variará la longitud de onda de máxima absorción? Explique con un ejemplo. No varía la longitud de onda de máxima absorción, un ejemplo claro está en los espectros obtenidos en nuestra práctica con azosulfamida, en ella se ve claramente que la longitud de onda máxima se mantiene; mientras que solo se evidencia una diferencia en la absorbancias, esto ya se explicó anteriormente por la relación directa que existe entre la concentración de la sustancia y la absorbancia. 6. Ubique la zona de trabajo y la concentración óptima de lectura. La concentración óptima obtenida en nuestra gráfica de azosulfamida fue de 9.5µg/ml aproximadamente. La zona de trabajo varía de 1.6 a 50µg/ml.

7. De acuerdo a la curva de Ringbown, explique y fundamente ¿a qué se debe la formación de mesetas, inferior y superior? 9 Para obtener el intervalo óptimo de concentraciones primero se construye la curva de Ringbom, que consiste en construir una gráfica de absorbancia (100%T) vs. Log Concentración. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma de S con una meseta superior y una meseta inferior. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración. En esta gráfica, se trazan líneas paralelas en las mesetas superior e inferior, permitiendo realizar los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, los cuales pueden servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente. 8. Investigue sobre los principales errores en la lectura de absorbancia relacionados con la concentración. (Error relativo ΔC/C) y error absoluto ΔT y la curva de Crackford. Los errores indeterminados que se producen en la lectura de las escalas de transmitancia o absorbancia son errores instrumentales siempre presentes y deben ser tomados en cuenta por todos los usuarios de espectrofotómetros cuando realizan mediciones cuantitativas. Pequeños errores en la lectura de la transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la concentración cuando se opera en los extremos de la escala. El error absoluto cometido en la determinación de la concentración, para una cierto error de lectura de transmitancia, es pequeño, pero al ser pequeña la concentración, el error relativo puede ser grande. Esto es, el error absoluto en una concentración es pequeño, ahora bien el error relativo (el error absoluto dividido por la concentración a determinar) será elevado, dando lugar de nuevo a poca precisión en la medida de la concentración, intuitivamente se puede concluir que parece razonable aceptar que los valores intermedios de la transmitancia son los que darán una precisión óptima, esto explica la importancia de la gráfica de la curva de Ringbown. Curva de Crackford: Si: (ΔC/C) / ΔT = 0.4343 / T. logT. A partir de esta última relación se construye la curva del error o curva de Crawford graficando el valor absoluto de (D C/C) / D T vs. T, tomando transmitancia entre cero y uno. Esta gráfica indica que el error depende en forma compleja de la medida de la transmitancia y para valores muy bajos o muy altos de transmitancia, el error en la concentración crece exponencialmente, mientras que para valores

intermedios el error permanece aproximadamente constante, presentándose un mínimo error en la concentración para la transmitancia correspondiente a 0.368 o 36.8 %T. 9. BIBLIOGRAFIA 1. Olsen E. Métodos ópticos de análisis. Espectrofotometría ultravioleta y visible. Reverte. Barcelona, 1990. Pág. 87-88. 2. Brunatti C, Martín A. Introducción a la Espectroscopía de Absorción Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano. Medición de Transmitancia y Absorbancia. Pág 2. 3. Olsen E. Métodos ópticos de análisis. Espectrofotometría ultravioleta y visible. Reverte. Barcelona, 1990. Pág. 91. 4. Universidad Nacional de Colombia. Establecimiento de un método espectrofotométrico.URL: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2001184/lecciones/Cap10/ 01_01_01.htm 5. Skoog Douglas, Principios de análisis instrumental. 6ta edición. CENGAGE, 2007. 6. Datateca.unad. [internet]. Instrumentación de la espectrofotometría UVVIS. [Citado 28 de enero de 2016]. Disponible en: http://datateca.unad.edu.co/contenidos/401539/exe-2%20de %20agosto/leccin_5_instrumentacin_de_la_espectrofotometra_uvvis.htm l 7. Chacón S. Caracterización de un espectrofotómetro Ultravioleta Visible para ser utilizado en la certificación de materiales de referencia. [Internet], 2002. Costa Rica. Disponible en: http://www.lacomet.go.cr/documentosweb/quimica/2011/Publicaciones/sa ndra.pdf 8. Claudio Duymovich, Rosana Acheme, Sandra Sesini, Daniel Mazziotta. Espectrofotómetros y Fotocolorímetros Guía práctica de actualización. [Internet], 2005. Disponible en: http://www.scielo.org.ar/scielo.php? script=sci_arttext&pid=S0325-29572005000400014 9. Blogspot.pe. Gráficas de Ringbown [internet], 2010. [Actualizado 10 de junio de 2010; Citado 28 de enero de 2016]. Disponible en: http://rocioeevelyn.blogspot.pe/