Preinforme1-Grupo-

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PRE INFORME 01

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

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FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL TITULO: “INGENIERIA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES” PROFESOR: AUGUSTO CASTILLO CALDERON

GRUPO: B-3 CURSO: LABORATORIO DE BIOPROCESOS ALUMNOS:     

ESCOBEDO FLORES ALEX JESUS GUTIERREZ DIANA LOPEZ ZAMORA MARILEYLA MORALES CHORRES DIANA VALVERDE LOPEZ EDINSON

NVO CHIMBOTE, ABRIL 2016

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DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTE DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124, UTILIZANDO XILOSA Y GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO

I.

OBJETIVOS:

I.1.

Objetivos Generales:  Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y – 7124, evaluándose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad de agitación en la cinética de crecimiento y la producción de etanol.  Determinación de los parámetros cinéticos de la cepa Pichia stipitis NRRL Y – 7124.

I.2.

Objetivos Específicos:  Diseñar el medio líquido de cultivo.  Activación celular y desarrollo del inóculo  Determinar la cinética de crecimiento de la biomasa.  Determinar de la cinética de consumo de la fuente de carbono.  Determinar la cinética de generación de Etanol.  Determinación del

y

; los rendimientos del nutriente limitante

en células y en etanol además de las respectivas productividades en células y en etanol.  Evaluar el valor del pH durante la cinética. II.

METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

II.1.

DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

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Para la formulación del diseño de cultivo se tiene en cuenta los siguientes requerimientos nutricionales para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y – 7124.

II.1.1. Para el Diseño del medio de cultivo. Macronutrientes

: C, N, Mg, S, K y P

Micronutrientes

: Ca, Cl, Zn, Co, B

pH

: 4.5

Estado

: Medio líquido

Volumen del medio: 30 – 40 % del volumen del fermentador  Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de cultivo mínimo. Fuente de carbono y energía

:

Xilosa + 1.5 gr glucosa

Fuente de N

:

Sulfato de amonio

Fuente de Mg y S

: Sulfato de magnesio heptahidratado

Fuente de K

:

Fosfato diácido de potasio

Fuente de P

:

Fosfato diácido de potasio

 Medio líquido de Mantención: Se calcularon los compuestos para el medio Nutriente Extracto de levadura Peptona Extracto de malta Agar

Concentración (gr/l) 3 5 3 20

Tabla 01: Concentración de nutrientes para el medio de mantención.

 Medio Activación: Nutriente

Concentración (gr/l) Página 6

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Xilosa + glucosa Extracto de levadura Extracto de malta Solución de sales

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10 3 5 5 ml /l

Tabla 02: Concentración de nutrientes para el medio de activación. T: 30ºC y N: 150 rpm

 Medio Fermentación: Nutriente Xilosa + glucosa Extracto de levadura (NH4)2PO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O Solución de sales Tampón citrato

concentración (grs/L) 14,0 3 3 2 1,1 5 ml/L

pH 4,5

Tabla 03: Concentración de nutrientes para el medio de fermentación. T: 30ºC y N: 150 rpm

 Solución de sales: Nutriente CaCl2.2H2O ZnSO4.7H2O MgSO4.7H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O H3BO3 FeSO4.7H2O HCl

Concentración (g/l) 2.9 0.40 2.20 0.25 0.24 0.06 6.42 Concent.

Tabla 04: Concentración de sales para el medio de fermentación.

II.2.

PREPARACIÓN DE MEDIOS Página 7

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II.2.1.

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Preparación de los materiales para el medio de cultivo:

Xilosa y glucosa demás nutrientes

LAVAR Y SECAR

materiales de vidrio a utilizar.

COLOCAR

estufa en posición vertical vasos precipitados, matraz y tubos de ensayo.

ESTERILIZAR

a 121 °C por 15 minutos

PESAR

DILUIR

En matraces de 125ml diluir las sales con 50ml de agua destilada.

DILUIR

En un matraz de 125ml

Xilosa Agua destilada 50 ml nitrógeno Agua destilada 50 ml

DILUIR COLOCAR

ESTERILIZAR 3 disoluciones

AGREGAR

ELABORAR

En un matraz de 125ml matraces previamente recubierto con papel aluminio en la estufa. a 121 °C por 15 minutos. En un matraz de 1 L curva de calibración para la determinación de azucares reductores por el método del DNS.

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Inoculación: Se debe tener el lugar bien desinfectado, se colocan los mecheros se prosigue de la siguiente manera:

EXPONER

ENFRIAR E INTRODUCIR

EXTRAER

COLOCAR

REALIZAR

LLEVAR

La aza bacteriológica al fuego del mechero hasta en tubo de ensayo que contenía las células desarrolladas en medio rico liquido una gota

o sembrar en un tubo de ensayo con medio rico sólido (con agar).

por duplicado es decir 2 azadas. A la incubadora por 6 horas

II.2.2. Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa. Página 9

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Determinación de los parámetros cinéticos: uM y KS

PREPARAR

8 matraces con diferentes concentraciones de xilosa

DILUIR

a 121 °C por 15 minutos

UTILIZAR

Curva de calibración para azucares reductores, determinando así la concentración en cada matraz

INOCULAR

Los matraces con un 1mL

DETERMINAR

Utilizando la curva de calibración al cabo de tiempos determinados la concentración final de

 Utilizando la ecuación ln(X / X0) = μt, determinamos distintos valores de μ.  Tabular Si vs. μi  Con la ecuación 1/ μ = 1/μm + (KS/ μm) 1/S, graficamos.  La intercepción con el eje y será el valor de 1/μm siendo su inversa el valor de μm,

además la pendiente m= K S/ μm

conocido anteriormente μm determinamos KS.

dX / dt = μm X ……………….()

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X = X0 e μmt

II.2.3. Determinación de la cinética de consumo de la fuente de carbono.

-dS / dt = (1/ YX/S) (dX/dt)

 Reemplazando  en esta ecuación y conociendo YX/S.  Tenemos -dS / dt = (1/ YX/S) μm X , conociendo μm ya para diferente concentraciones finales podemos determinar la cinética de consumo de sustrato.

II.2.4. Determinación de los rendimientos del nutriente limitante en células. 

Fuente de carbono y energía: xilosa (C5 H10 O5) M= 150g Y X / s=

de C en elnutriente de C en la célula

YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la célula % de C en el nutriente = 12(5) x 100 / 150 = 40 % % de C en la célula = 46.57 % YX/S = (40/46.57) x 0.6 (este factor por ser aireado) YX/S = 0.86 x 0.6 = 0.52 g/g P á g i n a 11

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

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Fuente de carbono y energía: glucosa (C6 H12 O6) M= 180g Y X / s=

de C en elnutriente de C en la célula

YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la célula % de C en el nutriente = 12(6) x 100 / 180 = 40 % % de C en la célula = 46.57 % YX/S = (40/46.57) x 0.6 (este factor por ser aireado) YX/S = 0.86 x 0.6 = 0.52 g/g II.2.5. Determinación del contenido de azúcares reductores mediante el método del DNS. La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:   

10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) 200 mL / L de NaOH 2N 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en Aproximadamente 500 ó 600 mI de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro. AÑADIR

MANTENER

AÑADIR

Un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. La mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar. 10 volúmenes de agua destilada. P á g i n a 12

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LEER

La absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

OBTENER

La concentración interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado.

II.2.6. Determinación de la concentración celular por densidad óptica. El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismo s, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación es necesario que previamente' se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

TOMAR

a 1200 rpm durante

una muestra de volumen conocido

CENTRIFUGAR

20 minutos.

ELIMINAR

CENTRIFUGAR

el sobrenadante y se suspende el centrifugado con agua destilada.

Otra vez

P á g i n a 13

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SECAR

III. 3.1

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en la estufa a 80°C hasta peso constante.

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN:

3.1.1 MATERIALES Y EQUIPOS Balanza analítica: Las balanzas analíticas modernas pueden ofrecer valores de precisión de lectura de 0,1 micras a 0,1 mg, están bastante desarrolladas. En este caso pesaremos todos los compuestos para el medio así que tiene que ser con mucho cuidado.

Matraz Erlenmeyer: Es más seguro que un vaso de precipitado, ya que la estructura del matraz evita perdidas de solución contenida (agitación o evaporación).Es ideal para agitar soluciones. Se puede tapar fácilmente utilizando algodón o tapa.

Mechero Bunsen: Se utiliza para calentar, fundir o evaporar sustancias. La llama del mechero que arde correctamente es transparente y tiene un matiz azulado. Se agita hasta la aparición de la primera burbuja de la solución que contiene el matraz.

P á g i n a 14

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Espátula, pipeta: Objetos de ayuda al pesar y medir volúmenes respectivamente.

Tubo de ensayo: Es un pequeño tubo de vidrio con una abertura en la zona superior, y en la zona inferior es cerrado y cóncavo. Esta hecho de un vidrio especial que resiste las temperaturas muy altas, sin embargo los cambios de temperatura muy radicales pueden provocar el rompimiento de tubo (Pyrex).

Varilla de vidrio: Son unas varillas de unos 20 cm de longitud que se utilizan para agitar las disoluciones ayudando a que los sólidos se disuelvan en los disolventes más rápidamente.

Agua destilada Glucosa

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Olla a presión: Se introducen los tubos y se afloja las tapas para el intercambio de gases

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Algodón, gasa y capachitos de aluminio

3.1.2. REACTIVOS

Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124: es una levadura fermentadora de hexosas y pentosas que presenta un rendimiento de etanol de 0.4 gg-1, sin producción de xilitol. Este cultivo a trabajar nos da referencia para el medio cultivo.

Extracto de levadura: Es un excelente estimulador del crecimiento de bacterias, es utilizado en la preparación de medios de cultivo microbiológicos. Extracto de Levadura es la parte soluble en agua de autolisis levadura que es cuidadosamente controlada para preservar la forma natural del complejo B.

Peptona

Extracto de malta

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3.1.3. PROCEDIMIENTO PESAR

Mezc la

MEDIR

7 ml

AGREGAR

CALENTAR

AGITAR

PREPARAR

AÑADIR

COLOCAR

A olla a presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de

Las cantidades requeridas de cada compuesto con la ayuda de la balanza Agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se requiere. En un vaso de precipitados con agua destilada para diluir todos los compuestos pesados Con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; Constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja 6 tubos de ensayo con tapa Con la ayuda de una pipeta de 10 ml, inmediatamente taparlos. Los tubos en un vaso de precipitado

LLEVAR

Las tapas de los CALENTAR tubos estando estos aun dentro de AJUSTAR

á g i n a 17 Hasta P 121ºC y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos

e

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3.2.

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MEDIO DE ACTIVACIÓN:

3.2.1. Materiales y equipos

2 matraces

Balanza analítica

Mechero Bunsen

Estufa: La estufa de secado es un equipo que se utiliza para secar y esterilizar recipientes de vidrio y metal en el laboratorio. Se identifica también con el nombre Horno de secado.

Una probeta de 100 ml

Varilla de vidrio, pipeta y espátula

PH metro: es un sensor utilizado en el método electroquímico para medir el pH de una disolución. La determinación de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a través de una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones con de protones.

diferente

concentración

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Agitador orbital- Shaker: Un agitador, a veces llamado mezclador, es un dispositivo que se utiliza en los laboratorios de química y biología para mezclar líquidos o preparar disoluciones y suspensiones

3.2.2. Reactivos:

Glucosa: es un azúcar que está presente de manera natural en elementos tales como las frutas o la miel. Las frutas también poseen otro tipo de azúcar natural que se conoce como fructosa.

Extracto de levadura: Es un excelente estimulador del crecimiento de bacterias, es utilizado en la preparación de medios de cultivo microbiológicos.

Extracto de malta: Debido a su especial sabor, color y agradable aroma, el extracto de malta se usa ampliamente en la industria alimentaria con el fin de mejorar las propiedades organolépticas, valor nutricional, textura y vida útil de los productos. Solución de sales

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Alcohol

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Agua destilada

3.2.3. Procedimiento PESAR

Xilosa 10 ml agua destilada

ESTERILIZAR Sales 5 ml agua destilada

AJUSTAR

MEZCLAR

3.3.

Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 2

Por separado el extracto de levadura en un tubo de ensayo

Ajustar el pH a 4.5 de la solución de que contiene Xilosa Estos componentes para el medio de activación “bajo mechero” para evitar la contaminación. ;

MEDIO DE FERMENTACIÓN  Se pesan las sales de acuerdo a la tabla Nº 3  Acido ascórbico

3.3.1. Materiales y Equipos

P á g i n a 20

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2 matraces de 125 ml

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Matraz 1L.

Balanza analítica

Varilla de vidrio

Gasa, capachitos y algodón.

pH metro

3.3.2. Reactivos

Sacarosa: es el término apropiado para describir el azúcar común. Dos azúcares simples, glucosa y fructosa, se combinan para formar el hidrato de P á g i sacarosa. n a 21 carbono complejo conocido como La sacarosa es fina, incolora, inodora y tiene un sabor dulce. La sacarosa da un impulso de energía rápida para el cuerpo. Es fermentable y absorbe humedad.

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Agua destilada

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Extracto de levadura (NH4)2SO4 = sulfato de amonio: En bioquímica, la precipitación del sulfato de amonio es un método común para purificar las proteínas al lado de precipitación selectiva; El sulfato de amonio es extremadamente soluble en agua y así que puede hacer las soluciones muy concentradas que pueden “salar hacia fuera” las proteínas, causando su precipitación en

KH2PO4 = fosfato de

MgSO4.7H2O

Alcohol

Solución de sales

potasio:

3.3.3. Procedimiento PESAR P á g i n a 22

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Xilosa y KH2PO4 100 ml agua destilada Extracto de levadura

DILUIR

Agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se requiere.

40 ml agua Peptona 40 ml agua destilada

REGULAR

el pH de la solución de xilosa a 4.5.

ESTERILIZAR

las diluciones separado.

ENFRIAR

REFRIGERAR

P á g i n a 23

por

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3.4. 3.4.1.

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RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SÓLIDO ) Materiales y equipos

 Aza bacteriológica  Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.  Mechero Bunsen, trípode y rejilla. 3.4.2. Procedimiento

MANTENER

SOMETER

Un ambiente estéril

El asa bacteriológica al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo vivo.

ENFRIAR Por unos segundos

EXTRAER

HACER

LLEVAR

una azada del tubo de ensayo que contiene células desarrolladas en medio sólido El procedimiento de resiembra en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar).

a la incubadora a 30 º C durante 48 horas

P á g i n a 24

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3.5. 3.5.1.

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PRE INFORME 01

ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO Materiales y equipos 

Matraz de 125 ml.



Algodón



Gasa



Agua destilada



Shaker



Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

3.5.2. Procedimiento PARTIR

TOMAR

INOCULAR

TAPAR

LLEVAR

Con la cepa incubada en medio sólido

Una azada

en el matraz con los 30 ml del medio de activación

El tubo con un tapón de gasa y algodón

al Shaker a 180 rpm, Tº = 35 ºC y un t = 24 (1) hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente,

P á g i n a 25

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3.6.

-

PRE INFORME 01

DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA

3.6.1.

Materiales y equipos  Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación  Espectrofotómetro  pHmetro  Gasa y algodón  Centrifuga  Tubos de ensayo  Capachos de papel aluminio

3.6.2.

Procedimiento Cald o

INOCULAR

La un matraz de 1L conteniendo 270 ml. de medio definido.

30 Cald o 5 ml

EXTRAER

TOMAR

TOMAR

Cald o 5 ml Cald o 3 ml

EXTRAER

AGREGAR

Luego se medir X0 y S0 con D.O.

Medidas de asepsia en la zona de trabajo y Muestras se inicia desde la dilución del medio de activación en el medio de fermentación.

Se le agrega al tubo del espectrofotómetro y el resto se le agrego al tubo de P á g i n a 26

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MEDIR

DISOLVER

CENTRIFUGAR

VERTIR

GUARDAR

-

PRE INFORME 01

absorbancia a 640 nm y pH

al tubo de centrifugado para completar los 5 ml

a la máxima velocidad por 20 minutos el sobrenadante vierte a los viales

se

en el refrigerador con el fin de después determinar el consumo de

P á g i n a 27

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3.7. 3.7.1.

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PRE INFORME 01

MÉTODO DEL DNS (ACIDO DINITROSALICÍLICO) Materiales y equipos  Barra magnética  Vaso de precipitado 250ml  Matraz de aforo de 100ml.  Papel aluminio  Balanza de platos  Balanza analítica  Frasco de vidrio  Agitador magnético  Mechero bunsen

3.7.2.

Reactivos  1g de acido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)  1.6g de NaOH 2N.  30g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.

3.7.3.

Procedimiento Tartrato 500 ml agua Acido DNS

DISOLVER

DISOLVER

Paralelamente

MEZCLAR

Ambas soluciones en un matraz aforado de 1lt

AGITAR

Hasta la completa disolución de todos los componentes.

AFORAR P á g i n a 28

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-

PRE INFORME 01

Hasta 1 lt

P á g i n a 29

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IV.

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PRE INFORME 01

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES:

Abril

ACTIVIDADES 13 Selección y prelación de reactivos y materiales. Esterilización de medios. Preparación del medio de cultivo Inoculación del medio de cultivo



20

Mayo 27

02

04

05

11

13

17

18

0



preparación de la solución tampón Evaluación y supervisión del medio. Evaluación y supervisión del medio. Evaluación y supervisión del medio. Evaluación y supervisión del medio. Evaluación y supervisión del medio. Determinación de las cinéticas de crecimiento, consumo. Sustentación Examen Unidad I

















P á g i n a 30

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IV.1.

-

PRE INFORME 01

PROGRAMACION DE CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

P á g i n a 31

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-

PRE INFORME 01

CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES Plan de Muestreos y Registro de Datos Grupo: __________________________________ Día: ___ /___ / ___ Microorganismos: ___________________________ Fuente Carbono: ____________________________ pH __________ T °C __________ N rpm ________

Nombre Nª

IV.

HORA

TIEMPO

Abs.(640

del

nm)

alumno

Observaciones

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

P á g i n a 32

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PRE INFORME 01

1. http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php? Mostrar=quimicos 2. Biotechnol. Bioprocess. Eng. 2000, 5: 27-31 - Department of Molecular Science and Technology, Ajou University, Suwon 442-749, Korea Enari, T. M. and M. L. Suihko (1984) 3. Ethanol production of pentose and hexoses from cellulose materials. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1: 229-240. - Vol. 28, No. 01, pp. 151 - 156, January - March, 2011 - Martínez, A., Rodríguez M. E., York S. W. 4. “Determinación de parámetros de co-cultivo de scheffersomyces stipitis y saccharomyces cerevisiae para la fermentación de residuos lignocelulosicos para la obtención de bioethanol” Ana Karina Castillo Plata 5. http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKits-C.pdf. 6. http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml 7. QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica.

P á g i n a 33

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V.

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PRE INFORME 01

ANEXOS:

 HALLANDO EL % EN CÉLULAS: se sabe la fórmula del m.o.:

CH1,79 O0,6 N0,17 ELEMEN TO C H O N

Peso molecu lar 12 1 16 14 TOTAL(g)

Cantid ad

Peso (g)

1 1.79 0.6 0.17

12 1.79 9.6 2.38 25.77

% por eleme nto 46.57 6.95 37.25 9.24

Peso (g) = peso molecular * cantidad por elemento=

Peso ( g )∗100 TOTAL

Diseño del medio de activación y de Fermentación: PARA LA XILOSA:

%C nutriente = 40%

%C. en biomasa= 46.57%

Si:

Si:

P á g i n a 34

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-

PRE INFORME 01

PARA LA GLUCOSA:

%C nutriente = 40%

%C. en biomasa= 46.57%

TOTAL DE SUSTRATO (GLUCOSA: 1.5 g/l GRUPO B3) Xilosa

3.85 gr/l

Glucosa

1.5 gr/l

MEZCLA TOTAL

5.35 gr/l

 PARA KH2PO4:

P á g i n a 35

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PRE INFORME 01

 PARA (NH4)2SO4:

P á g i n a 36

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PRE INFORME 01

 PARA MgSO4.7H2O:

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-

PRE INFORME 01

NUTRIENTES PARA EL MEDIO DE FERMENTACION Element o

Nutriente

P.M.

% en Célula

% en Nutriente

Yx/s (g/g)

So (g/l)

C C P K N S Mg

C5H10O5 C6H12O6 KH2PO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 (MgSO4.7H2O

150 180 136 136 132 132 246

46.57 46.57 1.7 2.5 9.24 0.55 0.5

40 40 22.794 28.676 21.21 24.24 9.756

0.52 0.52 13.408 11.470 2.295 44.073 19.512

5.769 5.769 0.224 0.262 1.307 0.068 0.154

S

) (MgSO4.7H2O

246

0.55

13.01

23.655

0.127

)

5.2.

DISEÑO DE MEDIO DE CULTIVO: P á g i n a 38

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-

PRE INFORME 01

 Medio Sólido De Mantención (Pgy- Agar)

Nutriente Extracto de levadura Peptona Extracto de malta Agar

Concentración (g/l)

Peso (g)

3

0.15

5

0.25

3

0.15

20

1

 T: 30ºC, N: 150 rpm 

TABLA 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL)

 Medio Activación: TABLA 02: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (30 mL)

Nutriente Glucosa xilosa Extracto de levadura Extracto de malta Solución de sales

Concentración (g/l) 10 10

Peso (g) 0.3 0.3

3

0.09

5

0.15

5 ml/L

0.15 ml

T: 30ºC, N: 150 rpm

P á g i n a 39

LAB. ING. DE BIOPROCESOS

-

PRE INFORME 01

 Medio De Fermentación 

Para un volumen de medio: 30% - 40% del volumen del matraz.



Para una concentración final: 2 g/l

TABLA 03: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación 250 ml (75 ml – 30%)

Nutriente Glucosa Xilosa (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4-7H2O Solución de sales

Concentración (g/L) 1.5 3.85 3 2 1.1 5 ml/L

Peso (g) 0.375 0.9625 0.75 0.5 0.275 1.25 ml

Ajustar pH 4.5 T° 30°C, N 150 rpm

HALLANDO EL TIEMPO DE FERMENTACION X =μ Max∗t Xo

ln

( )

ln

( 0.22 )=0.301∗t

t=7.6 horas=7 horas ,36 min

5.3.

CALCULO PARA LA SOLUCIÓN TAMPÓN Diseño de medio: (N) (NH4)2SO4 PM = 132 g/mol

P á g i n a 40

LAB. ING. DE BIOPROCESOS

-

PRE INFORME 01

Requerimientos en biomasa: % C H O N

% 6.57 6.94 37.25 9.24

Hallando el rendimiento de nutriente en célula (

):

Hallando So:

Considerando: Sf = 0 Xf = 2 g/lt

Xo

0 g/lt

P á g i n a 41

LAB. ING. DE BIOPROCESOS

-

PRE INFORME 01

Con el (NH4)2SO4 produce a condiciones acidas:

Hallando la concentración de (NH4)2SO4:

Hallando la concentración de hidrógenos liberados: 1mol/lt (NH4)2SO4 9.9015x10-3 mol/lt (NH4)2SO4

2H+ X

X = 0.01980H+ Calculo para la preparación de la solución tampón

P á g i n a 42

LAB. ING. DE BIOPROCESOS

-

PRE INFORME 01

Acido: ácido cítrico Anhidro C6H8O7.H2O:

Peso molecular = 210 g/mol

Base: citrato de sodio anhidro: C6H5Na3O7.2H2O:

Peso molecular = 294 g/mol

Entonces tenemos:

. . . . .

(1)

. . . . .

(2)

De la ecuación (1):

. . . . . (3) P á g i n a 43

LAB. ING. DE BIOPROCESOS

-

PRE INFORME 01

De la ecuación (2):

. . . . (4) Desarrollando la ecuación (4):

De (3) tenemos:

Por lo tanto:

Se preparara medio litro de solución. Nota:

P á g i n a 44

LAB. ING. DE BIOPROCESOS

-

PRE INFORME 01

 Cuando el pH está por debajo de 4.5 se agrega Hidróxido de sodio. 

Cuando el pH está por encima de 4.5 se agrega Ácido clorhídrico.

P á g i n a 45