PREINFORME-C1 (1)

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

TÍTULO: INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES EMPLEANDO UNA Pi chia st sti pi ti s NRRL Y-7124, USANDO XILOSA COMO FUENTE DE CEPA DE Pichia

CARBONO ALUMNOS:

Arroyo Lozano Junior Yorkei Huincho Aquiño Sonia Marisol Luera Dominguez Royder Santos Urrutia Vega Nataly Vásquez Villacorta Nelly Sofía

CURSO:

Laboratorio de Ingeniería de Bioprocesos

DOCENTE: Ing. Augusto Castillo Calderón NUEVO CHIMBOTE –  PERÚ  PERÚ 2017

ÍNDICE I.

OBJETIVOS .......................................... ................................................................ ............................................ ............................................ ...................... 2

II.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ....................................................... ............................................................. ....... 3

III.

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS  ...................................  ................................... 23

IV.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS  .................................. ................................. 26

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIBLIOGRÁFICAS  ........................................................... ............................................................... ..... 28 VI.

ANEXOS ............................................ .................................................................. ............................................ .......................................... .................... 29

1

PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO TÍTULO:

«INGENIERÍA

DEL

CULTIVO

CELULAR

POR

LOTES

chi a st sti pi ti s NRRL Y-7124, USANDO XILOSA EMPLEANDO UNA CEPA DE Pi chi

COMO FUENTE DE CARBONO»

I.

OBJETIVOS 1.1 Generales: 

Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes l otes en matraces, empleando una cepa de  Pichia stipitis  NRRL Y  –  7124,   7124, evaluándose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad de agitación en la cinética de crecimiento y la producción de etanol.



Determinar los parámetros cinéticos de la cepa  Pichia stipitis  NRRL Y 7124.

1.2 Específicos: 

Diseñar el medio líquido de cultivo.



Activación celular y desarrollo del inóculo.



Determinar la cinética de crecimiento de la l a biomasa.



Determinar la cinética de consumo de la fuente de carbono.



Determinar la cinética de producción de Etanol.



Determinar el

,  y los rendimientos r endimientos del nutriente limitante en células

y en etanol, además de las respectivas productividades en células y en etanol. 

Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cinética de crecimiento. 2

II.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL Antes de iniciar con el desarrollo experimental del cultivo del microorganismo, es importante recalcar, cuál será la metodología experimental a utilizar, a fin de evitar problemas y/o errores experimentales, los mismos que podrían darse en: las técnicas asépticas, en la obtención de cultivos puros, en la preparación de los medios de cultivo, en las tomas de muestra, en el crecimiento del microorganismo, entre otros factores. Es necesario recordar que, cualquier medio de cultivo de levadura debe  proporcionar los requerimientos nutritivos básicos, que incluyen: una fuente de carbono, agua, una fuente de nitrógeno, fósforo, azufre, y varios minerales, como el hierro, magnesio, cloro, entre otros. A este tipo de medio de cultivo se llama definido o sintético, porque se conoce exactamente su composición química. Sin embargo, en el trabajo de laboratorio rutinario, a menudo se emplean también medios complejos. Por ejemplo, el extracto de levaduras y las peptonas (proteínas hidrolizadas). Estos materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos; y una mezcla de cofactores, como por ejemplo las vitaminas. Un caldo de cultivo es un medio líquido en el que los componentes se disuelven simplemente en agua destilada. La adición de agar (un carbohidrato complejo extraído de algas marinas da lugar a un medio sólido). El agar es un agente solidificante ideal para los medios microbiológicos por sus propiedades reológicas y porque no posee ningún ni ngún valor nutritivo para la inmensa mayoría de bacterias y hongos. El agar sólido funde entre 90  –  100°C,  100°C, y se solidifica a unos 42°C.

3

2.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO A la hora de diseñar un medio de cultivo no solo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir.

Para la formulación del diseño de cultivo se tiene en cuenta los siguientes requerimientos nutricionales de la  Pichia stipitis  NRRL Y  –  7124.

 Macronutri entes

:

C, N, Mg, S, K y P

 Mi cronutri entes

:

Ca, Cl, Zn, Fe, Cu Co, B

:

4.5

 pH 

2.1.1. Estado: Medio líquido 2.1.2. Volumen del medio: 30  –  40 % del volumen del fermentador 2.1.3. Temperatura:  30°C 2.1.4. Velocidad de Agitación:  240 rpm en shaker. 2.1.5. pH: 4.5 2.1.6. Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de cultivo definido.

Fuente de carbono Xilosa y energía Fuente de N

Sulfato de amonio

Fuente de Mg y S

Sulfato de magnesio heptahidratado

Fuente de K, P

Fosfato diácido de potasio

4

 () .7 

2.1.7. Solución de sales concentradas Fuente de Ca

Cloruro de calcio dihidratado

Fuente de Zn

Óxido de zinc

Fuente de Fe

Sulfato ferroso heptahidratado

Fuente de Cu

Sulfato de cobre pentahidratado

Fuente de Co

Cloruro de cobalto hexahidratado

Fuente de B

Ácido bórico

Fuente de Cl

Ácido clorhídrico

.  .7 .5 .6  

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y FERMENTACIÓN PARA Pi chia stipitis NRRL Y –  7124 PARA LA PRODUCCIÓN DE ETANOL  Medio de Mantención:

Tabla 1 Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL)

NUTRIENTE

PESO (g) CONCENTRACIÓN (g/L) PARA 0.05L

Extracto de Levadura

3

0.15

Peptona

5

0.25

Extracto de Malta

3

0.15

Agar

20

1

5

 Medio de Activación:

Tabla 2 Concentración de Nutrientes para un medio de activación (20 mL)

NUTRIENTE

CONCENTRACIÓN (g/L)

Xilosa

10

PESO (g) PARA 0.02L 0.20

Extracto de

3

0.06

Extracto de malta

5

0.10

Solución de sales

5(mL/L)

levadura

 Medio de Fermentación:

Tabla 3 Concentración de Nutrientes para un medio de fermentación (200mL)

(Para un volumen de medio = 40% del volumen del matraz) (Volumen del matraz=500 mL) (Para una concentración celular final = 2 g/L)

NUTRIENTE

CONCENTRACIÓN (g/L) 14

PESO (g) PARA 0.200 L 2.80

Extracto de levadura

3

0.60

()  .

3

0.60

2

0.40

1.1

0.22

Xilosa

Solución de sales

5ml/L

Tampón citrato Ph 4.5

6

Tabla 4 Composición del medio mínimo de cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124 para un crecimiento en biomasa de 2.0g/L

ELEMENTO

Compuesto

Fórmula

% en célula

% en compuesto

YX/S (g/g)

S0 (g/L)

S’0 (g/L)

C5H10O5

46.57

40

0.52

3.85

3.85

(NH4)2SO4

9.24

21.21

2.30

0.87

1.305

C

Xilosa

 N

Sulfato de amonio

Mg

Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O

0.30

9.76

32.53

0.07

0.105

S

Sulfato de amonio

(NH4)2SO4

0.13

24.24

186.46

0.01

0.015

K

Fosfato diácido de potasio

KH2PO4 

2.50

28.68

11.47

0.17

0.255

P

Fosfato diácido de potasio

KH2PO4 

1.70

22.79

13.41

0.15

0.225

Solución de sales concentradas Tampón citrato; pH=4.5  Nota. El procedimiento de obtención de los datos de la presente tabla se encuentra en

los anexos.

7

Tabla 5 Solución de sales concentradas (100 veces) para cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124 en base a su crecimiento de 2.0g/l

% en células

% en compuesto

 ()

CaCl2.2H2O

0.20

27.40

137

1.460

2.190

Ácido clorhídrico

HCl

0.01

97.22

9722

0.020

0.031

Zn

Óxido de zinc

ZnO

0.01

80.25

8025

0.025

0.037

Fe

Sulfato ferroso heptahidratado

FeSO4.7H2O

0.255

21.70

85.01

2.325

3.529

Cu

Sulfato de cobre pentahidratado

CuSO4.5H2O

0.01

25.30

2530

0.079

0.119

Co

Cloruro de cobalto hexahidratado

CoCl2.6H2O

0.01

24.89

2489

0.080

0.120

B

Ácido bórico

H3BO3

0.01

17.74

1774

0.113

0.169

ELEMENTO

Compuesto

Fórmula

Ca

Cloruro de calcio dihidratado

Cl

 Nota. El procedimiento de obtención de los datos de la presente tabla se encuentra en

los anexos.

8

S0 (g/L)

S’0

(g/L)

2.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 2.2.1. Preparación del Medio de Mantención, según la Tabla 1, para el cultivo de Pi chia stipitis NRRL Y –  7124, para la producción de etanol. 

Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición del medio de mantención para  Pichia stipitis NRRL Y  –  7124.



Luego, de acuerdo a la Tabla 1 anterior se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, en la balanza analítica.



Medir en un vaso de precipitados primeramente con agua destilada para diluir todos los compuestos pesados anteriormente.



Continuar agregando agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se requiere.



Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.



Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente taparlos.



Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a presión,  previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.



Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilización.



Ajustar las tapas de los tubos estando estos aún dentro de la olla, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

9

Figura 1. Diagrama de flujo de la preparación del Medio de Mantención

Siembra en Medio de Mantención: -

-

Materiales y equipos a utilizar:  Asa bacteriológica 

Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M. O.



Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

Procedimiento: - Esterilizar los materiales y equipos a utilizar. - Colocar el asa bacteriológica en el mechero hasta que se torne roja, luego enfriar. - Flamear la boca del tubo de ensayo con el agar preparado previamente y con el asa extraer la cepa. - Sembrar en la superficie realizando la mayor cantidad de estrías en la superficie. - Tapar el tubo de ensayo y repetir el mismo procedimiento con los demás tubos. - Incubar a 28°C por 24  –  48 horas. 10

2.2.2. Preparación del Medio de Activación, según la Tabla 2, para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y –  7124, para la producción de etanol. 

Pesar los componentes descritos en la Tabla 2.



Se esterilizan por separado el extracto de levadura y extracto de mal en un tubo de ensayo (hasta 4 ml con agua destilada), la xilosa en un matraz de 125 ml (con 17ml. de agua destilada); esto para evitar la reacción entre estos dos componentes; y por último las sales en otro tubo de ensayo (hasta 2.925 ml)



Disolver por separado los componentes. Tener listo el volumen de sales.



Con la ayuda de una micropipeta, agregar las sales minerales al matraz que contiene el extracto de levadura.



Esterilizar a 121ºC por 15 minutos; mezclar con los demás componentes en un ambiente aséptico, para evitar la contaminación.



Previamente a la esterilización ajustar el pH a 4.5.

11

Figura 2. Diagrama de flujo de la preparación del Medio de Activación

Activación de la Cepa: -

Materiales y equipos:  Matraz de 125 ml  Algodón  Gasa  Agua destilada  Asa bacteriológica  Shaker  Mechero Bunsen, trípode y rejilla

-

Procedimiento: - Esterilizar el asa bacteriológica y el matraz con la flama del mechero. - Enfriar el asa. - Extraer con el asa la cepa de los tubos de resiembra preparados. - Inocular los 30 ml de medio de mantención preparados. - Tapar con un tampón de algodón y gasa. - Llevar al shaker a 28°C y 220rpm por 24 horas. -  Notar el desarrollo y crecimiento en biomasa por la turbidez del medio.

2.2.3. Preparación del Medio de Fermentación, según la Tabla 3, para el cultivo de Pi chia stipitis NRRL Y –  7124, para la producción de etanol. 

Pesar los componentes descritos en la Tabla 3



Disolver completamente cada compuesto con agua destilada de la siguiente manera: 

Xilosa en un matraz de 0.5 L con 80 ml de agua destilada



(NH4)2SO4 en un matraz con 50 ml. de agua destilada



Solución de sales, KH 2PO4, (MgSO4).7H2O en un matraz con 50 ml de agua destilada



Regular el pH de la solución de xilosa 4.5



Esterilizar las diluciones por separado



Terminada la esterilización dejar enfriar y guardar en refrigeración hasta su posterior uso 12

Figura 3. Diagrama de flujo de la preparación del Medio de Fermentación

Preparación de la Solución de Sales:  Según Tabla 5

Figura 4. Diagrama de flujo de la preparación de la Solución de Sales

13

Fermentación de la Cepa: Materiales y equipos  

Matraz de 0.5 L conteniendo el medio de fermentación  pH-metro



Gasa y algodón



Tubos de ensayo

Procedimiento:

-

Esterilizar los materiales a utilizar. En un matraz de 0.5L, que contiene 180 ml de medio definido, añadir los 20 ml de caldo (medio+biomasa) preparados  previamente.

-

Mezclar y tomar 5 ml para el análisis del biomasa y sustrato inicial. Tapar con un tapón de gasa y algodón. Llevar al shaker a 30°C y 240rpm. Recoger y analizar muestras de 5 ml cada hora por 24 horas.

2.3. RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SÓLIDO) 

Para la resiembra se seguirán las técnicas de asepsia utilizando un mechero que mantenga el ambiente de trabajo estéril.



El asa bacteriológica se someterá al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo vivo.



Se debe dejar enfriar por unos segundos; del tubo de ensayo que contenía las células desarrolladas en medio sólido, se extrae una azada, se flamea el tubo  para cerrarlo.



El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar).



La azada se coloca en el tubo desde adentro hacia fuera.



Se llevan a la incubadora a 30 º C durante 48 horas.

14

2.4. CULTIVO DEL MICROORGANISMO Después de la inoculación de una porción de medio con unas pocas células, transcurre un período de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metabólica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de  poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanzó una velocidad constante de crecimiento se dice que está en la fase exponencial debido a que el número de células se puede expresar como función de 2 n, donde n es el número de ciclos de duplicación experimentado por la población.

2.5. ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO Se llevará a cabo la activación del microorganismo, bajo estrictas normas de asepsia, siguiendo el protocolo establecido por el laboratorio:

-

Para la inoculación partimos con la cepa incubada en medio sólido  Pichia  stipitis NRRL Y  –  7124.

-

Se toma una azada y se inocula en el matraz con los 20 ml del medio de activación

-

Se tapa el tubo con un tapón de gasa y algodón. Se lleva al Shaker a 240 rpm, Tº = 30 ºC y un t = 12min hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.

-

El procedimiento de inoculación se hará por duplicado es decir 2 azadas.

2.6. INOCULACIÓN AL MEDIO DE FERMENTACIÓN 

Inocular los 20 ml de caldo (medio rico + biomasa) a un matraz de 0.5L conteniendo 180 ml de medio definido. A partir de este paso se determinará la cinética de crecimiento de la biomasa.



Inmediatamente después, se extrae una muestra de 5 ml del caldo y medir X 0 y S0 con D.O.



Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido del mechero. 15



La toma de muestras se inicia desde la dilución del medio de activación en el medio de fermentación.



Estas se realizarán cada hora y media para la primera muestra y posteriormente cada hora de la siguiente manera: 

Se extrae 5 mL del medio de cultivo, 3 mL se le agrega al tubo del espectrofotómetro y el resto se le agrego al tubo de centrifugado.



Se mide su absorbancia a 640 nm y pH; luego se devuelve al tubo de centrifugado para completar los 5 ml y se centrifuga a la máxima velocidad  por 20 minutos; el sobrenadante se vierte a los viales y se guarda en el refrigerador con el fin de después determinar el consumo de sustrato.

2.7. MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL 2.7.1. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) La preparación del reactivo DNS requiere de lo siguiente: 

10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)



200 ml/l de NaOH 2N



300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para  posteriormente aforar hasta un litro.

16

Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra:

1.- Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. 2.- Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar. 3.- Se añaden 10 volúmenes de agua destilada. 4.- Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. 5.- La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

2.7.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR DENSIDAD ÓPTICA (D. O.) El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente  por espectrofotometría a 640 nm. Para esta determinación es necesario que  previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por  peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

17

1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 5000 rpm durante 20 minutos. 2. Se elimina el sobrenadante y se re-suspende el centrifugado con agua destilada. 3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación. 4. Se elimina el sobrenadante, se re-disuelve el precipitado y se seca en la estufa a 80°C hasta peso constante.

2.7.3. DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA. Materiales y equipos       

Matraz de 0.5 L conteniendo el medio de fermentación Espectrofotómetro  pHmetro Gasa y algodón Centrifuga Tubos de ensayo Capachos de papel aluminio

Procedimiento: Al inicio y cada hora por 10 horas se realizará lo siguiente ˂ 5ml del medio de cultivo ˃

EXTRAER

˂ 3ml para el

tubo de espectrofotómetro y el resto se le agregó al tubo de centrifugado. ˃

SEPARAR

MEDIR

˂ Absorbancia a 640nm y pH ˃ 18

COMPLETAR

˂ 5ml en el

CENTRIFUGAR

tubo de centrifugado, se devuelve. ˃

˂ A la máxima velocidad por

˂ El sobrenadante en viales y refrigerador ˃

VERTER Y GUARDAR

20 minutos ˃

ponerlos en

Utilizando la ecuación ln(X/ X 0) = μt, se determinan distintos valores de μ.

Tabular Si vs. μi Con la ecuación 1/ μ = 1/μm + (K S/ μm) 1/S, se grafica. La intercepción con el eje y será el valor de 1/μm siendo su inversa el valor de μm, además la pendiente m= K S/ μm conocido anteriormente μm determinamos K S.

dX / dt = μm X ……………….( ) X = X0 e μmt

2.7.4. DETERMINACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES: a) Reactivos y soluciones etanol  propanol

b) Procedimiento: Preparación de 50 ml de solución patrón de etanol a 6 g/l Concentración de solución patrón de etanol = 6 g/l Volumen solución patrón etanol a 6 g/l =50 ml Volumen solución etanol 99.7%=0.3809 19

Preparación de 50 ml de solución patrón de propanol a 4 g/l Concentración de solución patrón propanol = 4 g/l. Volumen solución patrón etanol a 4 g/l =50 ml Volumen solución etanol 99.5% = 0.2487 ml

Estándar interno Análisis cromatográfico a. Instalar una columna capilar RTx-20 utilizando férulas de grafico para asegurar conexiones herméticas.

b. Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula de gas portador (helio) y regular cuidadosamente su flujo.

c. Ajustar las condiciones cromatográficas. Concentración (g/l)  3  2.1 1.2 0.6 0

Vol. E tanol (ml) 5 3.5 2 1 0

Vol. Propanol (ml) 5 5 5 5 5

Vol. H  2O (ml) 0 1.5 3 4 5

d. Abrir las válvulas de otros gases, primero el aire luego el hidrogeno. e. Con una solución de jabón o detergente. Verificar fugas de gases en todas las conexiones.

f. Encender el detector y obtener una línea de base estable. Condiciones cromatográficas Tº inicial del horno

55 ºC

Tº fi nal del horno

120 ºC

Ti empo inicial

3 min

Tiempo final

2 min 20

Velocidad de calentamiento

10 ºC/min (RATE= rampa)

Tº inyector

200 ºC

Volumen de inyección

1µl

 Modo de inyección

Split

Radio Split

300

Velocidad inicial

32.9 cm/seg

 Luego de establecidas las condiciones cromatográficas, se procede a la determinación de los parámetros de estudio

2.7.5. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS: Preparar 8 tubos de ensayo con diferentes concentraciones de xilosa; para ello, diluir y utilizar la curva de calibración para azúcares reductores, determinando así la concentración en cada matraz. Inocular los matraces con 1ml e incubar. Utilizando la curva de calibración determinar a cabo de tiempos determinados la concentración final de las células. Utilizando el modelo de Michaelis-Menten.

   = Determinamos los valores de



Tabular S vs .

     Con la ecuación: = m  s 





M

Conocido el M se determina Ks.

2.8. PROGRAMA DE MUESTREOS 21

graficar y con la pendiente determinar

CRECIMIENTO CELULAR: CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Plan de Muestreos y R egi s tro de Datos

Grupo: __________________________________ Día: ___ /___ / ___ Día de la experiencia: __________________________________ Microorganismo: _______________ Fuente Carbono: _______________ PH0: _______ T°C _______ N rpm _______

Nombre del N°

01

HORA

TIEMPO

Absorbancia

(Horas)

(640 nm)

0

alumno Todos

22

Observaciones

III.

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS Material Biológico: Cepa liofilizada de Pi chia stipitis NRRL Y-7124 

PREPARACIÓN DE SÓLIDO DE MANTENCIÓN: 





Materiales y Equipos: 

Balanza analítica



Matraz Erlenmeyer de 250 ml



Mechero Bunsen



Gradilla



6 Tubos de ensayo con tapas



Pipeta de 10 ml



Vaso de precipitado



Cocina a gas



Olla a presión



Varilla de vidrio



Guantes



Espátula

Reactivos y nutrientes: 

Agua destilada



Extracto de levadura



Peptona



Extracto de malta



Agar

PREPARACIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN: 

Materiales y Equipos: 

Balanza analítica



2 Matraces de 125 ml



Una probeta de 100ml



Micropipeta 23







Estufa



Algodón



Gasa



Varilla de vidrio



Espátula

Reactivos y nutrientes: 

Xilosa



Extracto de levadura



Solución de sales



Agua destilada



Alcohol

PREPARACIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN: 



Materiales y Equipos: 

Matraz de 500 ml



2 Matraces de 125 ml



Varilla de vidrio



Balanza analítica



Gasa y algodón



Olla a presión

Reactivos y nutrientes: 

Xilosa



(NH4)2SO4



KH2PO4



MgSO4.7H2O



Solución de sales



Extracto de Levadura



Agua destilada



Alcohol

24



INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN: 



Materiales y equipos 

Matraz de 125 ml



Algodón



Gasa



Agua destilada



Asa bacteriológica



Shaker



Mechero Bunsen



Trípode



Rejilla

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) 



Materiales y equipos 

Espectrofotómetro



Agitador magnético



Mechero Bunsen



Balanza analítica



Espátula



Papel aluminio - capachitos



2 vasos de precipitados de 1 litro



Matraz aforado de 1 litro



Pipeta



Gradilla

Materiales y equipos 

10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)



200 ml/l de NaOH 2N



300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado



Sacarosa estándar 25

IV.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS DESARROLLO DEL INÓCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

Pichia stipitis NRRL Y-7124

FECHA

ACTIVIDAD

02/05/17



Presentación del pre-informe.

05/05/17



Técnicas de asepsia, de esterilización de medios, materiales de vidrio y equipos.

12/05/17



Mantenimiento de cepas microbianas.



Preparación de reactivos y medios de mantención.



Resembrado de células.



Obtención de curvas de calibrado de los métodos analíticos.

19/05/17



Preparación de medios para el inóculo. Cultivo de medio rico.



Preparación de medios para la cinética celular microbiana.

26/05/17



Seguimiento de la cinética de cultivo celular  por lotes.

30/05/17



Presentación y sustentación del informe final.

26

PROGRAMACIÓN DE CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES: HORARIO

ACTIVIDAD -

INICIO

TÉRMINO

7:30 a.m.

8:00 a.m.

8:00 a.m.

8:10 a.m.

8:10 a.m.

11:10 a.m.

11:10 a.m.

11:30 a.m.

11:40 a.m.

7:40 p.m.

Preparación de materiales de trabajo para la inoculación en el medio de activación y medio de cultivo rico para la cinética de fermentación.

-

Inoculación de la levadura Pichia stipitis  NRRL Y-7124

desde la cepa en agar al medio de activación. -

Tiempo de referencia para que se lleve a cabo la activación del inoculo

en

el

medio

de

activación. -

Inoculación de medios para cinética de fermentación.

-

Seguimiento de la cinética de fermentación

a

cada

hora

(registro de datos)

27

V.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap (2009)  Biología de los microorganismos (2009), Duodécima Edición, Editorial Pearson.

Joao Paulo A. Silva, Solange I. Mussatto, Ines c. Roberto, José a. Teixeira, (2011)  Fermentation médium and oxygen transfer conditions that maximize the  xylose conversión to etanol by Pichia stipitis.

Castillo, A. (2016) Cinética de procesos fermentativos, módulo de clase UNS.

Castillo, A. (2016)  Balance de materia, diseños de medios y evaluación en bioprocesos, módulo de clase UNS.

28

VI.

ANEXOS CÁLCULOS PARA EL DISEÑO DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN

% del elemento en célula

CH.O.N. C: 12 = 12  H: 1 ×1.79 = 1.79 O: 16 ×0.60=9.60 N: 14 ×0.17=2.38 ̅25.77

Fórmula del microorganismo: Peso molecular:

Peso molecular: 25.77 g/mol

% de Carbono en célula

% de Nitrógeno en célula

25.77⟶100% 12⟶  = 12×100 25.77 =.%

25.77⟶100% 2.38⟶  = 2.38×100 25.77 =.%

El valor del resto de elementos se sacó de la siguiente tabla:

Tabla 6 Composición química de las células microbianas

ELEMENTO Carbono Hidrógeno Oxígeno Nitrógeno Magnesio Fósforo Azufre Calcio Potasio Hierro

% EN PESO, BASE SECA BACTERIAS LEVADURAS MOHOS 46 - 53 46-51 45 - 55 6.5 - 7.5 6-8 8 - 12 18 - 32 28-35 18 - 24 10 - 14 6-10 3-7 0.1 - 0.5 0.1-0.5 0.1 - 0.3 2.0 - 3.0 0.8-2.6 0.4 - 4.5 0.1 - 1.0 0.01-0.24 0.1 - 0.5 0.01 - 1.1 0.1-0.3 0.1 - 1.4 1.0 - 4.5 1.0-4.0 0.2 - 2.5 0.02  –  0.2 0.01-0.5 0.1 - 0.2 29

COMPUESTO Proteínas Carbohidratos Lípidos Ácidos nucleicos Cenizas  Nota.  Recuperado

45-60 6-15 5-10 15-25 4-10

35-45 30-45 5-10 5-15 4-10

25 - 40 40 - 55 5 - 10 2 - 10 4 - 10

de  Balance de materia, diseño de medios y evaluación de cultivos en

 Bioprocesos. (Castillo, A., 2016)

% de Magnesio en célula:

.+. =0.30% 

.+. =0.13% 

% de Azufre en célula:

% de Potasio en célula:

.+. =2.50% 

% de Fósforo en célula:

.+. =1.70% 

% de Calcio en célula:

.+. =0.20% 

% de Hierro en célula:

.+. =0.255% 

Para el resto de elementos, tales como: Cl, Zn, Cu, Co, B; se consideró un  porcentaje del elemento en célula de 0.01%.

30

% del elemento en compuesto: Xilosa Fórmula:

% de carbono

CHO

150⟶100% 60⟶  = 60×100 150 =%

Peso molecular:

C: 12 ×5 =60  H: 1 ×10 = 10 O: 16 ×5 =80 ̅150 /

Sulfato de amonio Fórmula:

()

% de nitrógeno

132⟶100% 28⟶  = 28×100 132 =.%

Peso molecular:

C: 14 ×2 = 28  H: 1 ×8 = 8 S: 32 = 32 O: 16 ×4 = 64 ̅132 /

Sulfato de magnesio heptahidratado Fórmula:

% de magnesio

.7

246⟶100% 24⟶  = 24×100 246 =.%

Peso molecular:

Mg: 24 = 24  S: 32 = 32 O: 16 ×11 = 176 H: 1 ×14 = 14 ̅246 / 31

O: 16 ×4 = 64 ̅132 / Sulfato de amonio Fórmula:

()

% de azufre

132⟶100% 32⟶  = 32×100 132 =.%

Peso molecular:

C: 14 ×2 =28  H: 1 ×8 = 8 S: 32 = 32 Fosfato diácido de potasio Fórmula:



% de potasio

136⟶100% 39⟶  = 39×100 136 =.%

Peso molecular:

K: 39 = 39  H: 1 ×2 = 2 P: 31 = 31 O: 16 ×4=64 ̅136 / Fosfato diácido de potasio Fórmula:



% de potasio

136⟶100% 31⟶  = 31×100 136 =.%

Peso molecular:

K: 39 = 39  H: 1 ×2 = 2 P: 31 = 31 O: 16 ×4=64 ̅136 / 32

Sales: 1) Ca: cloruro de calcio dihidratado CaCl 2.2H2O

al. =146  %COMPUESTO: 146→100% 40→   = .%

2) Zn: óxido de zinc ZnO

Zn = 81  %COMPUESTO: 81→100% 65→   = .%

3) Fe: sulfato ferroso heptahidratado FeSO 4.7H2O

Fe. =278  %COMPUESTO: 278→100% 56→   = .% 4) Cu: sulfato de cobre pentahidratado CuSO .5H O u. =249  %COMPUESTO: 249→100% 63→   = .% 5) Co: cloruro de cobalto hexahidratado CoCl .6H O ol. =237  %COMPUESTO: 237→100% 59→   = .% 33

4

2

2

2

6) B: ácido bórico H 3BO3

B = 62  %COMPUESTO: 62→100% 11→   = .% 7) Cl: ácido clorhídrico HCl  l = 36  %COMPUESTO: 36→100% 35→   = .% Cálculo de los rendimientos:

  × / = %%   

  / = %%   

Solo para la fuente de carbono y energía:

f: metabolismo aerobio (0.5-0.6) metabolismo anaerobio (aprox. 0.1)

/ = 28.2.568 =.

Carbono:

/ = 46.4057 ×0.6=.

 Nitrógeno:

/ = 21.9.2241 =.

Magnesio:

/ = 9.0.736 =.

Azufre:

/ = 24.0.1234 =.

Potasio:

34

/ = 22.1.779 =.

Fósforo:

Sales:

1) Ca: cloruro de calcio dihidratado CaCl 2.2H2O

⁄ = 27.0.24 = 

2) Zn: óxido de zinc ZnO

⁄ = 80.0.0215 = 

3) Fe: sulfato ferroso heptahidratado FeSO 4.7H2O

⁄ = 0.21.2557 =.  4) Cu: sulfato de cobre pentahidratado CuSO 4.5H2O

3 =  ⁄ = 25. 0.01

5) Co: cloruro de cobalto hexahidratado CoCl 2.6H2O

⁄ = 24.0.0819 = 

6) B: ácido bórico H3BO3

⁄ = 17.0.0714 = 

7) Cl: ácido clorhídrico HCl

⁄ = 97.0.0212 = 

35

Cálculo de la concentración de sustrato inicial:

 =   (/−) Donde:

 ⟶ 0

y

  ⟶ 0

;

  = 2 /

Carbono:

 = 0 (2−0) 0.52  =.

 Nitrógeno:

 = 0 (2−0) 2.30  =.

Magnesio:

 = 0 (2−0) 32.53  =.

Azufre:

 = 0 (2−0) 186.46  =.

Potasio:

 = 0 (2−0) 11.47  =.

Fósforo:

 = 0 (2−0) 13.41  =.

36

Nutriente limitante:

′ =  × Donde:

 = 1, cuando el nutriente es limitante =1.5−2, cuando el nutriente no es limitante Carbono:

′ =3.85×1=./  Nitrógeno:

′ =0.87×1.5=./ Magnesio:

′ =0.07×1.5=./ Azufre:

′ =0.01×1.5=./ Potasio:

′ =0.17×1.5=./ Fósforo:

′ =0.15×1.5=./ 37

Determinación de la concentración de sustrato inicial

′ = ∆/

   =/ ;   =/ ∆=/ →

1. Ca

′ = 1372 1.5100=./

2. Cl

2 1.5100=./ ′ = 9722

3. Zn

2 1.5100=./ ′ = 8025

4. Fe

′ = 85.201 1.5100=./

5. Cu

2 1.5100=./ ′ = 2530

6. Co

2 1.5100=./ ′ = 2489

7. B

2 1.5100=./ ′ = 1774

38

"′" de las sales: