Pre Inf

Universidad Nacional del Santa Laboratorio de Bioprocesos

E.A.P. Ing. Agroindustrial Pre Informe Nº 02

FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL TITULO: “DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES”

PROFESOR:  AUGUSTO CASTILLO CALDERON CALDERON

GRUPO: B-3

CURSO: LABORATORIO DE BIOPROCESOS

ALUMNOS:     

ESCOBEDO FLORES ALEX JESUS GUTIERREZ DIANA LÓPEZ ZAMORA MARILEYLA MORALES CHORRES CYNTHIA VALVERDE LÓPEZ EDISON

NVO CHIMBOTE, MAYO2016

1

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CONTENIDO 1 I.

OBJETIVOS: ............................................ .................................................................. ............................................ ........................................ .................. 3

1.1. Objetivos Generales: 1.2. Objetivos Específicos: II.

3 3

METODOLOGIA EXPERIMENTAL:.......................................... ................................................................ ...................... 4

2.1) SOLIDO DE MANTENCION 2.2) Medio Activación: 2.3) Medio para fermentación:

5 6 8

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS: ..................................... ..................................... 12

1.

Preparación medio solido del de mantención

12

3.

Medio de activación

13

4.

Medio de fermentación

14

IV. CRONOGRAMA ......................................... ............................................................... ............................................. ................................... ............ 15 V.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: ....................................... ............................................................. ........................ 16

VI. ANEXOS: .......................................... ................................................................. ............................................. ............................................. ....................... 17

1) Referencias de composición de medio de mantención, activación y cultivo para  Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la producción de etanol. 17 2)

Cálculo de la velocidad de aireación específica: “ vvm” vvm”

17

3)

Cálculo del flujo de aireación recomendado

19

4)

Formato del plan de muestreo y registro de datos

20

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DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES I.

OBJETIVOS:

1.1.

Objetivos Generales:  

Diseñar y realizar una experiencia de fermentación en cultivo celular por lote de Pichia stipitis NRRL Y-7124 en un medio simulado de hidrolizado de cascarilla de arroz, a fin de producir etanol en condiciones de micro aireación, midiendo el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno a distintas condiciones de aireación y agitación.

1.2.

Objetivos Específicos: 

Identificar y describir las partes, accesorios y geometría del fermentador de laboratorio, conocimiento de su operación, esterilización, carga y descarga y toma de muestras.



Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automático, así como la calibración de los sensores.



Activación celular y desarrollo del inoculo.



Puesta en marcha del cultivo por lote CL. En el cultivo por lote determinar µmax y Y x/s. Asimismo determinar el Kla por el método dinámico de Humphry y correlacionar los resultados.



Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono, oxígeno disuelto y pH después del tiempo total de fermentación en el biorreactor.

3

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II.

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METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

Tabla 1: Referencia de composición de medios de mantención, activación y cultivo para Pic hia s tipitis  Y- 7124 TABLA N°01

MEDIO

NUTRIENTE

CONCENTRACION (g/l)

Solido de mantención

Extracto de levadura

3

Peptona

5

Extracto de malta

3

 Agar

20

Glucosa

5

Extracto de levadura.

3

Extracto de malta

5

Solución de sales

5 ml/L

Activación

N = 220 rpm

Fermentación

Glucosa

10

Xilosa

3

Extracto de levadura

3

KH2PO4

2

(NH4)2SO4

3

MgSO4.7H2O

1.1

Solución de sales

5 ml/L

Tampón citrato

100ml/L

Ph 4.5 0.04M

4

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2.1)

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SOLIDO DE MANTENCION 

Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para Pi chia s tipitis  Y- 7124.

 

Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.

MEDIR

En una probeta graduada de 50 ml de agua destilada.

Adicionando a ua destilada. MEZCLAR

Todos los componentes en un matraz Erlenmeyer

CALENTAR

Con el mechero de bunsen la mezcla disuelta en el matraz, agitando con una varilla de vidrio, hasta aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de a 1 a 2 min.

PREPARAR

8 tubos de ensayo con tapa y en caliente, inmediatamente taparlos.

COLOCAR

Los tubos en un vaso precipitado, y llevarlos a la olla a presión,  previamente aflojado las tapas, para  permitir el intercambio de gases.

Adicionar 6 ml de mezcla a cada

CALENTAR

AJUSTAR

5

Hasta que la temperatura alcance los 121°C y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos. Finalizando la esterilización. Las tapas de los tubos, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

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Luego preparamos nuestra área de trabajo, desinfectando con alcohol. para tener un área estéril prendemos el mechero cinco minutos antes de realizar la resiembra con el Pi chia s tipitis  Y- 7124 Los tubos de ensayo cerca del mechero de  bunsen, flameando para evitar la contaminación, teniendo la aza  bacteriológica calentando al rojo vivo.

ABRIR

2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar, flameamos y cerramos el tubo y así los 8 tubos con agar.

SACAR

2.2) Medio Activación:

TABLA 02: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (15 ml y 100ml)

Nutriente

Concentración

Peso

(g/L)

15ml

- Peso - 100ml (gr)

(gr) Glucosa

5

0.075

0.5

Extracto de levadura

3

0.045

0.3

Extracto de malta

5

0.075

0.5

Solución de sales

5 ml/L

0.075

0.5

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DIAAGRAMA Nº1 preparación de medio de activación

Todos los

MEDIR

Matraz Erlenmeyer de 125 ml

PESAR

COLOCAR

En cada tubo y adicionar agua para disolver

ESTERELIZAR MEDIR

CALENTAR AGITAR

EL pH 6.0 En un mechero de Bunsen la mezcla para evitar Constantemente con una varilla por un minuto (aparición de la primera burbuja)

DIAGRAMA Nº 02 RESIEMBRA SOLIDO – LIQUIDO La

AGREGAMOS

En el matraz de 500ml

INOCULAMOS

Tomamos una azada e inoculamos en el matraz con el medio de activación

COLOCAMOS

En el Shaker a T= 30º - 180 rpm

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2.3) Medio para fermentación: TABLA 03: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación (3000 ml)

nutriente

Concentración – 1L

Concentración – 3L

Glucosa

10

30

Xilosa

3

9

Extracto de levadura

3

9

KH2PO4

2

6

(NH4)2SO4

3

9

MgSO4.7H2O

1.1

3.3

Solución de sales

5 ml/L

15

Tampón citrato

100ml/L

300

Condiciones de asepsia Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo. 1.

Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del grupo (A).

2.

Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol 96°

3.

Encender el mechero Bunsen.

4.

Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapón de algodón, aflojar un poco de manera que no esté muy apretado.

5.

Flamear en el mechero Bunsen.

6.

Retirar una tapa con el meñique, mientras sostienes los matraces. Nunca poner las tapas sobre la mesa.

7. 

Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior durante las manipulaciones.

8.

Los matraces abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo de contaminación sea mínimo.

9.

Sembrar en el matraz estéril el inoculo.

8

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10. De

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nuevo flamea las bocas de los matraces y tápalos de nuevo.

 Asegúrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que contienen el caldo sembrado. 11. Flamea los tapones antes de que los coloques en

los matraces.

Preparación de medio de fermentación, según la Tabla Nº .03. Para el cultivo de Pi chia s tipitis  Y- 7124 Materiales  

Matraces

 

Espectrofotómetro



Varilla de vidrio

Instrumentos e Equipos 

Balanza analítica.

 

Biostato

Reactivos 

Extracto de levadura

 

Glucosa-xilosa



(NH4)2SO4



KH2PO4

 

MgSO4.7H2O

9

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DIAGRAMA Nº03 preparación de medio de fermentación Los componentes

PESAR

DILUIMOS

REGULAR

ESTERELIZAR

Cada componente con agua destilada - Extracto de levadura en un matraz de 2L con agua destilada - (NH4)2 SO4 , KH2 PO4 , (MgSO4).7H2O en un matraz con agua destilada

El pH de 4.5

Las disoluciones separado

por

ENFRIAR

MEZCLAR

COLOCAMOS

10

El extracto extracto de yacon de levaura y adicionary el inoculo adicionar el inoculo del medio del medio de activación de activación En el Shaker a T= 30º - 220 rpm

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DIAGRAMA N: 04- Procedimiento para el fermentador en el medio de fermentación CULTIVAMOS

Los 2L de medio de fermentación en el biostat -

APLICAMOS

El método Dinámico durante 30 horas al caldo de cultivo

OBSERVAR

En las primeras 10 horas su crecimiento (KLa)

TOMAR

Lecturas de de oxígeno disuelto a cada intervalo (fase gasificada y fase de corte aire)

GRAFICAR

11

En una hoja de Excel para las gráficas de regresión y correlación

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III.

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MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

1. Preparación medio solido del de mantención

Materiales 

Pipetas de 10 ml.



Mechero Bunsen



Tubos de ensayo



Espátula

con tapas



Guantes.



Varilla de vidrio



Capachos de papel



Matraz Erlenmeyer



Vaso de precipitado



Probeta graduada

Instrumentos e Equipos 

Balanza analítica



Olla a presión

Reactivos 

Extracto de levadura.



Peptona.



Extracto de malta.

 

 Agar  Glucosa

12

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 2. R es iembra celular

Materiales  Aza bacteriológica Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O. Mecheros.  Alcohol. Instrumentos e Equipos Incubadora

 3. Medio de activación

Materiales Matraz de 125 ml.

Capachos de papel aluminio

2 tubos de ensayo con tapa

Mechero Bunsen, trípode y

Varilla de vidrio

rejilla.

Pipetas de 1, 5, y 10 ml Pinzas, espátula.  Algodón ,gasa Guantes

Instrumentos e Equipo Shaker 

pH metro

Balanza analítica

Olla a presión

13

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Reactivos o

Glucosa

o

MgSO4.7H2O (sigma).

o

Extracto de levadura

o

pH 4,5

o

Extraxto de malta

o

T 30ªC, N 220 rpm.

4. Medio de fermentaci ón

Materiales Matraz de Erlenmeyer 

Espectrofotómetro.

Matraces.

Varilla de vidrio.

Instrumentos e Equipos  

Biostato



Balanza analítica.

14

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IV.

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CRONOGRAMA MESES ACTIVIDADES

MAYO Miercoles 25

Presentacion del Pre - informe Reconocimiento del fermentador, accesorios y geometria del fermentador del laboratori, conocimiento de su operación.

Jueves 26

Martes 31

Jueves 02

Viernes 03 Lunes 06

Martes 07

Miercoles 08

13-17

Martes 21

X

X

Preparacion y esterilizacion de medios de activacion para los inoculos de medio de fermentacion para el BIOSTAT Aplus. Determinar el Yx/s y Qx del CLA.

X

Inoculaciones (S/L, L/L )

X

Inoculacion del BIOSTAT-Aplus, medicion del Kla y seguimiento de cultivo. En el cultivo por lote determinar umax y Yx/s, asimismo determinar Kla por el metodo dinamico Humphry.

JUNIO Viernes 27

X

X

X

X

X

Seguimiento, descarga y limpieza del BIOSTAT-Aplus Determinacion de azucares reductores y proteinas

X

X

X

X

Presentacion del informe final.

X

15

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V.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:



http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar= quimicos http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKitsC.pdf. http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.sht  ml

 



QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica.

16

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VI.

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ANEXOS:

1) Referencias de composición de medio de mantención, activación y cultivo para Pi chia Stipitis NRRL Y-7124 para la producción de etanol.

Medio Sólido de mantención

 Activación

Nutriente Extracto de levadura Peptona Extracto de malta  Agar

Concentración (g/L) 3 5 3 20

Glucosa Extracto de levadura Extracto de malta Solución de sales

5 3 5 5 m/L

N: 220 rpm Glucosa Xilosa Extracto de levadura Fermentación

10 3 3 3 2 1.1 5 mL/L 100 /L

( )     . 7 

Solución de sales Tampón citrato

 pH 4.5 0.04M F uente: A. Castillo. 1994. Tesis M agí ster PUCV

2) Cálculo de la velocidad de aireación específica: “ vvm”

 = 2,03510−

   

Donde: NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno T: Temperatura en °K Ɛ: Eficiencia de Absorción

Los valores típicos de vvm: Laboratorio: 0,5 – 2.0 vvm  =     

17

(0.5  2.0  . ) / g O2 

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 DATOS A TENER EN CUENTA:

Consideramos: o

 = 1

o



o

 

= 0.1 (Eficiencia de absorción)

 μ máx

= 0.4984 h-1

Para determinar la biomasa producida △  = ⁄ ∗ (△ )

⁄ =

△ △

=

% .    % .   é

∗ ( )

F= 0.25: Factor de aireación para condiciones microareóbias.

C alculamos el rendimiento: ⁄ =

% .    % .   é

∗ ( ) =

40% 46.57%

∗ (0.25)

⁄ = 0.21473  ⁄

Sustrato en el hidrolizado de cascarilla de arroz   ΔS = 10 g/L de glucosa + 03 g/L de Xilosa  ΔS = 13 g/L de sustrato total

 Por lo tanto, calculamos la Biomasa generada (Δx):

△  = ⁄ (△ ) △  = (0.21473  ⁄ ) (13 /)

△  = 2.791497 / 18

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E ntonces reemplazamos datos para calcular la demanda de oxig eno (N  A ):

∗

  =



Valores: o

 μ máx

 = 1

o

o

= 0.4984 h-1  

  = 2.791497/

Entonces:  =

(0.4984) ∗ (2.791497) 1

  = .   ⁄. 

Velocidad de aeración especifica ( vvm ): Fórmula:

 = , −  = , −

 = 30∘  = 303∘     

(. ) ∗ ( ) . 

 = . −

3) Cálculo del flujo de aireación recomendado

 =

 ̇ ⟹ 

Dónde: Vvm = 0.85787 min -1 Volumen de fermentación VL= 2 L

 ̇ = (0.85787 ∗ 2) 19

 ̇ =  ∗ 

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 ̇ = .   / 4) Formato del plan de muestreo y registro de datos

CULTIVO CELULAR POR LOTESY MEDICIÓN DEL KLA Plan de Mues treos y R egis tro de Datos

Grupo: __________________________________ Día: ___ /___ / ___ Microorganismos: ___________________________ Fuente Carbono: ____________________________ Nombre Nª

HORA

TIEMPO

Abs.(640 nm)

OD

pH

del alumno

20

Observaciones

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