prak 5 dan 6

DEMONTRASI REKAYA GENETIKA BAKTERI

PRAKTIKUM V ISOLASI DAN PENENTUAN POPULASI BAKTERI DAN JAMUR DARI RIZOSFER, FILOSFER DAN SPERMOSFIR

 Tujuan Umum: 1. Memisahka Memisahkan n bakteri dan jamur jamur yang berasal berasal dari dari alam misalnya misalnya udara, udara, air, tanah, rizosfer, filosfer atau spermosfir, ataupun dari suatu susupensi yang mengandung beberapa jenis mikroba. 2. Mengisola Mengisolasi si suatu suatu isolate isolate (genus (genus / spesies) spesies) bakteri bakteri dan jamur jamur 3. Mendapatka Mendapatkan n biakan biakan murni murni yaitu suatu suatu kultur kultur murni murni yang yang hanya hanya terdiri terdiri atas atas satu jenis/ isolate isolate ( Genus/ Spesies) Spesies) bakteri dan jamur. jamur.  Teori Umum   Tan Tanam aman an dan dan juga juga bagi bagian an tana tanama man n tert terten entu tu meru merupa paka kan n habi habita tatt bagi bagi mikroorganisme. Hubungan mikroorganisme dengan tanaman dapat meng mengun untu tung ngka kan n maup maupun un meru merugi gika kan n tana tanama man. n. Bagi Bagian an dari dari tana tanama man n yang yang bera beraso sosi sias asii spes spesif ifik ik deng dengan an mikr mikroo oorg rgan anis isme me adal adalah ah rizo rizosf sfer er,, filo filosf sfer er dan dan spermosfer. Rizo Rizosf sfer er adal adalah ah zona zona kont kontak ak anta antara ra akar akar dan dan tana tanah h yang yang lang langsu sung ng mempengaruhi metabolisme. Zone ini mengandung mikroorganisme lebih banyak dari dari pada pada zone zone di luarny luarnya a karena karena menga mengand ndung ung sejuml sejumlah ah eksud eksudat at akar akar sebaga sebagaii sumber nutrisi mikroorganisme. Filosfer Filosfer adalah adalah daerah daerah permukaan permukaan tanaman tanaman yang berhubu berhubungan ngan langsung langsung dengan udara atmosfer yang meliputi daun, pucuk daun, helai bunga dan kuntum bunga, bunga, Spermosf Spermosfir ir adalah adalah daerah daerah yang melingkup melingkupii permukaa permukaan n biji (benih) (benih) yang sedang bergerminasi. Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan tiga cara: a. Metode Metode Gore Gores s (Strea (Streak k Plate Plate Method) Method) Pada metode ini, satu ose suspense dari sumber isolate digoreskan k eatas permukaan plat agar. Penggoresan dilakukan beberapa kali dalam satu plat agar agar deng dengan an tuju tujuan an meng mengha hasi silk lkan an kolo koloni ni terp terpis isah ah.. Plat Plat agar agar ters terseb ebut ut diinkuba diinkubasikan sikan satu sampai sampai dua hari untuk memberi memberikan kan kesempata kesempatan n pada

mikroba membentuk koloni. Setiap satu koloni dianggap berasal dari satu sel mikroba. Setelah masa inkubasi satu atau dua hari, plat agar akan ditumbuhi berbagai   jenis koloni dengan pola pertumbuhan koloni sesuai dengan alur goresan kultur. Setelah kita beda- bedakan koloni yang tumbuh berdasarkan siftasifat koloninya (warna, konfigurasi/ bentuk, margin/ tepian dan elevasi. Dengan metode ini, koloni yang terpisah pindahkan ke media agar miring untuk dimurnikan danmemperoleh biakan murni. Metode ini tidak dapat menghitung populasi mikroba dalam suatu substrat. b. Metode tuang (pour Method) atau metode pengenceran plat (Dilution plate method) Pada metode ini media agar steril yang belum membeku (temperature tidak lebih dari 450c) Kedalam cawan petri steril yang mengandung suspense mikroba pada volume dan pengenceran tertentu. Pada suhu ini agar belum membeku dan mikroba ini tidak mati. Cawan petri yang berisi suspense mikroba dan media agar digerakkan ke kiri, ke kanan dan diputar beberapa kali agar suspense bakteri tersebar merata dalam media biarkan membeku, kemudia inkubasikan selama 1-2 hari dengan petridisk diletakkan terbalik. Setelah inkubasi akan terlihat beberapa jenis koloni mikroba yang tumbuh menyebar. Populasi mikroba dihitung berdasarkan jumlah koloni yang terbentuk. Koloni yang terpisah dapat dimurnikan untuk memperoleh biakan murni. Pengenceran Pengenceran suatu sumber isolat dilakukan untuk menurunkan konsentrasi sel mikroorganisme di dalam substrat/ sumber isolate sehingga dengan metode tuang akan didapatkan koloni terpisah di atas plat agar dengan  jumlah antara 30-300 per plat agar. c. Metode Replika bahan tanaman Pada metode ini kita menempelkan bahan tanaman seperti daun, biji, atau batang ke tatas plat agar selama 5 menit. Mikroba yang menempel di atas plat akan tumbuh setelah masa inkubasi 1- 3 hari. 5.1 ISOLASI DAN PENENTUAN POPULASI BAKTERI DAN JAMUR RIZOSFIR DENGAN METODE TUANG  Tujuan: Mengisolasi dan menentukan bakteri dan jamur dari rizosfer beberapa tanaman

 Teori: Metode penghitungan ini adalh metode tidak langsung yang banyak digunakan untuk menentukan populasi mikroba di dalam tanah. Langkahnya diawali dengan pengenceran suspense tanah, lalu menumbuhkan mikroba yang ada dalam suspense tanah di dalam plat aga. Jumlah koloni yang tumbuh menggambarkan mikroba yang terdapat di dalam suspense sehingga satuan dalam penghitungan adalah CFU( colony Forming Unit). Dengan metode ini diasumsikan bahwa satu koloni berasal dari satu sel mikroba.  Jumlah mikroba dalam satu gram tanah contoh (CFU/gr) dihitung dengan membagi   jumlah koloni yang tumbuh dengan factor pengenceran. Metode inihanya menghitung bakteri hidup, dan tidak selamanya satu koloni berasal dari satu sel bakteri. Selain itu, tidak semua mikroba tanah dapat tumbuih pada media yang di pakai.

Bahan dan Alat 1. Tanah rizosfer tanaman pangan / sayuran 2. Akuades Steril 3. Pipet steril ukuran 1,0 dan 10 ml, tabung reaksi steril 18 ml, cawan petri, kuas 4. Media agar nutrisi ( 3 gram beef extract, 5 gram agar, 1L akuades) 5. Media potato dextrose agar (PDA) (200 g kentang, 10 g dekstrosa, 15 g agaragar, 0,2 g CaCO 3, 0,2 gr MgSO 4 7H2O, 1L akuades)

Cara kerja 1. Koleksi tanah rizosfer dengan cara mengambil tanah yang menempel di perankan dengan bantuan kuas. Tanah non rizosfer diambil dari tanah di luar perakaran 2. Suspensikan 1 gram tanah ke dalam 9 ml akuades sehingga dapat suspense tanah dengan pengenceran 10-1. Kocok selama lima menit dan biarkan selama 15 detik. 3. Denagn pipet steril ambil 1 ml suspense tanah 10 -1 dan pindahkan ke tabung berisi 9 ml aquades steril(10-2) kocok sampai merata. 4. Dengan cara yang sama point 2 diatas lanjutkan pengenceran sampai 10 -7.

5. Dari pengenceran 10 -6,10-7 ambil masing-masing 0,5 ml suspensi masukkan ke dalam dua cawan petri steril. Tuangkan 15 ml media agar nutrisi untuk perhitungan bakteri. Goyangkan cawan petri steril.. Goyangkan cawan petri supaya suspense dan media tercampur homogen. 6. Dengan pengenceran 10-3,10-4 ambil masing- masing 0,5 ml susupensi masukan ke dalam dua cawan petri steril . Tuangkan 15 ml media PDA untuk perhitungan jamur. Goyangkan cawan petri steril.. Goyangkan cawan petri supaya suspense dan media tercampur homogen. 7. Inkubasikan 24 jam di dalam incubator pada suhu 30 0c 8. Tentukan isolate bakteri atau jamur yang tumbuh berdasarkan karekteristik koloni 9. Hitung koloni bakteri / jamur di permukaan atau sedikit di bawah permukaan media. Jumlah koloni yang memenuhi syrat adalah 30- 300 CFU/ plat agar. 10.Hitung koloni bakteri / jamur per gram tanah adalah Rata- rata kolon Pengenceran Contoh: jika pada pengenceran 10-6 terdapat 150 koloni maka jumlah bakteri per gram tanah adalh 150: 10-6= 15 x 106 CFU/g Mikroba

CFU/ g tanah pada pengenceran 10-3

10-4

10-6

Bakteri  Jamur

Pengamatan: Katakteristik isolate bakteri dan jamur Isolat Bakteri berdasarkan karakteristik koloni Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3 Isolat 6

10-7

Populasi total (CFU /g)

Isolat 5 Isolat 6 Isolat Jamur berdasarkan karakteristik koloni Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3 Isolat 6 Isolat 5 Isolat 6 5.2ISOLAT BAKTERI DAN JAMUR DARI SUSPENSI CAMPURAN DENGAN METODE GORES  Tujuan: Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi dan memperoleh biakan murni bakteri dan jamur dari rizosfer beberapa jenis tanaman. Bahan dan alat: 1. Susupensi tanah dengan pengenceran 10-2 2. Media Nutrisi agar (NA) dan Potato dextrose agar (PDA) steril. 3. Ose, pertridish steril Lmpu spirtus 4. Media Agar miring NA dan PDA

Cara kerja: 1. Taung 10 ml media Nutrisi agar (NA) steril yang masih panas/ mencair ke dalam petridish steril secra a aseptic. Biarkan membeku. 2. Lakukan prosedur yang sama dengan media PDA 3. Ambil satu ose suspense tanah, lalu buat goresan-goresan pada permukaan plat agar NA dengan cara simple streak. 4. Lakukan prosedur Pada point 3 ke permukaan plat agar PDA 5. Inkubasi selam 24- 48 jam sampai koloni bakteri dan jamur tumbuh. Amati koloni yang tumbuh. Setiap koloni yang terpisah adalah satu isolate.

6. Ambil isolate dengan menggunakan ose, tanamkan pada agar miring NA untuk bakteri dan pada agar miring PDA untuk jamur. Penanaman dilakukan dengan membuat goresan sebanyak mungkin di permukaan agra miring 7. Inkubasikan paing sedikit 24 jam, hasilnya adalah biakan murni bakteri dan  jamur

Pengamatan: Isolat

Karakteristik koloni bakteri

1 2 3 Isolate

Karakteristik koloni jamur

1 2 3

5.3Isolat bakteri dan jamur dari filosfer dan spermosfer metode replica  Tujuan: Untuk membuat ataun memperoleh biakan murni bakteri dan jamur dari filosfer beberapa jenis tanaman Bahan dan alat: 1. Daun dan biji tanaman yang masih segar 2. Media nutrisi Agar (NA) dan PDA steril

3. Pinset steril, cawan petri steril, ose steril, lampu spirtus Cara kerja: 1. Tuangkan 10 ml media Nutrisi agar steril yang masih panas/ cair ke dalam cawan petri steril secara aseptic. Biarkan membeku 2. Ambil satu lembar daun atau satu biji benih, dan letakkan berdampingan di permukaan agar. 3. Tekan permukaan daun dan biji, tutup kembali cawan petri dan biarkan selama 5 menit 4. Angkat daun dan biji. Tutup kembali cawan petri 5. Kultur inkubasi selama 1-2 hari dengan posisi tutup cawan di bagian bawah 6. Amati pertumbuhan bakteri di permukaan agar, isolate bakteri diisolasi koloni yang terpisah 7. Lakukan langkah 1-5 dengan menggunakan media PDA untuk isolasi  jamur

Pengamatan: 6. Gambarkan penyebaran koloni bakteri dan jamur dari filosfer dan spermosfir di atas media agar 7. Tentukan jenis koloni yang ada berdasrkan karakteristik koloni 8. Hitung jumlah koloni jika memungkinkan

PRAKTIKUM VI UJI METABOLISME BAKTERI FOTOSINTETIK  PADA KONDISI GELAP DAN TERANG

 Tujuan: 1. Membandingkan populasi sianobakteri (bakteri fotosintesis) tumbuhkan pada kondisi tanpa dan dengan sinar matahari

yang

di

2. Membandingkan morfologi mikroskofis sianobakteri yang tumbuh pada kondisi gelap dan terang  Teori:  Tipe metabolisme Fotoautotroph terdapat pada sianobakteri yang memiliki pigmen klorofil untuk menangkap energy cahaya dalam bentuk foton. Pada tipe metabolisme ini, bakteri memfiksasi Co2 menjadi C6H12O6 melalui proses fotosintesis. Berbeda dengan tanaman tinggi, fotosintesis bakteri hijau hanya berlangsung dalam satu tahap fotosistem. Di daerah tropis beberapa sianobakteri hidup di permukaan tanah yang lembab dan ditanah sawah dengan intensitas cahaya tinggi. Populasi terbanyak terdapat di lapisan tanah dekat permukaan tanah lembab. Sianobakteri dianggap penting karena berperan sebagai produsen makanan melalui fotosintesis,dan beberapaspesies dapat memfiksasi nitrogen udara. Metode untyuk menentukan kemampuan proliferasi bakteri hijau adalah perhitungan tidak langsung untuk menduga populasi sianobakteri adalah metode most probable number. Pada metode ini suspense tanah diencerkan dan ditumbuhkan pada media cair yang selektif sehingga hanya alga yang bersifat fotosintetik yang dapat tumbuh selama inkubasi di tempat yang mendapat cahaya. Bahan dan Alat: 1. Contoh tanah sawah segar dari lapisan aerob (0-3 cm dari opermukaan tanah) 2. Akuades steril 3. Pipet steril 0.1 ml dan 10 ml, 30 tabung reaksi 100 ml gelas objek dan gelas penutup 4. Medium Gerlof dengan N untuk menghitung sianobakteri total. Cara kerja:

1. Buat pengenceran tanah sampai 10-6 dengan metodeyang dijelaskan pada praktikum 5 2. Pindahkan dari pengenceran 10-1, 10-2 dan 10-3 masing- masing 0.5 ml kedalam 5 buah tabung reaksi berisi ml medium cair Gerlof  3. Susun ke 15 tabung di rak sesuai dengan pengencerannya 4. Buat dua seri kultur. Inkubasisatu seri di tempat gelap dan lainnya di tempat terang selama 2 minggu. 5. Amati pertumbuhan sianobakteri setiap minggu dengan mengidentifikasi warna hijau di dalam larutan ataupun didasar permukaan larutan. 6. Catat jumlah tabung pertumbuhan positif dari setiap deret pengenceran 10 -1, 10-2 dan 10-3 7. Pendugaan populasi alga ditentukan dengan metode MPN dibawah ini. 8. Ambiol beberapa tetes larutan dari tabung yang menunjukan pertumbuhan, pindahan ke gelas objek dan amati morfologi sianobakteri.

Metode MPN 1. Hitung dan catat jumlah tabung setiap pengenceran yang menunjukan terjadinya pertumbuhan alga. 2. Bandingkan dengan table probabilitas. Catat bahwa daftar kolom sebagai kode yang terdiri atas tiga buah angka. Angka tersebut menunjukkan jumlah nilai positif pada setiap pengenceran tuga kali berturut- turut. 3. Kode berhubungan dengan nilai 40 pada table probabilitas. Nilai ini merupakan most probale number untuk mikroba pada pengenceran kedua yang ditentukan menurut teori probabilitas tertentu. 4. Berdasarkan table tersebut maka MPN untuk alga dalam 1 ml pengenceran 10-2 adalah 40 sehingga MPN sianobakteri/ g tanah asal adalah 100 x 40 = 4000 MPN/g Pengamatan

 Jumlah tabung positif pada setiap pengenceran Cahay

Tabung positif pada

a

pengencran 10-1

10-2

10-3

Terang

5

5

5

Gelap

0

0

0

MPN sianobakteri di tempat terang: >1600 x 100= >160000 MPN/g

MPN sianobakteri di tempat gelap: