PRACTICAS OPERACIONES UNITARIAS II, I FASE final.doc

U.C.S.M. P.P. Ing. Biotecnológica Operaciones unitarias II

Prácticas de

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS, BIOQUÍMICAS Y BIOTECNOLÓGICAS PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

Guía de práctica OPERACIONES UNITARIAS II

Alumno Docente

: Midwar Ancco Mamani : Ing. Cinthia Córdova

Barrios AREQUIPA Ing. Cinthia Cárol Córdova Barrios

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2013

PRACTICA Nº 1. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES I.

OBJETIVOS: 1.1. 1.2. 1.3. 1.4.

II.

Preparar el medio de cultivo 9K líquido y sólido. Aislar microorganismos biolixiviantes en medio de cultivo 9K a partir de su ambiente nativo. Mantener el desarrollo de la biomasa en las condiciones de incubación. Inculcar en el proceso enseñanza-aprendizaje valores de puntualidad, responsabilidad, cooperación y perseverancia.

MARCO TEÓRICO: La observación de las transformaciones naturales que sufrían diversos compuestos de hierro y azufre, procedentes de la disolución de ciertos minerales, hizo que desde principios del siglo XX se viniera postulando la presencia de microorganismos quimiolitótrofos en ciertas aguas. Sin embargo, no se logró aislar un tipo de bacterias del genero Acidithiobacillus de las aguas de drenaje de unas minas de carbón bituminoso, ni se pudo dar una explicación clara de estos fenómenos, hasta mediados del siglo XX. En 1951, Temple y Colmer, comprobaron que una de estas bacterias era responsable de la rápida oxidación del hierro ferroso y, en consecuencia, de la acidez de estas aguas por la hidrólisis del ión férrico producido. La denominaron Thiobacillus ferrooxidans, ya que presenta diferencias fisiológicas y morfológicas respecto a otras bacterias de este mismo género. Esta bacteria ha sido aislada, posteriormente, por numerosos investigadores, observándose una amplia distribución en microambientes de naturaleza ácida, con la presencia de ión ferroso o sulfuros metálicos, ricos en metales, convirtiéndose en una buena opción para su lixiviación. La lixiviación bacteriana, también conocida como Biolixiviación puede ser definida como un proceso natural de disolución que resulta de la acción de un grupo de bacterias específicas para lixiviar, o extraer, metales o concentrados minerales presentes en las minas. El producto final de la biolixiviación es una solución ácida que contiene el metal en su forma soluble. La lixiviación bacteriana es un excelente ejemplo de cómo la actividad biológica controlada puede servir al hombre en la explotación de los recursos naturales sin el uso intensivo de energía.

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Desde la década del 50, en que se descubrió que los responsables de la acidificación de aguas de minas eran microorganismos, hasta hoy se ha avanzado mucho en el entendimiento de los mecanismos a través de los cuales se llevan a cabo la solubilización de las especies metálicas, y en la aplicación de estos principios en desarrollos tecnológicos. En la Industria minera se hace frecuente la búsqueda de métodos menos contaminantes en la extracción de metales, ya que se ha visto que los métodos convencionales generan alto costo en lo económico y ambiental, debido a la utilización de procesos químicos que producen alto índice de contaminación. Dependiendo de la composición del mineral sulfurado, la lixiviación bacteriana es una alternativa biológica ventajosa a las tecnologías pirometalúrgicas por demandar menores inversiones de capital y tener menores costos de operación. Por otra parte la no emisión de SO 2 la convierten en una tecnología más limpia, cuestión no menor frente a la creciente preocupación pública por los efectos ambientales de operaciones industriales. Esta tecnología permite además el beneficio de minerales marginales y la exploración de botadores que en muchos casos constituyen hoy pasivos ambientales, y al ser una tecnología de fácil aplicación es atractiva para ser empleada en países en vías de desarrollo. Desde el aislamiento de la primera cepa de Acidithiobacillus ferrooxidans han sido muchos los medios propuestos para el cultivo de este microorganismo, siendo los medios más conocidos como 9K y T&K, los que mejores resultados muestran en el crecimiento microbiano. En cuanto al cultivo de Acidithiobacillus ferrooxidans en medio sólido es fundamental para la purificación del mismo, para los estudios genéticos, así como la estimación del tamaño de la población mediante el recuento de microorganismos viables. Las bacterias de este género se caracterizan por ser quimiolitoautótrofas, mesófilas y acidófilas. Entre los parámetros básicos que influyen sobre el comportamiento del microorganismo, cabe destacar, el pH, temperatura, oxígeno y dióxido de carbono. Sin embargo, se pueden producir efectos sinérgicos para el crecimiento de dichos microorganismos. III.

MATERIALES: 3.1. Muestras: Drenaje ácido de roca. Drenaje ácido de mina. Mineral. Relaves. 3.3. Reactivos: Sulfato de amonio, (NH4)2SO4. Cloruro de potasio, KCl. Fosfato ácido de potasio, K2HPO4.

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Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO 4. 7H2O. Nitrato de calcio, Ca(NO3)2. Sulfato ferroso heptahidratado, FeSO4. 7H2O. 3.4. Material de vidrio: Baguetas. Beakers, 250 mL. Fiolas, 100, 250 y 500 mL. Matraces, 250 mL. Placas petri. Probetas, 100 mL. 3.5. Otros: Cinta universal de pH. Espátula. Parafilm. Piceta. Tijeras. 3.6. Aparatos: Autoclave. Balanza analítica. Cocina eléctrica. Potenciómetro. Ultrasonido. IV.

METODOLOGÍA: 4.1. Toma de muestra: Se ubicó geográficamente el lugar donde se tomaron las muestras con un GPS (Sistema de posición geográfica) en las siguientes coordenadas. La muestra consistió en… 4.2. Preparación del medio 9K líquido y sólido: El medio 9K se preparó según la formulación propuesta por Silverman y Lundgren (1959). 4.4. Aislamiento de microorganismos biolixiviantes: Se inoculo la muestra en medio 9K líquido y sólido. Se mantuvo las condiciones de incubación establecidas.

V.

PROCEDIMIENTO DETALLADO: v.1) Obtención de muestra 

Se recolectaron dos tipos de muestras de diferentes lugares

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a. Muestra solida Esta muestra es una roca en la cual se ve cobre en su forma natural proveniente de la mina Tintaya. b. Muestra liquida Esta muestra se obtuvo de aguas termales, que se recolectaron de las pozas naturales que se encuentran en la cuidad de Yura, Areuipa. v.2) Preparación de medio 9k 

Pesar los nutrientes según los requerid



Se prepararon dos soluciones stock A y B de 500 ml con los siguientes nutrientes:

Nutrientes

Cantidades g/L

Sulfato de amonio, (NH4)2SO4.

3.0

Cloruro de potasio, KCl.

1.0

Fosfato ácido de potasio, K2HPO4.

5.0

Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4. 7H2O.

5.0

Nitrato de calcio, Ca(NO3)2.

0.01

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U.C.S.M. P.P. Ing. Biotecnológica Operaciones unitarias II Sulfato ferroso heptahidratado, FeSO4. 7H2O.

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a. Medio liquido  



Se llevó la solución A al autoclave por 20 min a 120 C° a 1,5 atm. Luego se agregó a un matraz solución A requerida en si para preparar 200 ml de medio y solución B igual para 200 ml pero este fue agregado utilizando un filtro. Luego se midió el pH, si no era el indicado de le agregaba ácido sulfúrico o una base

b. Medio solido  Se llevó la solución A se llevó al autoclave por 20 min a 120 C° a 1,5 atm.  Luego se agregó a un matraz solución A requerida en si para preparar 200 ml de medio y solución B igual para 200 ml pero este fue agregado utilizando un filtro.  Luego se midió el pH, si no era el indicado de le agregaba ácido sulfúrico o una base  Se agregó agarosa (12g/L) la cantidad necesaria para lo requerido y se disolvió exponiéndola a una fuente de calor

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v.3) Sembrío y manteniendo de muestras cultivadas a. Muestra solida    

En este caso al roca fue triturada hasta llegar a un tamaño de polvo Posteriormente fue inoculada al medio líquido Se dejó la muestra para su crecimiento Luego de tener una respuesta positiva en medio líquido se procedió a sembrar en medio sólido, sembrando en una placa utilizando una micro pipeta b. Muestra liquida   

VI.

En este caso solo se colocó un inoculo en el medio liquido Se dejó la muestra para su crecimiento Luego de tener una respuesta positiva en medio líquido se procedió a sembrar en medio sólido, sembrando en una placa utilizando una micro pipeta

RESULTADOS 

  

El crecimiento se pudo deducir debido a la cambio de color de medio, tornándose de color amarillento debido a la oxidación de sus componentes El crecimiento de microorganismos fue muy lento a comparación de los que vemos normalmente. A partir de la muestra solida se pudo observar microrganismos En la muestra liquida no se observó crecimiento de microorganismo

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U.C.S.M. P.P. Ing. Biotecnológica Operaciones unitarias II VII.

DISCUSIÓN: 

 

VIII.

Al parecer el modo en que se trató a la muestra líquida fue la causa de que no diera resultados positivos debido a que este tipo de bacterias son termófilas y la muestra no tuvo el tratamiento adecuado Al corregir el pH del medio debe utilizarse ácidos o bases diluidos para lograr un medida casi exacta Se tiene que buscar métodos para acelerar el crecimientos de estas bacterias

CONCLUSIONES:   

IX.

Prácticas de

El medio liquido se preparó correctamente al igual que el medio solido debido a que se pudo observar el crecimiento de microrganismos El medio 9K nos servirá para hacer estudios posteriores con cepas nativas encontradas No todas las muestras presentaron crecimiento, una razón tal vez es el tratamiento que estas recibieron

CUESTIONARIO: 1. ¿Qué estrategias se utiliza para preparar o procesar la muestra? 2. ¿Qué métodos se utilizan para la determinación de la oxidación del medio de cultivo? 3. Haga un comentario sobre las oportunidades de la Biotecnología en la Biominería? 4. ¿Cómo optimizar el crecimiento de microorganismos biolixiviantes? Desarrollo de cuestionario 1. Bueno todo depende de la muestra a tomar, si es sólida, liquida u otro tipo; en el caso de que sea solida simplemente se obtiene una muestra significativa y luego esta se guarda en un contenedor el que no vaya a sufrir cambios significativos; ahora si al muestra es líquida esta tiene que ser almacenada en unos frascos los cuales tienen que ser protegidos de la luz del sol y tenerlos a una temperatura no muy diferente a de donde se obtuvo 2. Bueno un método seria analizar los elementos que pueden estar sufriendo una oxidación en este caso el Fe y sulfatos mediante pruebas de difracción de rayos X y pruebas FTIR

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3. La biotecnología es sino el único medio para que la biomineria pude llegar a ser lo que todas las industrias mineras desean para sus procesos, que son extracción eficiente de su mineral y disminuir la emisión de contaminantes al medio ambiento todo esto con beneficio económico y igual o mayor a comparación de la tecnología que se aplica normalmente. 4. El primer paso a tomar seria aumentar la temperatura del medio de cultivo y así elevar el proceso de metabolismo, otro aspecto seria aumentar o dar agitación a medio de cultivo para asi hacer que los microorganismos tengas mayor facilidad de crecer y otra posibilidad es adicionar al medio de cultivo algunos compuestos orgánicos los cuales facilitaran el crecimiento de los microorganismo X.

BIBLIOGRAFÍA:   

XI.

http://es.scribd.com/doc/38084383/Biolixiviacion-o-Lixiviacion-Bacteriana http://www.monografias.com/trabajos33/biolixiviacionmineral/biolixiviacion-mineral.shtml#ixzz2fP0tU7Da http://www.unicolmayor.edu.co/invest_nova/NOVA/artorig5_5.pdf

ANEXOS: BIOLIXIVIACIÓN La biolixiviación de minerales, concentrados y relaves sulfurados que contienen Au y Cu encapsulados es un concepto relativamente nuevo en comparación a losprocesos de tostación, oxidación a presión y/o oxidación química, y rápidamentefue establecido como un pretratamiento alternativo de oxidación viable.La técnica de oxidación bacteriana empleada para el tratamiento de mineralessulfurados auríferos se fundamenta en la acción efectiva de la bacteria ThiobacillusFerrooxidans para oxidar especies reducidas de azufre a sulfato, y para oxidar elión ferroso a ión férrico. El Thiobacillus Ferrooxidans es eficaz en ambiente ácido,aeróbico, móvil y quimioautotráfico y se presenta en forma de bastoncitos de 1-2 ìnde largo por 0.5-1.0 ìn de ancho, gran negativas. Presentan punto isoeléctricoentorno de 4.0 - 5.0 y se C. La fuente de energía ° desenvuelven en el intervalo detemperatura de 28 - 35 fundamental para el Thiobacillus Ferrooxidans es el iónFe+2, pudiendo ser utilizados también el azufre y sus formas reducidas. Usanutrientes básicos para su metabolismo a base de N, P, K, y Mg, Ca, comoelementos de trazo.La biolixiviación de sulfuros como proceso biohidrometalúrgico involucra unconjunto de reacciones químicas, metabólicas, enzimáticas y no

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enzimáticas, en elcuál el mineral insoluble es oxidado y otros metales de interés son liberados ensolución Lixiviación bacteriana de un mineral sulfurado refractario argentífero Los minerales sulfurados concentrados refractarios argentíferos (MSRP), se tratan por diversos métodos como: la tostación, la lixiviación con agentes químicos quelantes, la autoclave y la oxidación química. Estos métodos tienen una eficiencia relativa, un elevado costo y desafortunadamente un daño ambiental; por ello, se buscan alternativas como la biolixiviación (BL)o lixiviación bacteriana es un proceso natural en la cual bacterias quimiolitotróficas oxidan el azufre, y/o el hierro de los minerales y con ello facilitan la extracción de los metales de valor comercial a bajo costo y sin contaminar el ambiente, aunque tiene la limitante de que la plata en la solución lixiviante inhibe el crecimiento de los microorganismos que participaron en el proceso, por ello se busca aumentar la resistencia de estas bacterias al metal. Los objetivos de este trabajo fueron: i) Aislar y seleccionar bacterias lixiviantes Para ello se prepararon matraces con medio de cultivo 9K modificado, mezclado con el MSRP como fuente de energía para los microorganismos acompañantes de este mineral. Para determinar su capacidad lixiviante se midió la concentración de sulfato producida por la oxidación del azufre del MSRP, por una bacteria quimiolitotrófica, el aislado con la máxima actividad de lixiviación del mineral, se adaptó a concentraciones crecientes de plata, lo que nuevamente se midió por la producción de sulfatos en presencia de una concentración elevada de nitrato de plata. Los resultados indican que los MSRP contienen como acompañantes microorganismos quimiolitotróficos capaces de lixiviar este mineral para extraer la plata. Una de estas bacterias se adaptó, a una elevada concentración de plata. Por el tipo de actividad de lixiviación y las características fisiológicas de la bacteria, se sabe que pertenece a una especie del género Thiobacillus sp. Se concluye que la lixiviación es una alternativa económicamente viable para la extracción de metales preciosos a partir de MSRP y no causa daño ambiental.

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PRACTICA Nº 2. CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES I.

OBJETIVOS: 1.1.

1.2. 1.3.

II.

Caracterizar macroscópicamente el cultivo de microorganimos biolixiviantes aislados de su ambiente nativo en medio 9K sólido y líquido. Caracterizar microscópicamente con tinción diferencial el cultivo de microorganimos biolixiviantes. Enfatizar en el proceso enseñanza-aprendizaje valores de puntualidad, responsabilidad, cooperación y perseverancia.

MARCO TEÓRICO: La observación al microscopio óptico con distintas coloraciones de los cultivos bacterianos, el conocimiento de la composición bioquímica de las diferentes estructuras bacterianas, así como su metabolismo, tienen un rol importante en la identificación de las bacterias y su ubicación taxonómica. Recientemente, los avances de la genética bacteriana hicieron posible el desarrollo de técnicas de biología molecular con aplicaciones a nivel de la investigación científica y la industria. Las bacterias que intervienen en los procesos de lixiviación son generalmente aeróbicas, mesófilos, acidófilos y quimiolitoautótrofas, lo que implica que obtienen las energía necesaria para su funcionamiento mediante la oxidación de compuestos inorgánicos, utiliza C02 como única fuente de carbono para todas sus necesidades metabólicas, no requiere de nutrientes orgánicos y es capaz de desarrollarse a valores de pH muy bajos, en el rango de 1 a 3. Acidithiobacillus ferrooxidans, ha sido la bacteria más estudiada, tiene forma bacilar, es gramnegativa y mide aproximadamente 0.5 µm de diámetro y 2 µm de longitud. Otras importantes bacterias lixiviantes son Acidithiobacillus thiooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Estas tres especies son las más frecuentemente encontradas en operaciones mineras y tienen un papel directo en las reacciones de biolixiviación. En los últimos años han despertado gran

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interés microorganismos termófilos extremos, capaces de crecer a temperaturas de 65 y 80 °C, que presentan buenas características lixiviantes sobre sulfuros reconocidamente recalcitrantes. Estos organismos pertenecen al dominio de la arqueas, las cuales han sido mayoritariamente aisladas de aguas termales y géiseres. III.

MATERIALES: 3.1. Materia prima: Cultivo de microorganismos biolixiviantes. 3.2. Reactivos: Aceite de inmersión. Alcohol isopropílico. Tinción de Gram. 3.3. Material de vidrio: Pipetas pasteur. Portaobjetos. 3.4. Otros: Algodón. Asa de Kolle. Picetas. Soporte de tinción. 3.5. Equipos: Microscopio óptico compuesto.

IV.

METODOLOGÍA: 4.1. Caracterización macroscópica Registrar las características descriptivas del medio de cultivo 9K líquido. Describir las características fenotípicas de las colonias de los microorganismos biolixiviantes aislados. 4.3. Caracterización microscópica: Caracterizar los cultivos de microorganismos biolixiviantes utilizando la tinción diferencial de Gram.

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V.

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PROCEDIMIENTO DETALLADO: v.1) Preparado de muestra   

Se colocó aproximadamente 1 ml de muestra con crecimiento positivo en un porta objetos. Con ayuda de calor se fijó la muestra Todo cerca de un mechero

v.2) Coloración con tensión Gram     

Aplicar Violeta cristal 1 min. lavar Fijamos con Lugol, 1min. lavar Decoloremos con una mezcla alcohol-cetona 30 seg. Lavar Aplicar Safranina 1 min. Lavar Esperar a que seque

v.3) Identificación de microrganismo 

Utilizando un microscopio se identificaron los microoganismos.

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VI.

RESULTADOS  

VII.



La cantidad de colonias o microorganismos no es muy significativa debido a la poca cinética de crecimiento que poseen estos Es necesario utilizar el objetivo de 100x junto con aceite de inmersión para poder distinguir bien los microrganismos

CONCLUSIONES:  

IX.

Se observaron claramente bacilos gram negativos muy dispersos La colonias en el medio no son muy identificables

DISCUSIÓN: 

VIII.

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La tensión fue realizada correctamente debido a que se observó los microogaminos esperados. Se puedo lograr aislar bacterias nativas exitosamente

CUESTIONARIO: 1. Caracteriza a las arquea s como organismos lixiviantes. 2. Utilizando las herramientas de la Biología molecular ¿Qué métodos se utilizan para caracterizar microorganismos biolixiviantes?

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3. ¿En qué consiste la técnica de epifluorescencia directa en filtro (DEFT)? Desarrollo de cuestionario 1. Bueno generalmente son gram negativos excepto el sulfobacillus, estos tiene la capacidad de sobrevivir en ambientes ácidos y oxidar azufre y fierro; también tien la capacidad de vivir en ambientes con temperaturas considerablemente altas 2. Identificación de ADN ribosomal específicamente el 16S utilizando PCR 3. El microscopio de epifluorescencia es un microscopio óptico que se funcionamiento se basa en la propiedad de fluorescencia que tienen ciertas moléculas denominadas fluorocromos. un microscopio de epifluorescencia la luz que incide sobre la muestra estudiada no la atraviesa sino que el mismo lente ilumina y recibe la luz emitida por la muestra. X.

BIBLIOGRAFÍA:  

XI.

http://perso.wanadoo.es/microdominguez/b.htm http://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/timag/trabajos/2007/proteus/ epifluorescencia.html

ANEXOS Evaluación de oxidación bacteriana de sulfuros con Acidithiobacillus ferrooxidans mediante pruebas de FTIR y difracción de rayos X Una cepa bacteriana nativa con capacidad de oxidar hierro ferroso y compuestos del azufre fue aislada a partir de efluentes y material de la mina de oro La Maruja, en el municipio de Marmato (Caldas), la cual fue identificada bioquímicamente como Acidithiobacillus ferrooxidans. Esta cepa fue evaluada en su capacidad de oxidar concentrados de sulfuros metálicos a dos diferentes concentraciones de pulpa y dos tamaños de partícula. Después de 15 días de biooxidación de los sulfuros se observó que, efectivamente, la bacteria mostró acción catalizadora sobre el proceso de disolución del mineral. Espectroscopia de infrarrojo (FTIR) A los concentrados de sulfures metálicos expuestos a la acción bacteriana, se le realizaron mediciones de oxidación, mediante la técnica de espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR), en un equipo Spectrum BX FTIR System de Perkim Elmer. Los datos fueron procesados con el software Spectrum v.2.00. Para esta técnica se tomaron 2 mg de la fase sólida de los diferentes reactores cada 5 días, con las

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cuales se prepararon pastillas finamente homogenizadas, agregando 150 mg de bromuro de potasio (Kbr) calidad espectroscopia infrarroja.

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