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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

AUTORES: Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal

DATOS DEL ALUMNO Nombre del alumno …………………………………………………………................................…… Grupo……………………………………………………….

Turno Calificación………………….

AREQUIPA-PERÚ-2017

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

AUTORES: Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal

AREQUIPA-PERÚ-2017

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PROLOGO

El Campo de la Microbiología en toda su magnitud es indispensable para el desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el ilimitado campo de los bioprocesos. Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la elaboración de infinidad de productos útiles al hombre, en la generación de procesos productivos con menor contaminación del medio ambiente y con consumos de energía muchos menores. Los microorganismos son objetos de manipulaciones genéticas para que puedan producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos bioprocesos. El conocimiento de la microbiología se hace imperioso para su aplicación a diversas disciplinas del saber humano. La presente Guía de Práctica de Mi9crobiologia Industrial se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en el conocimiento sistematizado sobre las técnicas básicas del manejo de Microorganismos en laboratorio para estudiantes de Ingeniería Química.

Los Autores

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ÍNDICE PROLOGO ÍNDICE

Pgs.

RECOMENDACIONES GENERALES… ................................................................................................... 6 PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ..................................................................... 7 PRÁCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL ...................................................................... 12 PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS .................................................................................................................... 17 PRÁCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN ............................................................................................ 31 PRÁCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 36 PRÁCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ............................................................... 48 PRÁCTICA 7 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE COLONIAS……........................................................................................................ 57 PRÁCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ............................................................................... 62 PRÁCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS .................................. 67 PRÁCTICA 10 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA.......................................................................................................................... 70 PRÁCTICA 11 : OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia 70 PRÁCTICA 12 : AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL......................................................................................... 70 PRÁCTICA 13 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium..................................................... 81 PRÁCTICA 14 : ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS ............ 83 PRÁCTICA 15 : MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y escherichia coli POR LA TÉCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MÚLTIPLE (NÚMERO MÁS PROBABLE O NMP) ............................................................................................... 86 FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES PRÁCTICAS ................................................................................................................................ 88 BIBLIOGRAFÍA .........................................................................................................................102

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Recomendaciones Generales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia, después de este tiempo, no se permitirá al acceso al laboratorio Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste. Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas deberán ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la boca. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usarla. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse sentado y en su equipo de trabajo. Hablar sólo lo necesario con los compañeros. Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor. Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la práctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá para todo el equipo. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá esterilizarse en la flama del mechero, antes y después de su uso. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cúbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno. Después de la incubación es necesario la esterilización del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud. Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio. Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.

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PRÁCTICA BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA I. OBJETIVOS     

Aprender las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio. Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su función y el cuidado de cada uno de ellas. Dominar el mecanismo de iluminación, la observación de una muestra con todos los objetivos.

II. MARCO TEORICO 2.1 BIOSEGURIDAD La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que tienen la finalidad de proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a diferentes riesgos biológicos físicos, psicológicos y mecánicos. 2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se está dentro del laboratorio Precauciones estándar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminación de una persona, evitando la exposición directa a sangre y otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, por ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras por ejemplo guantes no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente 2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR - Barreras de protección - Lavado de manos - Desinfección y esterilización. - Manejo de objetos punzo cortantes. - Manejo y eliminación de desechos - Ventilación e iluminación adecuadas - Limpieza y desinfección de ambientes 2.1.3 VÍAS DE CONTAMINACIÓN 1. La boca • Comer, beber y fumar en el laboratorio. • Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección. 7

2. La piel • Cortaduras o rasguños. • Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.). 3. Los ojos • Salpicaduras de materiales infecciosos. • Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados. 4. Los pulmones • Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles). 2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION - Lavado de manos (antes y después) - Guantes - Mascarilla o barbijo - Mandil - Gorro 2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD • Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin. • Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer completamente cerrado. • Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica. • Lavar las manos con agua y jabón: – antes de realizar las actividades programadas – antes de salir del laboratorio – después de usar materiales contaminantes. • Recoger el cabello largo. • Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable. • No comer, beber, fumar. • Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor. • Usar mascarillas para casos indicados 2.2 MICROSCOPIA El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de onda de la luz usada. 2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1.

Parte mecánica: - Pie - Columna (pilar, charnela y brazo) - Tubo: Revólver - Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido - Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento - Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales 8

- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo 2.

Parte óptica del Microscopio: - Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador - Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra Los objetivos traen impresas las siguientes características: o Magnificación: Ej. x 25 o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45 o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromático o Longitud del tubo: Ej. 160 mm o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma

2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el tornillo micrométrico. 2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin fatiga Verificar que los oculares estén limpios y en posición correcta. 3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas o”in vivo” debe mantenerse la platina horizontal. 4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo de aumento. 5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el revólver hasta que haga “clik”. 6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el diafragma totalmente. 7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente más cercano. 8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la máxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador. 9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre entre el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales. 10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panorámico ó 10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el tomillo macrométrico y observando por un lado del Microscopio el descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultáneamente suba al tubo con el tomillo macrométrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo micrométrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lámina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observación integral, siempre utilizando el tomillo micrométrico para no perder la nitidez. Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm. 11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste. 12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie de objetivo girando el sistema de revólver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento (45X) y NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con el tomillo micrométrico. Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe manipularse con el tomillo macrométrico porque corre el riesgo de romper la lámina o la lente frontal del objetivo. 9

13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre éste sector de lámina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersión. Luego, continúe girando el revólver hasta que el objetivo de inmersión (100X) contacte con la gota y encaje en el eje óptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo micrométrico. Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y la lámina con el campo ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol. 2.2.3.-

AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CÁLCULO APROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES 1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del ocular. Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X 40 x 10 = 400 aumentos 2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el diámetro del campo microscópico que varía de acuerdo al objetivo que se usa.

Ocular 10X 10X 10X Ejemplo:

Diámetro del campo microscópico Diámetro del Objetivo campo en micras 10X 1500 45X 400 100X 150 Si observamos una célula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera parte del campo microscópico, concluiremos que la célula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la tercera parte de 1500.

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la platina, porque a la larga deteriora el tomillo micrométrico. 2. Los objetivos y oculares constituyen la parte más delicada del Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razón debe desmontarse los objetivos. El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio después de su uso, para lo cual use el “campo” ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol. 3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico dejando un espacio de 2 cm. entre éste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.

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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X. Observe las diferencias en el campo óptico y el acercamiento.

IV. CUESTIONARIO 1) ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes? 2) ¿A qué se denomina campo óptico? 3) ¿Por qué decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal. 4) ¿Qué es el poder de resolución 5) Explique qué tipos de aberraciones se presentan en las lentes del microscopio. 6) Explique el fundamento del microscopio confocal laser y su utilidad. 7) ¿qué entiende por bioseguridad 8) Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio. 9) ¿qué barreras de protección debe tener en cuenta antes de empezar a trabajar. 10) ¿Cómo promovería la cultura de bioseguridad?

V. OBSERVACIONES

VI. CONCLUSIONES

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PRÁCTICA RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL

I. OBJETIVOS 1) Conocer la morfología de organismos unicelulares. 2) Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in vivo”.

II. OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS UNICELULARES Indicaciones: 1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en posición horizontal. 2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio. 3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera que la luz del Microscopio la atraviese. 4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de iluminación y poca visión de la muestra corrija éste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris. 5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen características especiales y un fondo de partículas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse: - Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeñas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos. - Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son brillantes, amarillentas, poco móviles; van desde la forma de un barril pequeño hasta cigarros o prismas. - Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observación. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar el núcleo y vacuolas. - También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo. - Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado). - La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudópodos en la superficie de su cuerpo. - También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada de cilios.

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6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares. 7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes. Grafique la Observación y Resultados

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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS 1. Examen en Fresco Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su examen microscópico. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Hay 2 tipos de técnicas: a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”. Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos. b. Gota pendiente Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación. La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo. 2. Coloraciones Vitales Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observación, mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres de movilidad, morfología, agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos. EXAMEN EN FRESCO Material - Microscopio - Láminas cubreobjetos - Láminas portaobjetos - Agua destilada - Asas de Kolle - Muestra de levaduras in vivo - Muestras fermentadas - Cultivo de microorganismos Metodología - Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto. - Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de suero fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una suspensión y colocar un cubreobjetos. - Observar al microscopio con objetivo 40X.

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Grafique la Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

COLORACIONES VITALES Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teñidas. Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solución de azul de metileno (1/1000), Asas de platino, Gérmenes diferentes Procedimiento - Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000). - Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o sólida). - Observar al microscopio con el objetivo de 40X. Grafique la Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS INTRODUCCION Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas propias de las células eucarióticas. Así, el citoplasma de las procarióticas está rodeado por una membrana plasmática y una pared celular (como en las células vegetales), pero no hay membrana nuclear ni, por tanto, núcleo diferenciado. Las moléculas de ADN están en contacto directo con el citoplasma. Además carecen de mitocondrias, retículo endoplasmático, cloroplastos y aparato de Golgi. Aunque, en general, las células procarióticas carecen de estructuras internas delimitadas por membrana, las cianobacterias, sí contienen numerosas membranas llamadas 15

tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos fotosintéticos que utilizan para captar la energía de la luz solar y sintetizar azúcares (fotosíntesis). OBJETIVO: Observar Nostoc (una cianobacteria) al microscopio óptico Materiales: Muestra biológicca: Nosstoc (murmunta hidratada) Procedimiento Experimental 1.Colocar un trocito de Nostoc en un portaobjetos. 2.Presionar con otro portaobjetos con cuidado. 3.Agregar una gota de agua 4.Colocar el cubreobjetos. 5.Observar al microscopio. 6.Dibujar lo observado indicando aumentos. 7.Indicar las diferentes estructuras observadas. Grafique la Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

V. CUESTIONARIO -

¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco? ¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente? ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes? Que tipos de células son las bacterias y cianobacterias. Que estructuras comunes presentan las cianobacterias Cual es la importancia ecológica de las cianobacterias Que problemas causas la presencia de cianobacterias en plantas de potabilización de agua. Por que los arroceros fomentan el crecimiento de Azolla carolininiana en los cultivos de arroz?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

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PRÁCTICA PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS OBJETIVOS

I.

II.

Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración. Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los Aspergillus, Penicilium y Rhizopus Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de Aspergillus, Penicilium y Rhizopus Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria. MARCO TEORICO : COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas. Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno de otro en cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2. La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales cromóforos del compuesto. 2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES PARED CELULAR El espesor oscila generalmente entre 0.150  m y 0.500  m de espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8  m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son más delgadas que las células de cultivo antiguo. GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptídicos. Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicocos, polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminoácidos como D-alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol. 17

GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene el antígeno o somático conocido como lipopolisacárido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de 0.0075  m. 2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de muestras clínicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos. Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son: a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o sólidos. Producto líquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino. Cultivo en medio sólido. Puede prepararse una suspensión del material en una gota de solución salina colocada previamente en el portaobjetos, extendiéndola con ayuda del asa de platino. b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente. c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de los microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran número de fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales de fijación son: por el calor y alcohol en frío. d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos. e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante. f. Secado. Se secará la preparación al aire. CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los cromóforos presentes. a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico, término que no índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la molécula es aniónica o catiónica.  Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.  Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como estructuras citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico.  Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno básico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.  Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej: Sudán III. CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina. 18

b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las características de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram, Tinción ácido-alcohol resistente. c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos, Tinción de esporas, Tinción de cápsulas, Tinción de corpúsculos metacromáticos III.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: PREPARACIÓN BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL

DE

UN

FROTIS

3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS Preparación del Frotis -

Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porción azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posición vertical como sea posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20). Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posición plana en la superficie del líquido. Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el centro de éste (el portaobjeto deberá estar numerado). Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala trazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos. Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.

Fijación Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre. Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra hacia arriba. - Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción. -

3.2. TINCIONES SIMPLES Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno (solución acuosa al 1%), Safranina (solución acuosa 1%), Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión. TINCIÓN DE AZUL DE METILENO Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables. Procedimiento - Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis. - Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos m muy finos. - Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis. - Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos. 19

-

Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante. Secar al aire, a temperatura ambiente. Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

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TINCIÓN DE SAFRANINA Las bacterias aparecen de color rojo. Procedimiento - Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis. - Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos. - Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis. - Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos. - Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante. - Secar al aire, a temperatura ambiente. - Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión. Grafique la Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram, Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión. TINCIÓN GRAM El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas. Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes celulares. Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables. Reactivos - Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua destilada csp=100 ml) - Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada= 100 ml) - Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial - Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml) Procedimiento - Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia. - Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso de tinción. - Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño. - Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua. - Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos más o menos. También puede utilizar etanol comercial como decolorante , en este caso dar más tiempo aproximadamente 1 minuto. - Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño. - Secar al aire, a temperatura ambiente. - Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión. Grafique la Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ 21

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MARCO TEORICO : TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS 1. ASPERGILLUS A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas conidiales, Morfología de los conidióforos, fiàlides y metulas, y en la presencia de células de Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura se muestra las principales estructuras morfológicas del género Aspergillus:

B. APLICACIONES INDUSTRIALES En la producción de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera: ALFA y BETA-AMILASA. El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque se usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales. Origen de alfa-amilasa'. Fúngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del páncreas. En la producción de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados. INVERTASA O SACARASA. 22

Origen y acción'. La hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azúcar invertido) puede ser realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6. La aplicación de enzimas en los detergentes Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y períodos más cortos de lavado. Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actúan sobre los materiales que constituyen las manchas, facilitando la remoción de estos materiales y de forma más efectiva que los detergentes convencionales. •

Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por hidrólisis, pero las lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo ocurre en la interfase entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética ha conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa Hamicola , que se logró producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".

Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos Extracción de aceite. El uso de algunos preparados celulolíticos en el proceso de extracción ha tenido un efecto positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado enzimático producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extracción del aceite de soya. En condiciones óptimas, el contenido de aceite de soya extraíble (24.9 % en base seca) y el porcentaje de recuperación del aceite de soya (99 %). El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extracción de aceite a partir de las semillas de ajonjolí, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de aceite extraído fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjolí, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite de cacahuate y de 55.3 a 57.1 % Extracción de colorantes. La extracción de colorantes es otra aplicación atribuida a algunos preparados enzimáticos. Extracción de antioxidantes con preparados enzimáticos con actividades mixtasmixtas El preparado enzimático comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente pectinasa, pero ambién celulasa y hemicelulasa, producido por Aspergillus niger, no sólo fue efectivo al aumentar la extracción de los fenoles debido a la degradación de los polisacáridos (celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la cascara de uva, sino que mejoró también la actividad antioxidante de los extractos fenólicos

2. PENICILLIUM Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de la esporacojinete. Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fíales en forma de botella. Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes. 23

La ramificación es una característica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente. Colonias de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca, a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37 °C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación abundante. Olor aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina). ECOLOGIA El Penicillium es género grande y difícil encontrado casi por todas partes, y generalmente el género más abundante de hongos en suelos. La ocurrencia común de la especie del Penicillium en alimento es un problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier moho. Se le encuentra en el polvo doméstico, en los edificios húmedos y mohosos donde deteriora diferentes materiales de construcción, entre los que resaltan el papel de decoración (crece bien en la cola empleada para su adhesión a las paredes). No muestra una notable variación estacional. Las máximas concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las áreas urbanas que en las rurales). APLICACIONES DEL PENICILLLIUM Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres humanos. Los quesos tales como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se maduran con la especie de Penicillium y son absolutamente seguros de comer. La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming producía 2 mg de penicilina por cada litro de cultivo, posteriormente se encontró que otros Penicillium eran mejores productores de penicilina y se eligió a Penicillium chrysogenum como cepa súper productora de este antibiótico. Finalmente, la selección de sucesivos mutantes súper productores y la mejora en las técnicas de fermentación realizadas por la industria biotecnológica han hecho que actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina Se le emplea en la producción de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina. Incluye las siguientes especies:  Penicillium bilaiae > Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos camembert y brie. > Penicillium candida, ídem. > Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola. > Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistémica emergente que afecta a roedores y humanos, especialmente a personas inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis > Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina. > Penicillium purpurogenum > Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort, danish blue y recientemente también gorgonzola 3. RHYZOPUS Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rápida. En ciertas especies son patógeno de 24

la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la producción del tempeh, un alimento fermentado derivado de las sojas. Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son genético idénticos a su padre, los zygospores se producen después de que dos mycelia se fundan durante la reproducción sexual, y dan lugar a las colonias que pueden ser genético diferentes de sus padres.

EL GÉNERO MUCOR Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente los medios de cultivo. EL GÉNERO RHYZOPUS Posee estolones y rizoides, razón por la cual invaden rápidamente los medios de cultivo. En este Género los esporangióforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides. EL GENERO ABSIDIA Los esporangióforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides. APLICACIONES INDUSTRIALES Importancia económica, síntesis de productos industriales: producción de ácidos láctico, cítrico, succínico, oxálico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe

Mucor racemosus: Se presenta en dos formas según el medio en que se desarrolle. Una forma típica o filamentosa, en medios sólidos y otra forma atípica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios líquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentación de mostos azucarados, en cambio, la forma típica se usa para obtener enzimas (amilasas).

Mucor rouxil: Hidroliza el almidón posteriormente y posteriormente fermenta los azúcares formados

en la hidrólisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentación alcohólica. Esto es en síntesis lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma típica se emplea para la fabricación de amilasas. Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amilolítico, puede hidrolizar el almidón y producir etanol, pero en menor proporción que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de fermentación alcohólica, en cambio, en los últimos años se

25

IV.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

A.

MATERIAL   

  

Asa de kolle Mechero Azul de lactofenol

Láminas portaobjetos Láminas cubreobjetos Microscopio

B. MATERIAL BIOLOGICO  Muestras de alimentos con hongos  Cultivo de Aspergillus niger  Cultivo de Penicillium C. REACTIVOS C.1. Azul de lactofenol. Fenol Ácido láctico

20 g 20 g

Glicerol Agua destilada

40 ml 20 ml

Disolver los componentes antes mencionados y después se agrega el colorante. Se puede emplear cualquiera de los siguientes: Azul de algodón 0.05g Azul de metileno 0.05 g Azul de cotton de Perrier 0.05 g 2. CULTIVOS Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente. Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rápido crecimiento, son vellosas o algodonosas y empujan la tapa de la placa Petri. Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrón o negro con la madurez a medida que se forman esporas. 2.1. AGAR SABOURAUD A. FUNDAMENTO Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a infecciones dermatológicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que pueden estar presentes en la muestra. B. COMPOSICION

C. PREPARACION

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I.

RESULTADOS

A. ASPEGILLUS NIGER

Caracteres Macroscópicos  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................

Caracteres Microscópicos  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................

B. ASPERGILLUS FUMIGATUS

Caracteres Macroscópicos  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................

Caracteres Microscópicos  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................

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C. ASPEGILLUS FLAVUS

Caracteres Macroscópicos  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................

Caracteres Microscópicos  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................

D. PENICILLIUM

Caracteres Macroscópicos  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................

Caracteres Microscópicos  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................  ..................................................................................... ..................................................................................... ..................................................................................... .....................................................................................

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a. RHYZOPUS

Caracteres Macroscópicos  ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................

Caracteres Microscópicos  ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................

b. MUCOR

Caracteres Macroscópicos  ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................

Caracteres Microscópicos  ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................

c. ABSIDIA

Caracteres Macroscópicos  ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................

Caracteres Microscópicos  ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................ ........................................................................................................

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V.

CUESTIONARIO: COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL 1. ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades? 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria? ¿De qué manera influye el pH en la coloración? ¿Por qué es necesario utiliza métodos de tinción para visualizar a las bacterias? Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique la función que cumple cada uno de ellos. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique la función que cumple cada uno de ellos. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice. ¿A qué se denomina mordiente y mencione tres ejemplos? Mencione tres razones por las que un microorganismo grampositivo se observa gramnegativo. Mencione tres microorganismos (género) que sean cocos grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.

CUESTIONARIO: TINCIÓN Y MORFOLOGÍA DE HONGOS 1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus? 2. Mencione las enfermedades producidas por el género Aspergillus? 3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscópicas y microscópicas)? 4. Cómo diferencia el género Aspergillus del Penicilium? 5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus? 6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium? 7. Dibuje e indique las partes del Penicillium? 8. Mencione Ud. Cuáles son las características macroscópicas del Penicillium? 9. Cuáles son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes? 10. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes? 11. Indique Ud. Cuáles son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una Absidia? 12. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?

VI.

OBSERVACIONES

VII.

CONCLUSIONES

30

PRÁCTICA EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO; ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN I.

OBJETIVOS

1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial. 2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el análisis microbiológico. 3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control microbiológico de los alimentos.

II. MARCO TEÓRICO El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es el primer paso en el control microbiológico de los alimentos, pues de él dependerá el éxito del análisis. 2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas. 2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de calentamiento que la esterilización con vapor. Su uso está limitado primariamente a la esterilización de material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor. El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos. En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena peptídica y se requiere más energía para abrir las moléculas, de allí la aparente mayor estabilidad del organismo. Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una temperatura de 160-170ºC durante 1 hora.

31

a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen. b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de vidrio. 2.1.2 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de cadena única en el ADN, y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática, como resultado de activación o liberación de una nucleasa. El calor produce también una pérdida de la integridad funcional de la membrana y filtración de pequeñas moléculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosómico y aparentemente es resultado de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe también degradación del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a temperaturas elevadas. a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos. b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo. c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presión y 121ºC por 1520 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización. c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilíndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de: ♠ ♠ ♠ ♠ ♠

2.2

Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica. Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua). Orificios superiores para purga de gases de combustión. Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro. Canastilla para colocar el material a esterilizar. ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.

2.3

ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA 32

Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método presenta muchas dificultades técnicas.

III. MATERIALES Y EQUIPO -

Material de vidrio: pipetas, palcas Petri Erlenmeyer, tubos de ensayo Papel craff, algodón, gasa, tijeras Mechero de Bunsen Horno Pasteur de aire caliente Autoclave

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR a) Preparación de tubos matraces -

Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados según el método siguiente: De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de fibra, extendida, rectangular Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra. Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud. Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono truncado, con el diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.

Tubos de Ensayo - Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas. Frascos y Matraces - Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con hilo pabilo. - Colocar el nombre del medio de cultivo - Rotular la fecha de preparación. b) Preparación para proteger las pipetas - En el extremo de succión de cada pipeta introducir una porción de algodón con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado. - Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta girándose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata con una torsión para protegerla y se rompe el resto de papel sobrante. - Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilización. c) Preparación de las placas Petri 33

-

Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir íntegramente las placas petri completas. Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa poniéndose esta en el centro, se envuelve la placa tomándose dos extremos opuestos del papel, dándose una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en triángulos, rematándose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dándosele una apariencia de paquete de regalo.

4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal. a) Procedimiento para la esterilización en horno - Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno. - Si hay un ventilador verifique que esté funcionando. - Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a l75ºC. sígase calentando durante 60 minutos más. - Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60ºC. Abra la puerta del horno. - El papel empleado para envolver deberá de haber tomado un color marrón oscuro, si el color del papel es amarillo pálido indicará que el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicará que el horno se ha calentado demasiado. 4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO a) Procedimiento para la esterilización con autoclave - Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cerciórese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje. - Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden añadir indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada. - Cierre la tapa de la autoclave, cerciorándose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado. - Abrir la válvula de salida del aire. - Inicie el calentamiento de la autoclave. - Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicará que todo el aire ha sido expulsado de la autoclave. - Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura ligeramente. - Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120ºC se deberá regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos. - Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido. - Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la válvula de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del autoclave. - Deje enfriar la autoclave y a continuación retire cuidadosamente la canasta con los utensilios estériles.

34

V.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos ejemplos? 2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control microbiológico, por qué? 3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el autoclave. 4. Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia. 5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilización.

VI.

OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

35

PRÁCTICA MEDIOS DE CULTIVO I.

OBJETIVOS a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano. b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología. c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más corrientes. d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de cualquier medio de cultivo.

II. MARCO TEORICO 2.1

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente no energética como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energía son necesarias para su desarrollo. 2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LOS MICROORGANISMOS A. FUENTES DE CARBONO En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares en forma de mono o disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azúcares más complejas para obtener energía., como es el caso del almidón. Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho que es característico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas. Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium. Por último, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energía un gran número de componentes hidrocarbonados diferentes. B. FUENTE DE NITROGENO Pueden presentarse como proteínas completas, que sería el caso de la gelatina o incluso proteínas aún más complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc. Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrógeno que corresponden a péptidos o polipéptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son también proteínas que están parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal. El bio-Thione, es una denominación comercial correspondiente a una peptona pépsica de carne. La caseína en forma de peptona tripsica de caseína se usa para estudiar la formación de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de triptófano que posee este tipo de peptona. También es utilizada para estudiar la reducción de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos. 36

La peptona papaínica de soja, es una fuente de nitrógeno especialmente para hongos y ciertos gérmenes como Neisserias. Otra fuente de nitrógeno serian: nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de amonio, aminoácidos, etc. 2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGÉTICOS DE LOS MICROROGANISMOS A. FUENTE DE AZUFRE Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algún aminoácido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc. Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS. B. FUENTE DE FÓSFORO En general, las bacterias que utilizan el fósforo lo suelen hacer en forma de fosfato. C. IONES METÁLICOS Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc. También se encuentra otro tipo de iones metálicos Cobalto, Molibdeno. Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentración pueden inhibir el ‘crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros. - Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous. - Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus. D. FACTORES DE CRECIMIENTO Existen bacterias que aún con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una serie de componentes definidos que no son capaces de fabricar por sí solas. A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algún tipo de aminoácido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc. Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos: - Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido nicotinico para el crecimiento de Xanthomonas. - El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias húmedas, lisas y grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y está enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo. - Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en “gotas de mercurio” brillantes es fácil de apreciar. - Agar sangre enriquecido con nitrógeno suplementario y vitaminas del complejo B para el crecimiento del Flavobacterium. E. FACTORES INHIBIDORES Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de microorganismo por bloqueo de sus procesos metabólicos. Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria. La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos. Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los Grampositivos. Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos. 37

Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y tipificación de pruebas bioquímicas de las bacterias. Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos: Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias Gramnegativas. El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias. Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentración de sales biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes. 2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario: - Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo. - Unas condiciones físico-químicas apropiadas. De acuerdo con ello, habría que considerar: A. TEMPERATURA ÓPTIMA Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categorías siguientes en función de los rangos de temperatura de crecimiento. - Los psicrófilos crecen bien a 0ºC y tienen una temperatura óptima o inferior, la máxima es de 20ºC. Se aíslan del Ártico y Antártico. Pueden crecer a 0ºC, aunque su temperatura óptima sea 20 a 30ºC y la máxima de casi 35ºC. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefacción de alimentos refrigerados. - Los Mesófilos, crecen a una temperatura óptima de 20 a 45ºC, siendo la mínima de 15 a 20ºC y la máxima de casi 45ºC. La mayoría de los microorganismos pertenecen a esta categoría. Las bacterias patógenas para el hombre suelen crecer a una temperatura óptima de 37ºC. - Los termófilos, pueden crecer a una temperatura de 55ºC o superiores. La temperatura mínima es normalmente de 45ºC y la óptima es de 55 a 65ºC. Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberías de agua caliente, aguas termales. - Los Hipertermófilos, temperatura óptima de entre 80ºC y casi 113ºC, no crecen por debajo de 55ºC. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino. RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO Microorganismo Bacillus psichrophilus Microcococcus cryophilus Pseudomona fluorescens Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Thermoplasma acidophilum Bacillus stearthermophilus Sulfolobus acidocaldarius Pyrococcus abyssi Pyrodictium occultum Pvrolobus fumarii Candida scotti Saccharomyces cerevisiae Mucor pusillus

Temperaturas cardinales (ºC) Mínima Óptima Máxima -10 23-24 28-30 -4 10 24 4 25-30 40 6.5 30-37 46 0 37 44 10 37 45 30 35-36 38 45 59 62 30 60-65 75 60 80 85 67 96 102 82 105 110 90 106 113 0 4-15 15 1-3 28 40 21-23 45-50 50-58

B. GRADO DE HUMEDAD Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento. En general, cualquier medio sólido o líquido requiere cierta proporción de agua. 38

En medios sin agua es muy difícil el crecimiento bacteriano: de ahí que la liofilización y cualquier método de deshidratación, sea un buen medio de conservación. C. pH Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo de crecimiento. - Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5. - Los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0 - Los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5 La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos. La mayoría de hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4 a 6. Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática o inhibiendo la actividad de las enzimas y las proteínas transportadoras. El pH óptimo en la mayoría de los casos es cercano a la neutralidad. Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy ácido, a pH próximo a 0. Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8. El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9. En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos que se producen por la degradación de los nutrientes por parte de las bacterias. Es típico que en la fermentación glucídica se produzca acidificación del medio o en la degradación proteica utilizando la bacteria sales amónicas como fuente de energía se alcalinice el medio. Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro de los límites fisiológicos. EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO Microorganismo Picrophilus oshimae Thiobacillus thiooxidans Sulfolobus acidocaldarius Lactobacillus acidophilus Staphylococcus aureus Proteus vulgaris Escherichia coli Clostridium sporogenes Pseudomonas aeuriginosa Nitrosomonas Bacillus pasteurii Bacillus alcalophilus

Límite inferior 0 0.5 1.0 4.0-4.6 4.2 4.4 4.4 5.5-5.8 5.6 7.0-7.6 8.5 8.5

pH óptimo 0.7 2.0-3.5 2.5 5.8-6.6 7.0-7.5 6.0-7.0 6.0-7.0 6.0-7.6 6.6-7.0 8.0-8.8 SD 10.6

Límite superior SD 6.0 4.0 6.8 9.3 8.4 9.0 8.5-9.0 8.0 9.4 SD 11.5

D. PRESIÓN OSMÓTICA Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo superiores. Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotónicos; este hecho es debido a su pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y ésta se rompa. En las bacterias halófilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de cloruro sódico; Ej: Staphylococus. Como la concentración osmótica de un hábitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw). Actividad del Agua

Ambiente

Microorganismo 39

1.00 (agua pura) 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.60

Sangre Pan Jamón Salami Conservas Lagos salados Pescado salado Cereales, dulces Chocolate Leche deshidratada

Mayoría de Gramnegativos no halófilos Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus Staphylococus, Saccharomyces Penicillum Halobacterium, Aspergillus Actinospora Aspergillus Saccharomyces Xeromyces

E. CONCENTRACION DE OXÍGENO Un organismo que puede crecer en presencia de oxígeno atmosférico es AEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO. Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia. Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto en su presencia como en su ausencia. Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia. Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energía mediante la respiración aerobia y deben utilizar vías de fermentación o respiración anaerobia para este objetivo. Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son MICROAEROFILOS que son dañados por el nivel de oxigeno atmosférico 20% precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxígeno. 2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes clasificaciones. De acuerdo con esto y según criterios se podrían dividir en: 2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PROPORCIÓN EN AGUA A. MEDIOS SÓLIDOS Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por encima del 15%. La importancia, de los medios sólidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificación y visualización del crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios específicos y diferenciales de caracteres, sólidos elaboración de antibiogramas, etc. Ejemplo de medios de cultivo: - Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos. - Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes. - Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus. - Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos. - Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfología de las colonias. B. MEDIOS LÍQUIDOS También denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realización de recuentos bacteriológicos por turbidimetría, especialmente útil en levaduras, para la realización de inóculos, para obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibióticos, ácidos lácticos, etc. 40

Ejemplo de medios de cultivo: - Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de glucosa. - Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol. - Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas - Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difíciles de cultivar. C. MEDIOS SEMISÓLIDOS Son medios intermedios entre los líquidos y los sólidos; su proporción en agar suele ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semisólida. Son útiles para algunas pruebas bioquímicas: - Agar SIM, estudiar movilidad, producción de H2S, Indol. - Agar MIO, estudiar movilidad, producción de Indol y Ornitina. 2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU USO O UTILIZACIÓN A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas. Estos, según sea su composición, se pueden a su vez dividir en: A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les añade además de los componentes básicos, uno o varios elementos, como por ejemplo caseína soja, triptófano, etc., que facilitan el crecimiento de algún tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que buscamos. A.2. MEDIOS SELECTIVOS Son medios en cuya composición presentan componentes que impiden el crecimiento de algún tipo bacteriano. - Medio Salmonella Shigella, contiene en su composición sales biliares, citrato de sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme. A.3. MEDIOS DIFERENCIALES Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y, lo que es más característico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van a crecer en dicho medio, dan una información suplementaria y específica, es decir, diferencial; por ejemplo: - El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composición eosina y azul de metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias, que según utilicen o no la lactosa darán lugar a una coloración característica para cada tipo de microorganismo. Los medios diferenciales suelen ser también selectivos y se usan con fines de aislamiento e identificación. - Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa, Lactosa y Sacarosa, además si puede producir H2S. - Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el aminoácido Lisina. - Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono. B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL Son medios ya sea en forma líquida o sólida que sirven para el cultivo de la mayor parte de las bacterias. Su composición va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales y agua. Dentro de los medios generales más empleados tendríamos el caldo común, que está compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sódico y agua. 41

C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales medios generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses. 2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU COMPOSICIÓN A. MEDIOS NATURALES B. MEDIOS SEMISINTÉTICOS C. MEDIOS SINTÉTICOS D. MEDIOS COMPLEJOS 2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIÓN A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS B. MEDIOS YA PREPARADOS C. MEDIOS SÓLIDOS EN PLACA PETRI D. MEDIOS SÓLIDOS EN TUBO D.1. Con Agar Inclinado D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta E. MEDIOS LÍQUIDOS EN TUBO

III. MATERIALES Y REACTIVOS d. MATERIAL REQUERIDO - Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Espátula. Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo. e. MEDIOS DE CULTIVO - Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey Agar Sabouraud. Agar LIA .

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1. PREPARACIÓN - Para la preparación de medios de cultivo se usa agua destilada. - El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, según la cantidad que está indicada en la etiqueta del medio de cultivo. - Agregar el medio de cultivo en el matraz, y añadir la mitad del volumen de agua que se requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensión homogénea, después incorporar el agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al conjunto las partículas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente. - Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolución. - Para reconocer que se ha alcanzado una disolución completa, al agitar no debe adherirse el medio a la pared interna del recipiente; la solución es viscosa y resbala libremente. - Tapar el matraz con el tapón de algodón, envolver con papel Kraft y pabilos. 4.2. ESTERILIZACION - Se esterilizará el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario. - El tiempo es de 15 minutos a 121ºC. 42

4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO - Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55ºC. - Previamente hay que remover el medio de cultivo haciéndolo oscilar en sentido circular su recipiente para garantizar la homogeneidad del medio. - Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en la posición deseada: o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado o Pico o inclinado o Fondo o El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda. - Repartir: o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:  Agar nutritivo  Agar Mac Conkey  Agar EMB  Agar Sabouraud o En Tubos: la posición de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)  Agar TSI  Agar LIA o En Tubos: la posición de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)  Agar Citrato de Simmons o En tubos: la posición de Fondo (aproximadamente 3 ml)  Agar SIM 4.4. ALMACENAMIENTO - Los medios de cultivo deshidratados deberán conservarse en lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura de 15ºC a 30ºC, y en envases bien cerrados. - Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un sólo tiempo limitado de conservación. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservación es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 – 8ºC. - Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, deberán pre encintarse con cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa. 4.5. COMPOSICION Y PREPARACIÓN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS UTILIZADOS AGAR NUTRITIVO Composición Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m Preparación _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripción del Medio Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ Requerimiento no Energético Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fósforo: ________________________ Iones metálicos: __________________________ 43

Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: ______________________ Según su proporción en agua _________________________________________________________ Según su uso o utilización _________________________________________________________ Según la composición _________________________________________________________ Según su presentación _________________________________________________________ AGAR MAC CONKEY Composición Peptona de caseína 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne 3.0 g. Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro de sodio 5.0 g Agar – Agar 12.5 g. Agua destilada 1000 ml. Preparación _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripción del Medio Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ Requerimiento no Energético Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fósforo: ________________________ Iones metálicos: __________________________ Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: _______________________ Según su proporción en agua _________________________________________________________ Según su uso o utilización _________________________________________________________ Según la composición _________________________________________________________ Según su presentación _________________________________________________________ AGAR TSI Composición Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa, Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa, 44

Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar – Agar, 12 g. Glucosa, Agua destilada, 1000 ml

1.0 g

Preparación _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripción del Medio Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ Requerimiento no Energético Fuente de azufre: ________________________ Fuente de fósforo: _______________________ Iones metálicos: _________________________ Factores de crecimiento: ___________________ Factores de arranque: _____________________ Factores inhibidores: _____________________ Según su proporción en agua _________________________________________________________ Según su uso o utilización _________________________________________________________ Según la composición _________________________________________________________ Según su presentación _________________________________________________________ MEDIO EMB. Composición Fosfato dipotásico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml Preparación _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripción del Medio Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ Requerimiento no Energético Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fósforo: ________________________ Iones metálicos: __________________________ Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: ______________________ Según su proporción en agua ___________________________________________ Según su uso o utilización ___________________________________________ Según la composición _____________________________________________ Según su presentación. _____________________________________________ 45

CALDO LURIA BERTANI (LB) Composición Extracto de levadura,….. g. , Cloruro de sodio……….. g. Triptona…………………g Agua destilada…………. ml Preparación _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Descripción del Medio Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ Requerimiento no Energético Fuente de azufre: ________________________ Fuente de fósforo: _______________________ Iones metálicos: _________________________ Factores de crecimiento: ___________________ Factores de arranque: _____________________ Factores inhibidores: _____________________ Según su proporción en agua _________________________________________________________ Según su uso o utilización _________________________________________________________ Según la composición _________________________________________________________ Según su presentación _________________________________________________________

V. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

CUESTIONARIO Defina Ud. los siguientes términos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados, Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo. Cuáles son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo? Cual es al función del agar-agar en los medios de cultivo? ¿Por qué es difícil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw? ¿A qué se denomina medio sintético o definido? De 3 ejemplos. ¿Qué es un medio complejo?. De 3 ejemplos. ¿Qué es un medio selectivo?. De 3 ejemplos. ¿Qué es un medio diferencial?. De 3 ejemplos. Realice una gráfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crecimiento microbiano, y clasifique en categorías diferentes según los rangos de temperatura de su crecimiento (psicrófilos. Psicrótrofos, mesófilos, termófilos, Hipertermófilos? ¿Con qué sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4. ¿Qué es un medio de transporte y para qué sirve? De 2 ejemplos. ¿Qué medios diferenciales conoce? ¿Qué utilidades tienen? ¿Qué es un medio selectivo y qué función tiene? Mencione por lo menos 3 y ¿qué sustancias se le agregan para que cumpla esa función? ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos? ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos microaerófilos? 46

16. ¿Para qué sirve utilizar un medio de cultivo semisólido? ¿Cómo se obtiene la consistencia del agar blando?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

47

PRÁCTICA SIEMBRA DE MICROORGANISMOS I.

OBJETIVOS -

Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse. Saber llevar a cabo los diferentes métodos de siembra e inoculaciones. Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en condiciones de asepsia y esterilidad.

II. MARCO TEORICO Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados. Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas: - Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca. - Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros. 2.1. SIEMBRA Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de inoculación, puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades: a. Para hacer un aislamiento. b. Para hacer un transplante. AISLAMIENTO Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere un medio sólido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formación de colonias separadas. Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrá características especiales, la morfología bacteriana será también distintiva. TRANSPLANTE Significa la separación previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede ser líquido o sólido. Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioquímicas y como resultado la identificación específica. Los trasplantes se pueden realizar: 1. De líquido a sólido. 2. De líquido a líquido. 3. De sólido a sólido. 48

4.

De sólido a líquido.

2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION Existen los siguientes materiales:  ASAS DE SIEMBRA El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango cilíndrico para un uso sencillo. Se utiliza para inoculación o siembra por estría en medios sólidos, presentan un arco bastante cerrado en su extremo cuyo diámetro es más o menos específico es decir muchas asas son calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las más utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.

 HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA) Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semisólidos y sólidos.

 ASAS DE DIGRASKY Son asas de vidrio en forma de triángulo más o menos abierto. Se utiliza para extender el inóculo líquido previamente adicionado en la placa, a través de una pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.

 HISOPOS Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecación, deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a través del hisopo en el medio de cultivo. Se suele comercializar ya estéril listo para utilizar y desechables. 

PIPETAS 49

Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por esterilización o de plástico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores para pipeta tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene volúmenes graduados son muy utilizados en bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma. También nos encontramos con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio de cultivo. 2.3. PREPAPACION DE INOCULOS Un inóculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microorganismos problema. Así pues, se debe partir, por un lado, de un, cultivo puro y, por otro lado, de una concentración adecuada de microorganismos problema. Si la muestra no es pura se aplicará distintos métodos para el aislamiento mediante técnicas específicas, como es el caso de la siembra por estrías en placa o por agotamiento, o la técnica de la placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento más o menos separado de los microorganismos. Es muy útil usar medios de cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que permitan el crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como puro.  METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta pasteur estéril en cantidad suficiente y, en ambos casos se homogenizará 2.4. PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra es sólida o semisólida se tomara siempre con asa de siembra estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipera pasteur estéril en cantidad suficiente, y en ambos casos se homogenizará posteriormente en el medio específico de cultivo. Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio líquido se homogenizará y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para organismos patógenos coincidirá con la temperatura corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilización de un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo el medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación posterior y de la cantidad de inóculo que se requiera. Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de cultivo sólido, se utilizara diferentes técnicas de siembra y posteriormente se verificará el cultivo, ej. siembra por agotamiento. Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido, se homogenizará la mezcla inicial por agitación y se dejará crecer a una temperatura de 37ºC por 24 horas. Es importante que los inóculos sean siempre jóvenes. Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y ésta se añade a un medio sólido, se extenderá con el asa de Digrasky, previamente estéril a través de toda la placa incubándose a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren también cultivos jóvenes. Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o caldo de cultivo base.

50

A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximados de microorganismos problema. En estos casos, los inóculos se establecen en medios líquidos y el número de microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparación de medios líquidos con diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una batería de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez según la concentración de sulfato bárico. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración de microorganismos. 2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MÉTODOS DE AISLAMIENTO) El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea líquido o sólido se denomina siembra o inoculación. El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. La siembra del inóculo puede realizarse en medio sólido o en medio líquido. 2.5.1. SIEMBRA DEL INÓCULO EN EL MEDIO SÓLIDO Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. 2.5.2. SIEMBRA DEL INÓCULO EN PLACA Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio sólido. Se va descargando gradualmente el inóculo, para que en los últimos planos del medio queden escasas células aisladas que en el ambiente nutritivo se irán multiplicando, logarítmicamente hasta formar colonias puras. Los métodos de aislamiento varían según el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el inóculo. Cualquiera que sea el método ensayado, aprovechando el máximo de superficie del medio se logra el aislamiento de mayor número de cepas microbianas. CLASES DE SIEMBRA - Siembra por agotamiento o por estrías. - Siembra por difusión. - Siembra por diseminación. a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inóculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aquí se realizará movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa no tomándose en ningún momento nuevos inóculos y no levantándose el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.

- ESTRIA MÚLTIPLE Se tomará la muestra problema con el asa de siembra previamente estéril y dicho inóculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo a otro de ésta solo en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma dirección se repite la 51

operación hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que tienen cabida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el interior de la misma. El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez que se va arrastrando y separando más la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice en cada estría un flameado previo del asa de siembra.

- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la placa de tal forma que esta queda dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de inóculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig - zag. Realizamos la misma operación sin flamear el asa en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema observándose en el último cuadrante las colonias más aisladas o separadas. - TECNICA DE LOS TRES GIROS Se rotula la placa en forma análoga al caso anterior. Se toma inóculo con el asa de platino y se siembra por estría la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90º y volveremos a sembrar una segunda vez. Así sucesivamente hasta completar toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) ésta técnica no es muy utilizada.

b. SIEMBRA POR DIFUSION (TÉCNICA DE BARRY) En este método, el medio de cultivo se mezcla con el inóculo, al solidificar las colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirán para contaje de colonias. 52

Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una temperatura de 45 a 50ºC) en el tubo, en el tubo se adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizará la muestra en el tubo mediante el vibrador. Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará solidificar, la mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenización en este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación de CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos. c. SIEMBRA POR DISEMINACIÓN (CON ASA DE DIGRASKY). Consiste en adicionar al medio sólido, un inóculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml según los casos con una pipeta graduada estéril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se puede utilizar para el recuento de células viables, antibíogramas, etc.

2.6. SIEMBRA DEL INÓCULO EN TUBO a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de ésta realizando movimientos ascendentes en zig - zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos períodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de ureasa.

b. SIEMBRA POR PICADURA Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posición central. Esta técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semisólidos ej. medio de oxidación - fermentación de Hugh-Leiffson.

53

c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este método se lleva a cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato entre otras.

2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA CELULARES El empleo de microorganismos en Biotecnología se fundamente en la obtención de cultivos puros, que están constituidos por una única especie microbiana. La mayoría de las aplicaciones en biotecnología conlleve el uso de cultivos puros. La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún método de dilución. El método más útil y práctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las células individuales queden separadas una de otras. Cada célula aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las células que componen la colonia son la progenie de una única célula original. Existen varios métodos para confirmar la pureza de un cultivo: 1. 2.

Repitiendo la operación de aislamiento; una colonia aislada procedente de un aislamiento en placa inicial debería dar lugar al repetir la operación a colonias todas del mismo tipo, y cuya morfología concuerda con la del aislamiento inicial. El examen microscópico de los organismos procedentes de una colonia deberían mostrar un único tipo celular. Los métodos diferenciales de tinción Gram, son útiles pare establecer que la colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.

Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para mantener la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando asépticamente, el biotecnólogo tome prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminación o de las soluciones con microorganismos no deseados.

54

III. MATERIALES Y EQUIPOS Material de Vidrio - Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100) - Placas petra - Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml - Erlenmeyer

Otros materiales - Gradillas - Mechero Bunsen - Asas de siembra - Algodón - Pinzas

Equipos - Estufa 37ºC - Autoclave Reactivo y Medios de cultivo - Medios de cultivo  Agar Mc Conkey  Agar nutritivo  Agar Saboraud

 Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta)  Agar SIM (tubos fondo)  Caldo SIM

IV. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS 4.1. SIEMBRA DE UNA MUESTRA LÍQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY Muestra: Inóculo de un cultivo puro Medio de cultivo: Agar nutritivo ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA Muestra: Microorganismos Medio de cultivo: Agar Mac Conkey Medio de cultivo: Agar EMB Medio de cultivo: Agar nutritivo Medio de cultivo: Agar Sabouraud Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 4.3. TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos Medio de cultivo: Agar Sabouraud Medio de cultivo: Agar Mac Conkey Medio de cultivo: Agar EMB Medio de cultivo: Agar nutritivo Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características ____________________________________________________________ 55

____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________

V.

CUESTIONARIO

1. 2. 3. 4.

¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen? ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia? ¿Por qué debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia? Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado. 5. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? 6. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra? 7. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

56

PRÁCTICA CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE COLONIAS I.

OBJETIVOS -

Aprender las diferentes características de la morfología colonial utilizadas en la identificación de bacterias. Estudiar características culturales de crecimiento de los microorganismos en medio sólido Investigar las manifestaciones de crecimiento de los microorganismos en medio líquido

II. MARCO TEÓRICO GENERALIDADES: Para estudiar las características de los microorganismos (forma, estructura, tamaño, consistencia, cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos apropiados según el tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios sólidos y líquidos. Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los estreptococos. Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme. Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, además de éstas características se requiere también estudiar la fisiología y propiedades inmunológicas de las bacterias para poder realizar una identificación completa. La morfología colonial es comparable a una estadística ya que se deriva de una célula individual pero es la característica de la masa celular. Así pues, por ejemplo, la pigmentación es aparente en la colonia, pero no en la célula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cápsula muy grande. Medida de las colonias. ésta característica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un diámetro de varios milímetros. Forma. Está determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras se pueden observar varias formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas. 57

Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar.. La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concéntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa. Pigmentación. Esta característica es muy común en las bacterias saprófitas en las que las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patógenos uno de los pigmentados más importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se aprecia en las células individuales a que se debe a gránulos intracelulares muy pequeños para verse con luz transmitida.

III. MATERIALES Y EQUIPO Se utilizarán las placas y tubos sembrados en la práctica anterior. 1 mechero Bunsen 2 asa bacteriológica

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL TÉRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN MEDIO SÓLIDO

58

SUPERFICIE Lisa Rugosa Plegada CONSISTENCIA (probarla con el asa) Cremosa Membranosa COLOR Se usan términos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido Difusible o no. CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS LUZ TRANSMITIDA (observar a través de la colonia) Opaca: no permite el paso de luz Traslúcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos Observados a través de la colonia. Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos observados a través de la colonia. LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia) Opaca Brillante CULTIVO EN CALDO Al igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de la bacteria sembrada se reflejan en las características que presenta el caldo Inoculado como son: Turbidez: Opacidad más o menos densa, signo de crecimiento. Película: Crecimiento casi continúo sobre el líquido Sedimento: Depósito de células en el fondo del tubo que se resuspende al agitar Crecimiento en caldo Nutritivo 59

Crecimiento en medio semisólido

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Anote las características coloniales de cada cepa en la tabla, basándose en el Texto, las figuras: AGAR EN SUPERFICIE Bacteria Forma Borde Elevación Superficie Consistencia Color Luz transmitida Luz reflejada

MEDIO SEMISÓLIDO 60

Bacteria Movilidad

IV.

CUESTIONARIO

1. Qué método utilizaría para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven, injuriado y envejecido. 2. Por qué algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una característica de forma de película. 3. ¿Cómo se visualiza el polisacárido extracelular y a qué bacteria puede corresponder? 4. ¿Qué es la prueba de catalasa, cómo se realiza y qué utilidad tiene? 5. ¿Cómo se interpretan los resultados de una prueba de fermentación de hidratos de carbono?

V.

OBSERVACIONES

VI. CONCLUSIONES

61

PRÁCTICA CURVA DE CRECIMIENTO I.

INTRODUCCIÓN Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetría mide la entidad de luz transmitida por la suspensión, mientras que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometría. Por estos procedimientos se puede estimar el número de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la multiplicación bacteriana no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión. La relación entre la transmitancia y la absorbancia se expresa matemáticamente de la siguiente manera: Absorbancia = 2 - log % de transmitancia Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelómetro. Para el manejo práctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy útil el uso de matraces con brazo lateral, ya que permite la realización de medidas sin necesidad de tomar muestras del cultivo, evitando así el riesgo de contaminación por la manipulación.

II. OBJETIVOS 1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano. 2) Realizar una curva de multiplicación bacteriana.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la célula aumentan en cantidad, en la mayoría de organismos el crecimiento continuo hasta que la célula se divide en dos nuevas células, proceso denominado fisión binaria. Cada una de las células hijas recibe, un cromosoma completo, copias de todas las macromoléculas, monómeros e iones inorgánicos. El intervalo para la formación de dos células a partir de una se llama generación y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación,na entre los microorganismos, algunos crecen rápidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso días. 62

3.1. CURVA DE CRECIMIENTO Si se inocula un medio liquido con células microbianas, procedentes de un cultivo que ha crecido a saturación, en el que se ha determinado el número de células variables por minuto periódicamente y trazamos una gráfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes: 1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptación, los microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie. 2. Fase Exponencial.- Llamada fase logarítmica, es consecuencia de la división celular y las nuevas células crecen en progresión geométrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial. 3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metabólicos tóxicos. Aquí cesa el crecimiento de una población. 4. Fase de Declinación.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido. Fases de Crecimiento Latencia

Exponencial

Estacionaria

Rezago Adaptación

Logaritmo Divisón celular Crecimiento

Nutrientes se agotan Acumulan metabolitos tóxicos Sesa crecimiento

Muerte Declinación

1

8,0

Turbidez (densidad óptica)

Viables

0,5 7,0 0,25

6,0

5,0

0,1 Tiempo

IV. PARTE EXPERIMENTAL 4.1

0,75

MATERIALES Y REACTIVOS - Cubres - Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo - Cubetas - Caldo Luria Bertani estéril o Caldo nutritivo - Jeringa descartable de 10 cc. - Contómetro Equipo - Mechero Bunsen - Estufa de incubación a 37ºC - Microscopio - Espectrofotómetro

63

Densidad óptica

Log 10 organismos viables/ml

9,0

V.

METODOLOGIA 5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO Curva de Crecimiento.- Las células que están creciendo en un cultivo discontinuo (en un matraz en agitación) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las células en fase de latencia, que proceden de una alícuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida. Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rápido. La duración de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inóculo, de la temperatura, de la concentración en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la aireación, y de la concentración de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo. Una vez que las células empiezan a crecer rápidamente, se dice que han entrado en la fase de crecimiento logarítmica (log) o exponencial. En este estadio las células crecen rápidamente, y a diferencia de las células de las fases de latencia y estacionaria, la mayoría de las células se hallan en el mismo estado fisiológico. La velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de nutrientes y de la aireación de cultivo. La constante de velocidad de crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicación o tiempo de generación). Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las células no están todas en el mismo estado fisiológico; algunas todavía se están dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero la población total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de los nutrientes, el número de células que mueren sobrepasa al número de células que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte. Realización (Fig. 1) (Todas las maniobras que se describen a continuación se deben realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del mechero.) 1. Añadir solución salina estéril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. 2. Tomar 0.5 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 50 ml de Caldo nutritivo prparado por componentes, estéril. 3. Incubar el matraz en un baño termostatado a 37 ºC, con agitación (200 rpm). 4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotómetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo Caldo Nutritivo estéril antes de cada medida. 5. Recoger alícuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubación y colocadas en refrigeración hasta su lectura 6. Dibujar una curva de multiplicación con los datos obtenidos, colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.

64

VII. CUESTIONARIO: 1. ¿Por qué se calibra el espectrofotómetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estéril? 2. ¿Por qué motivo puede ser de alguna forma útil conocer la curva de multiplicación de una bacteria? 3. Identificar en la gráfica las fases del desarrollo microbiano. 4. Proponer otra técnica experimental de evaluación del crecimiento microbiano.

65

VIII. OBSERVACIONES

IX. CONCLUSIONES

66

PRÁCTICA CONTEO DE CÉLULAS MICROBIANAS I.

OBJETIVO Determinar el recuento directo de células microbianas con la cámara de contaje celular.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “Cell Coulter”. Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular, por ej. La cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presente unas señales que determina un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se pueden determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen. La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: 67

Concentración en la suspensión (células / mL) == 10000 (x/4) En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.

Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes observar una cámara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas.

El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rápida de estimar la cantidad de células microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones: 1) No se distinguen las células muertas de las células vivas. 2) Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas células. 3) La precisión es difícil de lograr 4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teñido la muestra. 5) El método no es adecuado para suspensiones de células de baja densidad. En el asa de bacterias, en una suspensión de células con menos de 106 células por mililitro, se podran ver pocas o ninguna bacteria.

III. MATERIALES Y REACTIVOS - Cultivo de E. coli - Matraz - Cámara del Neubauer - Estufa

- Cultivo de levadura - Pipetas -Pipeta Pasteur - Microscopio

IV. METODOLOGÍA CARGANDO LA CÁMARA Agita la suspensión celular con el vórtex. Aspira una pequeña cantidad de suspensión con una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequeña en la superficie pulida de la cámara de recuento cerca del extremo del cubre. La suspensión entrará en la cámara por capilaridad. Una cámara adecuadamente llenada contiene células solo en el espacio contenido entre el cubre y la cámara de recuento. No debería sobrar fluido que cayera en los surcos.

V.

CUESTIONARIO 68

1.- Investigue las características de: Cámara de cuenta de Petroff – Hausser, equipos automáticos de Contaje celular, Otros métodos de recuento celular 2.- Indique como diferencia las células viables de células totales. 3.- Describa los métodos directos e indirectos de contaje celular.

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

69

PRÁCTICA AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA I.

OBJETIVOS

Aprender la técnica de dilución para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de inóculo.

II. INTRODUCCIÓN Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formación de colonias, la técnica por vaciado en placa es la más utilizada. La muestra en cantidades conocidas se deposita en cajas petri estériles, se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45°C y se mezcla con la muestra. Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el inverso de la dilución que corresponda permite estimar el número de microorganismos viable por gramo o mL de muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoquímicas y tipo de colonias contadas), el recuento obtenido se referirá a determinado grupo de microorganismos. Esta técnica permite la mayoría de las veces cuantificar la contaminación en alimentos, medicamentos. SIEMBRA POR DISEMINACIÓN (CON ASA DE DIGRASKY). Consiste en adicionar el medio sólido, un inóculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml según los casos con una pipeta graduada estéril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se puede utilizar para el recuento de células viables, antibíogramas, etc.

TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION Se dispondrá de un batería de tubos con medio de cultivo específico o agua estéril según los casos. Se adicionará una cantidad de muestra liquida o sólida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inóculo que se añade en el tubo inicial. Se agitará hasta homogenizar. Con la pipeta estéril se tomará una cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada. Con la dilución obtenida por ej. l0 -4 y 10-5 inocular en placas de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky previamente estéril. Incubar a temperatura óptima de 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluye hasta obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placas y se le deja solidificar.

III. MATERIAL REACTIVOS 70

Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tinción de Gram, Cajas Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml, Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodón, gasa, alcohol.

IV. METODOLOGÍA SIEMBRA POR DILUCION Preparación de reactivos y medio de cultivo: Solución isotónica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua destilada Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del reactivo. Envolver cajas de Petri y pipetas.. Bajo condiciones estériles hacer las diluciones en la solución isotónica estéril, de acuerdo a la figura 1. Tomar 0.1 ml de la dilución 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y colocar en cajas de petri bajo condiciones estériles. Inocular de la misma manera con las diluciones siguientes Se realizará el conteo en placa por superficie. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C, de 24 a 48 horas. Considerar las siguientes reglas para la realización del reporte de la práctica: Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo. Contar todas las colonias de la placa. Si el número se estima mayor de 300 y no hay diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el número de colonias contadas se multiplica por 2. 501-800 colonias se divide en cuatro partes y el número de colonias contadas se multiplica por 4. >800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el número de cuadros que ocupa la caja. El número de colonias contadas deberá ser multiplicado por el inverso de la dilución y considerar si la técnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra). Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dígitos al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49 se reporta 49 Fig. 1

SIEMBRA EN PROFUNDIDAD 71

Preparar las muestras según procedimientos recomendados para la preparación y dilución de muestras. Pipetear a placas Petri estériles, alícuotas de 1 ml. A partir de las diluciones, dilución 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y temperado a 45°C, mezclar rápidamente con movimientos vaivén y rotación de la placa; dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a 37 °C por 48 horas. Efectuar el recuento de microorganismos según: a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias. b) Tomar la media aritmética de dos recuentos y multiplicar por el factor de dilución utilizada. Reportar el resultado como numero de m.o. aerobios mesofilos viables por gramo o mililitro, según el caso c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores que 300, tomar el promedio de los dos recuentos y computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la relación de los dos recuentos

V.  

RESULTADOS Reportar el número de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de TODOS LOS EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos y discutir. Presentar descripción de morfología de colonias y microscópica.

VI. CUESTIONARIO 1. Indique la importancia de utilizar el método de dilución para el aislamiento de microorganismos. 2. Comparar el método de dilución con el de estría para el aislamiento de microorganismos. 3. ¿Por qué el número de microorganismos es el resultado de multiplicar el número de colonias por el inverso de la dilución? 4. ¿De los datos obtenidos en la práctica cuáles cree que sean congruentes y cuáles no y porque? 5. ¿Por qué la incubación se realiza con las placas en posición invertida? 6. ¿Qué finalidad tienen las diluciones y donde se requerirán más diluciones, en muestra fresca o procesada, por qué?

VII. OBSERVACIONES

VIII. CONCLUSIONES

72

PRÁCTICA OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia trabeculata I.

OBJETIVO  

II.

Aplicar técnicas de extracción de ácido alguinio a partir de algas. Aplicar técnicas de purificación de ácido alguinio a partir de algas.

INTRODUCCIÓN.

Existen variedades de algas pardas que producen ácido algínico, que es la base para producir alginato de Sodio, Potasio, Calcio, etc. El alga Lessonia trabeculata, crece en grandes cantidades en las costas de Arequipa.

En el litoral sur peruano se encuentran tres especies de algas pardas, tales como: Macrocystis pyrifera, “sargazos” Lessonia trabeculata (“aracanto”, “palo”) y Lessonia nigrescens (“aracanto negra”), en ambientes inter y submareales. Existen dos modos de su aprovechamiento: a) por medio de la extracción, y b) mediante el recojo, colecta y acopio, por lo cual existen disposiciones normativas, que en resumen, en la actualidad, prohíben la actividad extractiva a nivel de todo el litoral peruano (RM N° 839- 2008PRODUCE), y de otro lado, autorizan el recojo, colecta y acopio de algas varadas (RM N° 264-2009PRODUCE).

III.

MARCO TEÓRICO

En las algas pardas, el ácido algínico es uno de los principales constituyentes de las paredes celulares, casi siempre se encuentra con otros polisacáridos, como laminarina (5-30%), fucoidina (2-12%), diferenciándose de estas dos últimas por la propiedad de insolubilidad en el agua y por encontrarse asociado con varios cationes: calcio, magnesio y sodio. El ácido algínico es un polisacárido, de fórmula general: (C6H8O6)n, donde «n» se repite de 80 a 83 veces., y compuesto de ácido manurónico y ácido gulurónico unidos con enlaces -1,4, en su estado natural se encuentran formando geles con iones Ca+2, Na+, Mg+2, Sr+2 y Ba+

73

Fig… Moléculas constitutivas del ácido algínico.

El ácido algínico se solubiliza en medio alcalino (Na2CO3, NaOH) por intercambio iónico, formándose alginato de sodio, que es soluble y de fácil extracción. Al ácido algínico y los alginatos son bastante higroscópicos y un secado completo es muy lento, presentando una humedad de un 15-25%. La viscosidad de una solución de alginato es una propiedad que depende o deriva de su peso molecular del polisacárido, y de la relación de ácido manurónico a ácido gulurónico (M/G). Material de Laboratorio: Termómetro, vasos de precipitación, probetas, telas de tocuyo, erlenmyers, fiolas, pH-metro, papeles filtrantes, pipetas, embudos, etc. Reactivos: Ácido clorhídrico, carbonato de sodio anhidro, nitrato de plata, hipoclorito de sodio, etanol, etc. Equipos: Potenciómetro, balanza analítica, estufa graduada para baja temperatura.

IV.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1.- Pesar 20 gr de alga seca (tallos y hojas) y colocarla en un balón de vidrio de 2 litros, con suficiente cantidad de agua destilada que cubra las algas. Se produce un hinchamiento de las hojas y ablandamiento de los tallos, el lavado se repite varias veces para eliminar las sales solubles hasta que los líquidos no den precipitado con solución diluida de nitrato de plata. 2.- Para eliminar las impurezas, se hacen varios lavados con solución 0,2 N de HCl, los cuales terminan cuando el líquido del lavado no da turbidez con etanol. Así se transforman los alginatos en ácido algínico (insoluble). MCl HAlg HCl MAlg. 3.- Luego se corta la muestra en pequeños trozos, se agrega agua y se calienta hasta 45 C por unos 10 minutos. 5.- Las muestras lavadas se tratan con una solución de Na2CO3 al 10% en peso (ajustando el pH a 9-10), se calienta hasta 70 °C agitando continuamente, luego dejar en reposo por varias horas, conviene dejarlo hasta el día siguiente, de tal modo que se macere. Durante la maceración, el ácido algínico se somete a un tratamiento alcalino para solubilizar el extracto como alginato de sodio, como resultado, la solución presentará un aspecto lechoso parduzco y viscoso. 6.- Se filtra y el residuo se vuelve a tratar con Na2CO3 al 2% a 70 ºC por 10 minutos, se filtra y el filtrado se agrega a la solución anterior y, si es necesario, se vuelve a filtrar. 7.- Los filtrados anteriores tienen un aspecto coloidal y de color pardo oscuro. Para blanquearlo o decolorarlo se agrega una solución de hipoclorito de sodio al 5.25% en la proporción de 1/10 del volumen de los filtrados resultantes que contiene el vaso de precipitado y se deja actuar por unos 10 minutos. 8.- Al filtrado total contenido en el vaso de precipitados se determina el pH inicial, luego se acidifica con HCl concentrado, agregando de 10 en 10 ml , midiendo su pH hasta llegar a pH=2: 74

Se observa la formación de una gran masa de precipitación blanquecina, que se deposita en el fondo del recipiente. Se hace el filtrado empleando tela de tocuyo blanco, lavando el filtrado con ácido clorhídrico diluido. 9.- La purificación consiste en cambiar de fase el compuesto de interés para eliminar con la otra fase los contaminantes, en este caso se precipitará con cloruro de calcio el alginato quedando los contaminantes, en su gran mayoría, en las aguas sobrenadantes. 2NaAlg + CaCl ----- CaAlg + 2NaCl 10.- El precipitado obtenido, Alginato de calcio, se blanquea y desodoriza mediante un lavado con NaClO. El alginato de calcio es de interés comercial obtenido en forma purificada, a partir de él pueden obtenerse los restantes. A continuación el alginato de Calcio se acidifica con ácido clorhídrico al 5%, 11.- para transformarse en ácido algínico, como se muestra en la siguiente reacción: CaAlg + 2HCl---- HAlg + CaCl 12.- El ácido algínico se escurre y se seca en estufa de vacío a 50°C hasta peso constante, por unas 5 horas, se enfría y se pesa. El último producto buscado es el alginato de sodio el que se consigue desde la solución ácida de ácido algínico por alcalinización con NaOH 5 N, como este alginato es soluble en agua se seca en estufa de vacío a 50°C hasta peso constante. HAlg + NaOH ---- NaAlg + H2O Aplicaciones del alginato: • Alimenticias: Espesante, estabilizante o propiedades de suspensión en jugos de fruta, salsa de ensaladas, milk shakes, salsas, cremas, cerveza, adornos para postres. Propiedades gelificantes en alimentos para animales, relleno de aceitunas, gelatinas. Control en fabricación de quesos, fabricación de helado, cubiertas de frutas en postres. • Farmacéuticas: Propiedades espesantes en jarabes, emulsiones, lociones, cremas. Características de rápida hidratación en desintegración de tabletas, controlador de irrigación de droga. Propiedades gelificantes en polvos de impresión dental. • Textiles: Propiedades gelificantes en gomas para impresión, propiedades de limpieza, sistemas reactivos de tinta, sistemas de dispersión de tinta, inhibidor de transporte fluido, baños de tinta. • Otras: Propiedades de formación de película, interacción con silicatos, electrodos de soldadura, sellado de conservas, barnices, cerámicas, pinturas cremosas.

V.

CUESTIONARIO

1. Explique la estructura química del alginato 2. Proponga métodos alternativos de purificación de alginato 3. Proponga un análisis químico del producto final para determinar la composición y estructura del alginato 4. En cuanto a la capacidad gelificante de los alginatos, explique los mecanismos de gelificacion interna y externa y su diferencia entre ellos.

VI.

RESULTADOS

75

VII. OBSERVACIONES

VIII. CONCLUSIONES

76

PRÁCTICA AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL I.

OBJETIVOS

• Seleccionar microorganismos de diferentes fuentes, que puedan servir para la obtención de metabolitos de interés industrial. • Aplicar técnicas de purificación de microorganismos aprendidas previamente en microbiología general.

II.

MARCO TEORICO

Las áreas de aplicación de la microbiología industrial son muy variadas, y de ellas surge la importancia y el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad. En primer lugar, se debe destacar la importancia de la microbiología industrial en el mantenimiento de la salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su aplicación en la producción de compuestos de actividad farmacológica y de vacunas. En la industria de alimentos es también significativa la aplicación de la microbiología industrial, en la producción de bebidas, enzimas, saborizantes, productos lácteos y muchas otras aplicaciones. La producción agropecuaria se ve también favorecida en sus aspectos de producción vegetal y animal, por un conjunto variado de procesos microbiológicos. El área de aplicación en minería está relacionada con la biolixiviación, o sea, con la aplicación de microorganismos en la extracción de metales de minerales de baja ley. Finalmente, el área de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicación de microorganismos en la purificación de efluentes, aspecto fundamental para el mantenimiento de la calidad de vida. Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado, para la elección del mismo se deben tener en cuenta los criterios generales que se indican a continuación: 1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable. 2. Su velocidad de crecimiento debería ser alta. 3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos. 4. Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo reducido. 5. Debe ser de fácil conservación por largos periodos de tiempo, sin pérdida de sus características particulares. 6. Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto. 7. Si el objetivo del proceso es un producto, éste debería ser de alto rendimiento y de fácil extracción del medio de cultivo. 77

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos. En el ámbito industrial, en general, cada firma posee su propia colección de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados por medio de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería genética. Sin embargo, estas cepas sólo son empleadas por la industria que las posee, debido al gran valor comercial que representan. En algunos casos se dispone de organismos modificados genéticamente para llevar a cabo reacciones específicas de biosíntesis, degradación o biocatálisis, los cuales están protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos aislados o modificados no está disponible para uso general en laboratorios. Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales, como agua, suelo, plantas y desechos, la elección del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son de interés. Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas, se podrían encontrar organismos adaptados a la degradación de estos productos químicos; o en larvas de insectos muertos, agentes causales de la muerte. Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica elegida para el mismo; en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, b) enriquecimiento del cultivo con o sin pre tratamiento de la muestra.

III.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Materiales y Reactivos           

Asa. Hisopos estériles. Bolsas plásticas 1 l. Cuchillo. Caja Petri con agar nutritivo. Caja Petri con agar papa dextrosa. Caja Petri con agar YPD con 10 % de Aceite de oliva. Incubadora. Mechero. Balanza.

Las muestras que se analizarán son tierra, queso y piña. Procedimiento para tierra 1. Pesar 10 g de tierra y mezclar con 90 ml de solución salina estéril dentro de una bolsa de plástico; homogeneizar durante 1 minuto. 2. Inocular con el asa calibrada cada una de las cajas de cultivo, por la técnica de estrías, para tener colonias aisladas. 3. Incubar las cajas de APD a 30 °C y de AN a 37 °C. Procedimiento para queso 1. Pesar 10 g de queso y mezclar con 90 ml de solución salina estéril dentro de una bolsa de plástico; homogeneizar durante 1 minuto. 2. Inocular con el asa calibrada cada una de las cajas de cultivo, por la técnica de estrías, para tener colonias aisladas. 3. Incubar las cajas de APD a 30 °C y de AN a 37 °C. Procedimiento para la piña 1. Mojar un hisopo con solución salina estéril y frotar la superficie de la piña con él. 2. Descargar el hisopo sobre un tercio de la superficie de la caja de cultivo y estriar la descarga con un asa calibrada para tener colonias aisladas. 78

3. Incubar las cajas de APD a 30 °C y de AN a 37 °C. Procedimiento para identificar los microorganismos de interés industrial Dependiendo del uso que se esté buscando para los microorganismos y la industria donde se emplearán, será el procedimiento a seguir. 1. En el queso se buscarán levaduras con actividad lipasa o esterasa, para eso se inocularán diferentes colonias por picadura en la superficie de una caja de agar YPD Con 10 % de aceite de oliva. De ser positivo, se observará un halo transparente, resultado de la actividad lipasa positiva. 2. También en el queso se buscarán bacterias del genero Lactobacillus ácido-lácticas, con potencial para ser utilizadas para la preparación de yogur. Se efectuarán las pruebas bioquímicas pertinentes para su identificación. 3. En la piña se buscarán hongos del género Aspergillus, productoras de ácido acético, así como bacterias ácido-acéticas para la producción de vinagre. La identificación del hongo se hará con base en sus características macroscópicas y microscópicas, y para las bacterias se harán pruebas bioquímicas. 4. Con la tierra se seguirá el procedimiento dependiendo lo que crezca en la caja de cultivo, ya sea hongos, levaduras o bacterias. Para el caso de los hongos, se identificarán con base en sus características macroscópicas y microscópicas; para las bacterias, se harán pruebas bioquímicas. En el caso de las levaduras, se observarán las características morfológicas de las colonias y un frotis en fresco al microscopio.

IV.

CUESTIONARIO

1. Mencione cinco industrias en donde se utilizan microorganismos durante los procesos de fabricación. 2. Mencione cinco bacterias que son utilizadas en la industria alimentaria, así como el producto o proceso en el que participan. 3. Mencione cinco levaduras que son utilizadas en escala industrial, así como el producto o proceso en el que participan. 4. Mencione los lugares donde se pueden encontrar las bacterias del género Lactobacillus. 5. Mencione los lugares donde se pueden encontrar hongos del genero Aspergillus.

79

V.

RESULTADOS Resultados de las pruebas que se efectuaron a cada una de las colonias. Bacterias

Levaduras

Tierra Queso Piña

VI.

OBSERVACIONES Fotografías de las cajas de cultivo

VII.

CONCLUSIONES

80

Hongos

PRÁCTICA AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM I.

OBJETIVO -

II.

Obtener nódulos de Rhizobium de raíces de alfalfa. Observación microscópica de bacterias de Rhizobium

FUNDAMENTO TEÓRICO La producción agrícola basada en leguminosas es fundamental para la alimentación humana, especialmente si es en equilibrio con el ambiente. Por ello la interacción natural de estas plantas con una bacteria del suelo a nivel de la raíz, es ecológicamente importante, como medida para evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que deterioran el suelo y contaminan el ambiente. La fijación biológica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su hospedero, lo infecta a través de los pelos radicales para que en la matriz de las células corticales induzca una meiosis y mitosis acelerada que da lugar a un tejido hipetrofiado: El nódulo en el sistema radical de la leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en un bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio, que luego transfiere al ribosoma vegetal para la síntesis de proteínas vegetales; simultáneamente por la fotosíntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirán como fuente de carbono y energía para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo activo en el nódulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta. Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicación de fertilizantes químicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de producción y la contaminación de mantos acuíferos y suelos, es vital para una agricultura sustentable. GRUPOS DE INOCULACIÓN CRUZADA Y ASOCIACIONES DE Rhizobium – LEGUMINOSA Grupo de Especies de Género Leguminosa Inoculación cruzada Rhizobium hospedero incluida Grupo de alfalfa R. meliloti Medicago Alfalfa Melilotus Trebol dulce Trigonella Alholva Grupo del trébol R. leguminosarum Trifolium Trébol biovar trifolii

81

III. MATERIALES Y REACTIVOS Material Biológico - Raíces de alfalfa con nódulos Matraces - Placa Petri - Pinzas bisturí - Mecheros - Vasos PP 100 ml Reactivos - Agua destilada estéril - Hipoclorito de sodio 2.5% - Bicloruro de Mercurio 0.2% - Medio PSA (papa sacarsa agar)

IV. METODOLOGÍA 1. Preparación del Medio PSA Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta que las papas estén cocidas. Filtrar la solución de cocción y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de sacarosa y 1.2 g agar – agar autoclave 120ºC 15? Y proceder a plaquear 2. Observación Microscopia de Bacterias de Rhizobium -

Obtener los nódulos de Rhizobium de las raíces de alfalfa.

-

Caracterizar los nódulos según posición en las raíces, color, forma, tamaño.

-

Lavar con agua destilada los nódulos y realizar disección del nódulo sobre un porta objeto y dejar caer el líquido interno para realizar un frotis.

-

Fijar el frotis de Rhizobium.

-

Realizar coloración Gram

-

Observación en el microscopio a 100X

3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA Esterilización de nódulos -

Disponer los nódulos en un matraz de 100 ml

-

Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar.

-

Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 – 8 minutos, decantar

-

Lavar con agua destilada estéril 3 veces

-

Realizar la disección del nódulo con la ayuda de pinzas y bisturí sobre papel estéril.

-

Dejar caer el líquido interno del nódulo seccionado apretando con la pinza o pasar sobre la superficie del medio.

-

Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 – 27ºC en estufa, 5 días.

82

V. CUESTIONARIO -

Qué otros medios se utilizarían para el cultivo de Rhizobium.

-

Cuál es la ruta metabólica que utiliza el Rhizobium.

-

Cuál sería la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

83

PRÁCTICA ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS I.

FUNDAMENTO TEORICO

La detección y cuantificación de todos los microorganismos patogénicos potencialmente presentes en el agua demanda tiempo, los costos son elevados y no siempre se obtienen resultados positivos o que confirmen la presencia de los microorganismos. El objetivo de la prueba microbiológica del agua es proveer subsidio acerca de su potabilidad, es decir, ausencia de riesgo de ingestión de microorganismos causadores de enfermedades, mayormente provenientes de la contaminación por excrementos humanos y de otros animales de sangre caliente. Vale resaltar que los microorganismos presentes en aguas naturales son, en su mayoría, inofensivos a la salud humana. Pero en la contaminación por desecho sanitario están presentes microorganismos que podrán perjudicar la salud humana. Los microorganismos patogénicos incluyen virus, bacterias, protozoarios y

helmintos.

El agua potable no debe contener microorganismos patogénicos y debe estar libre de bacterias indicadoras de contaminación fecal. Como indicadores de contaminación fecal, las bacterias de referencia elegidas son las del grupo coliforme. El principal representante de ese grupo de bacterias es llamado Escherichia coli. Ese grupo de bacterias ha sido elegido como indicador de contaminación del agua debido a los siguientes factores: a. Están presentes en el excremento de animales de sangre caliente, incluso de los seres humanos; b. Son de fácil detección y cuantificación por medio de técnicas sencillas y económicamente viables, en cualquier tipo de agua; c. Su concentración en el agua contaminada está directamente relacionada al gradiente de contaminación fecal; d. El tiempo de sobrevivencia en el agua es mayor que las bacterias patogénicas intestinales, por ser menos exigentes en términos nutricionales, además de ser incapaces de multiplicarse en ambiente acuático o multiplicarse menos que las bacterias entéricas; y. Son más resistentes a los agentes tensoactivos y agentes desinfectantes que a las bacterias patogénicas. BACTERIAS DEL GRUPO COLIFORME Conceptos: Coliformes Los coliformes son bacilos gram negativos, no esporógenos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa en 48 horas (son las enterobacterias fermentadoras de la lactosa) con producción de ácido y gas en presencia de sales biliares. En este grupo se incluyen cuatro géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella, además de algunas cepas de Serratia (ver Tabla ). 84

Tabla . Características del grupo coliforme Prueba

Escherichia

Klebsiella

Enterobacter

Citrobacter

Glucosa

+

+

+

+

Gas glucosa

+

+

+

+

Lactosa

+

+

+

d

Indol

+

d

-

-

Rojo metilo

+

-

-

+

Voges-Proskauer

-

+

+

-

Citrato

-

+

+

+

Urea

-

+

+/-

d

Movilidad

+/-

-

+

+

d= dudoso

El hábitat natural de los coliformes es el tracto intestinal humano y animal, aunque también se pueden aislar de muestras medioambientales (tierra, polvo, aguas superficiales y vegetales). Así, su procedencia puede ser tanto fecal como no fecal. Los coliformes son resistentes a condiciones medioambientales adversas, soportan la desecación, pero no condiciones de congelación o refrigeración. Esta última característica hace que su investigación en alimentos congelados no tenga ninguna relevancia. Solamente son útiles como indicadores de la calidad en ciertos tipos de productos terminados o indicativos de la fase de conservación y almacenamiento. En el grupo coliforme destacan por su mayor significación sanitaria los coliformes fecales, entendiendo como tales aquellos capaces de desarrollarse entre 44 y 46ºC (habitualmente 44,5º o 45,5ºC) con producción de ácido y gas a partir de lactosa. • Coliformes totales (bacterias del grupo coliforme) – bacilosgram-negativos, aerobios o anaerobios facultativos, no formadores de esporos, oxidase-negativos, capaces de desarrollarse en presencia de sales biliares o agentes pensativos que fermentan la lactosa con producción de ácido, gas y aldehído a 35,0 ± 0,5oC en 24-48 horas, e que pueden presentar actividad de la enzima ß – galactosa. La mayoría de las bacterias del grupo coliforme pertenece a los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter, aunque varios otros géneros y especies pertenezcan al grupo; Coliformes termotolerantes – subgrupo de las bacterias del grupo coliforme que fermentan la lactosa a 44,5 ± 0,2oC en 24 horas; teniendo por principal representante la Escherichia coli, de origen exclusivamente fecal. • Escherichia coli – bacteria del grupo coliforme que fermenta la lactosa y manitol, con producción de ácido y gas a 44,5 ± 0,2oC en 24 horas, produce indo a partir del triptófano, oxidase negativa, no hidroliza 85

la urea y presenta actividad de las enzimas ß galactosa y ß glucuronidase, que es considerado el más específico indicador de contaminación fecal reciente y de eventual presencia de organismos patogénicos. El origen fecal de la E. coli es incuestionable y su naturaleza ubicua poco probable, lo que valida su papel más específico de organismo indicador de contaminación, tanto en aguas naturales como tratadas. El Recuento Estándar de Bacterias es muy importante durante el proceso de tratamiento del agua, ya que permite evaluar la eficiencia de varias etapas del tratamiento. Es importante también conocer la densidad de bacterias, haya visto que un aumento considerable de la población bacteriana puede comprometer la detección de organismos coliformes. Aunque la mayoría de esas bacterias no sea patogénica, puede representar riscos a la salud, como también, deteriorar la calidad del agua, provocando olores y sabores desagradables.

II. PROCEDIMIENTO Por razones prácticas, en este experimento sólo vamos a tratar de distinguir la presencia y cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes: Escherichia coli Samonella typhimurium Proteus morganii Enterobacter aerogenes. El método a seguir consistirá en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada en solución fisiológica, siguiendo el esquema que se representa a continuación:

0.1 ml

0.1 ml

0.1 ml

0.1 ml

0.1 ml 0.9 ml ClNa 0.9%

MUESTRA

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios: 1) Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 10-5, 10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar común, e incubarlas a 37ºC durante la noche en posición invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el número de colonias y se multiplica por los factores de dilución correspondientes. 2) Determinación de bacterias coliformes. Se extiende 0.1 ml de las diluciones -5 10 y 10-4 sobre dos placas de agar MacConkey, incubándolas de la forma descrita. Una vez crecidas, se cuentan las colonias rojas y las rosáceas y se multiplican ambos números por los factores de dilución. Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y se extiende un inóculo denso sobre la superficie de una placa de agar EMB, incubando a continuación a 37ºC durante toda la noche. En este medio, confirmativo para E. coli, esta especie debe dar lugar a colonias negras con reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da colonias más rosáceas y nunca reflejos. Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli, sobre el total de coliformes. 86

3) Determinación de Salmonella y Proteus. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 105 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37ºC durante 24-48 horas. Sobre este medio Salmonella y Proteus generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las colonias se vuelvan rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el amarillo (una buena forma de detectar coliformes). Con estos datos, hay que deducir el número de bacterias (por ml) de agua contaminada que dan colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o Proteus, hay que reinocularlas en caldo de urea y en TSI. Sobre caldo de urea la estirpe de Proteus debe generar color azul. Salmonella da negativo para ambas actividades. En TSI únicamente la estirpe de Salmonella debe aparecer con precipitados negros (por producción de SH2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto de los caracteres siguientes: Fondo* Pendiente S. typhimurium A+G Alcalino P. morganii A+G Alcalino (*) A indica producción de ácido y G de gas.

III.

RESULTADOS

IV.

OBSERVACIONES

V.

CONCLUSIONES

87

Ennegrecimiento Sí No

PRÁCTICA MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y ESCHERICHIA COLI POR LA TÉCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MÚLTIPLE (NÚMERO MÁS PROBABLE O NMP)

I.

OBJETIVO

Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.  Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.  Organizar e interpretar los resultados.

II.

GENERALIDADES

Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias. Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra. El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram- negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 88

44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia

Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.

Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del

viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países subdesarrollados y afecta principalmente a los niños. Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos. La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja. Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células mucosas. La infección Por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque ocasiones puede ser crónica. Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por plásmido, ambas proteínas permite su unión a los enterocitos y la destrucción las microvellosidades intestinales. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar). Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal. A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas características importantes de este 89

microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogenicos. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG. La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas de Escherichia coli antes descritas. Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli patógenas

III.

FUNDAMENTO

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C 1 C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. 90

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1 C por un periodo de 24 a 48 h. La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.

IV.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1. Para análisis de agua Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1.     

  

5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado concentración doble o triple con campana de Durhama. 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb. 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC MUG con campana de Durham b. 2 cajas Petri con agar para métodos estándar d 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons (opcional)

2. Para análisis de alimentos 1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatosa 2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatosa  15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentración sencilla o caldo lactosado concentración sencilla con campana de Durhama  15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb.  15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb.  cajas Petri con agar para métodos estándard 2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc  6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe  3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe  3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere 91

V.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES    

VI.

Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2e COLORANTES PARA TINCIÓN DE GRAMd

MATERIAL Y EQUIPO  Mechero, a,b,c,d,e. Propipetaa. 

   

 

Gradillaa,b,c,e. Balanza granatariaa. Stomachera Bolsas para stomacher . Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c Lentes de seguridadc Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna. Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna. Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d Asa bacteriológicab,c,d,e Portaobjetosd Microscopio ópticod Termómetro calibradob Baño de agua a 44.5°± 0,1°C.b Incubadora a 35° ± 2,0ºCa. Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca Autoclavea

NOTAS

 

Material necesario al inicio de la práctica. Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica. Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica. Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica

92

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

93

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SÓLIDAS O ALIMENTOS

94

VII.

PROCEDIMIENTO

1. Agua y hielo 1.1 Prueba presuntiva Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. tubos para homogeneizar la muestra. CUADRO 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio



Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa producción de gas, incubar 24 h. más.

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales     

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneización. Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h.. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.. Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes totales/100 mL.

1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.   

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneización. Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h. 95

 

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h. Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes fecales/ 100 mL.

Control de calidad  1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras. 1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas. Incubar las placas a 35°C por 18-24 h. Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos. 1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). a. Producción de indol (I)   

Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h. Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs. La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera prueba positiva.

b. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM)   

Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h. Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.

c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)   

Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h. Adicionar 0.6 mL de solución VP1 y 0.2 mL de solución VP2 y agitar. Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilización del citrato (C) Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inóculo ligero para evitar turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons) Incubar a 35°C por 96 h. El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una prueba positiva. NOTAS 96

Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogíca de forma recta. Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo. Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono, también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva 1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metilumbeliferil- -D-glucuronido) FUNDAMENTO Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4-metilumbeliferil-beta-Dglucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli. a. Prueba confirmativa    

A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formación de gas , tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación EC-MUG. Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más. Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura. Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.

Control de calidad Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae como control negativo. 2. Alimentos 2.1 Preparación de la muestra.   

Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estériles y mezclar. Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3 minutos. Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2°y 5 °C.

2.1.1 Prueba presuntiva.    

Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio. Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo lauril sulfato de sodio. Incubar a 35-37°C durante 24-48 h. Los tubos después de la incubación, se registrarán como positivos si presentan crecimiento y producción de gas. 97

2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales     

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a otro tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneización. Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas, después de un período de incubación de 24 a 48 h. Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el número más probable de organismos coliformes totales por mL.

2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.     

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneización. Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h. Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el número más probable de organismos coliformes fecales por mL.

Control de calidad 

Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de

Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.

2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli.    

Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h., observar las colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares. Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las bacterias. Seleccionar 1 o más colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.

Todos los cultivos que:  Fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h. a 35°C.  Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no esporulados  Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (-+--) son consideradas como Escherichia coli.  Calcular el NMP de E. coli basándose en la proporción de los tubos positivos de caldo EC.

98

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al procedimiento señalado en la tabla 1, (que se muestra a continuación y es utilizado para el análisis de agua), para estimar la población de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con las diluciones empleadas. Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar volúmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar las siguientes tablas: TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.

TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.

99

FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES PRÁCTICAS 1.- SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA AL 10% PREPARACIÓN Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua destilada

2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5% PREPARACIÓN Azul de metileno Agua destilada

5.0 gr 100 ml

3.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE GRAM A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA FÓRMULA: Cristal violeta 2.0 gr Etanol al 95% 20 ml Oxalato de amonio 0.8 gr Agua destilada 80 ml PREPARACIÓN: 1.- Disolver el cristal violeta en el etanol 2.- Disolver el oxalato en el agua 3.- Mezclar las dos soluciones B) SOLUCION DE LUGOL FORMULA Yoduro de potasio 10.0 gr Agua destilada 20.0 ml Yodo metálico 5.0 gr Etanol, aforar a 100.0ml PREPARACIÓN: 1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua 2.- Agregar el yodo metálico y disolver 3. Aforar a 100 ml con etanol C) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ACETONA FORMULA Acetona 1 volumen Etanol al 95% 2 volúmenes D) COLORANTE SAFRANINA FORMULA Safranina 0.5 gr Agua destilada 100.0 ml PREPARACIÓN Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, después aforara a 100 ml con más agua.

4.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE ZIEHL- NEELSEN A) COLORANTE FUCSINA FENICADA 100

FORMULA: Fucsina básica 5.0 gr Fenol 25.0 grs Etanol al 95% 50 ml Agua destilada aforar a 500 ml PREPARACIÓN 1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en baño a ebullición 2.- Añadir la fucsina básica y disolver 3.- Añadir el etanol y mezclar 4.- Aforar la solución a 500 ml con agua destilada B) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ÁCIDO FORMULA Ácido clorhídrico 3.0 ml Etanol al 95 100.0 ml PREPARACIÓN Adicionar el ácido clorhídrico al etanol, lentamente y agitando C) COLORANTE AZUL DE METILENO FORMULA Azul de metileno 5.0 gr Agua destilada 100.0 ml

5.- MEZCLA CRÓMICA Dicromatode potasio Ácido sulfúrico concentrado Aguadestilada

20.0 gr 20.0 ml. 250.0 ml.

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BIBLIOGRAFÍA BARRETO, Miriam. 1994. Manual Práctico de Microbiología General. Canoabo CARPENTER, Philip. 1969. Microbiología. 2da Edición. Editorial Interamericana, S.H. México. PELCZAR. 1990. Microbiología. 2da Edición. Editorial. Mc Graw-Hill. México. WALTER, W.G. 1980. Introducción a la Microbiología. Editorial Continental. México. GRASSINI, Luis. 1967. Microbiología Agraria. UCV-Facultad de Agronomía. Caracas-Venezuela. BLAIR, J. 1970. Manual Clínico de Microbiología. Bethesda. AMERAtlas, Ronald M. “Ecología Microbiana y Microbiología ambiental”. Pearson, España, 2006. FARRAS, Ramón Parés J. “Bioquímica de los Microorganismos”. Ed. Reverté, S.A., España, 1997. INGRAHAM, John L. “Introducción a la Microbiología”. Ed. Reverté, S.A., España, 2000. JAY, James M. “Microbiología Moderna de los Alimentos”, Ed. Acribia, S.A. España, 1992. LEVEAU, J.Y. “Microbiología Industrial: Los microorganismos de interés industrial”. Ed. Acribia, S.A. España, 2000. OKAFOR, Nduka. “Modern Industrial Microbiology and Biotechnology” Science Publishers, United States of America, 2007. PRESCOTT, Lansing M. “Microbiología”. McGraw – Hill. Interamericana, España 1999. TORTORA Gerard J. “Introducción a la Microbiología”. Ed. Acribia, S.A. España, 2002. WAITES, Michael J. “Industrial Microbiology: An Introduction”, Blackwell Science Ltd, Oxford, 2001. WARD, Owen P. “Biotecnología de la Fermentación”, Ed. Acribia, S.A. España, 1991. CAMACHO, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos cárnicos troceados y curados. Productos cárnicos curados y madurados. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Apéndice normativo B. De la estimación de la densidad microbiana por la técnica de número más probable. CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número mas probable, detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli por el número mas probable” Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. ed. Arlington, VA: AOAC. Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed. 2006, pp 935-936

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