Practicas Microbiologia de Alimentos Sep2015
August 18, 2022 | Author: Anonymous | Category: N/A
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COMISIÓN ACADÉMICA NACIONAL AREA AGRO-INDUSTRIAL ALIMENTARIA
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS MANUAL DE ASIGNATURA
NOVIEMBRE DE 2010
PROLOGO
Dado la globalización de la economía y los tratados que nuestro país tiene con diferentes homólogos del mundo, es necesario poner más énfasis en la calidad de los productos que se export exp ortan an,, as asíí como los que se co consu nsume men n en el pa país ís.. Y uno de los prod produc ucto toss que que se contemplan más importante son los alimentos. Dentro de ésta rama es importante recalcar que tenemos aances y deficiencias que nos han permitido saber cual es el rumbo que debemos tomar, y en el ámbito educatio, los programas que debemos implementar para estar a la anguardia en cuanto a calidad e inocuidad alimentaría. !os alimentos, como tal, forman parte del ser humano y cada día se diersifican productos que son consumidos por la población y realmente no sabemos cuál es el tratamiento que ha recibido y que garantice que no afecta la salud de las personas que los consumen. "iendo los alimentos el principal medio para transporte de enfermedades es necesario tr trab aba# a#ar ar co con n es esme mero ro pa para ra co con nenc encer er ta tant nto o a lo loss que que lo loss pr prod oduce ucen n co como mo lo loss qu que e los consumen, conocer los procesos por los cuales han pasado los alimentos antes de llegar a sus mesas. !a $nier $niersidad sidad % %ecnológ ecnológica ica de %abasco, a traés de la Diis Diisión ión de tecno tecnología logía de alime alimentos ntos esta traba#ando grandemente por incluir en sus programas de estudio lo más reciente en cuanto a me#oramientos de procesos y calidad, y dentro de este contexto incluir las buenas práct prá ctic icas as de ma manu nufa fact ctura ura,, que que a la pa parr se lllle ea a con lo loss co cont ntrol roles es mi micr crobi obiol ológ ógic icos os en alimentos.
ING. ROGELIO KURI GONZÁLEZ RECTOR
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INDICE
PRESENTACION PROLOGO MANUA ANUAL L N#. N#. 1. CO CONO NOCI CIM MIENT IENTO O DEL DEL M MA ATERI TERIAL AL DEL DEL L LA ABO BORA RAT TORIO RIO MANUAL N#. 2. USO DEL MICROSCOPIO MANUAL N#. %. COLORACIÓN DE GRAM MANUAL N#. $. PREPARACIÓN DEL MA MATERIAL TERIAL P PARA ARA ESTERILIZACIÓN. MANUAL N#. '. R RE ECUENTO DE MO(OS ) LEVADURAS MANUA ANUAL L N# N#.. *. MÉT MÉTODO ODO DE CUE UENT NTA A TOTAL ES EST TÁN ÁNDA DAR R DE MICROORGANISMOS MESÓ+ILOS AEROBIOS EN ALIMENTOS. MANUAL N#. &. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLI+ORMES EN ALIMENTOS,PRUEBA PRESUNTIVA
MANUAL N#. /. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS B ACTERIAS COLI+ORMES EN ALIMENTOS ,PRUEBA CON+IRMATIVA MANUAL N#. . IDENTI+ICACIÓN ) RECUENT RECUENTO O DE S ALMONE ALMONELLA LLA MANUAL N#. 10. IDENTI+ICACIÓ IDENTI+ICACIÓN N ) RECUENTO DE
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STAPHILOCOCCUS
MANUAL N#. 11. IDENTI+ICACIÓN ) RECUENTO DE STREPTOCOCCUS DEL DEL GRUPO LANCE+IELD
MANUAL N#. 12. RECUENTO DE ENTEROBACTER MANUAL N#. 1%. IDENTI+ICACIÓN ) RECUENTO DE BACILLUS CEREUS
RE+ERENCIAS RESPONSABLES
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COMISION ACADEMICA NACIONAL AREA AGRO-INDUSTRIAL ALIMENTARIA MANUAL N#. 1
METODO DE CUENTA TOTAL ESTANDAR DE MICROORGANISMOS MESO+ILOS AEROBIOS EN ALIMENTOS. OBETIVO 3
Desarrollar el método microbiológico para determinar el n&mero de microorganismos mesófilos aerobios en alimentos.
INTRODUCCIÓN 'ada bacteria(al igual que cada leadura o cada moho) tiene una temperatura óptima, que es aquella a la que me#or crece* una temperatura mínima, la más ba#a a la que se desarrolla, y una temperatura máxima, la más alta que permite su crecimiento ."e han encontrado bacterias capaces de crecer a temperaturas de + y +- ' !as bacterias con temperaturas óptimas entre - y / ' se denominan mesófilas.
MARCO TEORICO "on un grupo de bacterias que se multiplican en aerobiosis a temperaturas de - y / grados centígrados, siendo su temperatura optima 01 grados centígrados. 2n este grupo se incluyen bacterias patógenas y no patógenas patóg enas alterantes, saprofitos, etc.. 3os permite conocer la calidad microbiológica del agua. $nas tasas altas de mesófilos indican que el agua no es apropiada para el consumo humano. 2l análisis se puede realizar realizar mediante dos técnicas. 4ara la determinaci determinación ón de este grupo solo será necesario necesario realizar uno de los análisis, en función de los medios con que cuenta el laboratorio.
1.- M#3# 34 5"6 3578#!46 3489"546. a)
5 parti partirr de 1 m! de muest muestra ra proble problema ma de agua agua realiz realizar ar las dilu diluci cion ones es decima decimale less seri seriad adas as que se
b)
consideren conenientes. 5 partir partir de las tres tres <imas <imas diluciones diluciones a6adir a6adir 1 m! de cada dilución dilución a dos dos ca#as de petri petri estériles estériles acías acías para para la siembra de los microorganismos con detalle.
c)
7erter 7erter unos unos - m! m! por placa de de 4'5 fundido fundido y atempera atemperado do a /8 /8 grados grados centígr centígrados. ados.
d)
$na ez que haya solidi solidific ficado ado el agar, agar, incubar incubar las placas placas a 09 grados grados centígr centígrado ados. s. 5nota 5notarr los result resultado adoss obtenidos a las -/ y /: horas de incubación.
e)
;ealiza ;ealizarr el recuen recuento to de las colonia colonias. s. 2l n&mero n&mero de aerobi aerobios os mesó mesófil filos os totales totales presen presentes tes en la muest muestra ra inicial se expresa como $ncubar >ncubar a 09 grados centígrados centígrados durante durante -/8/: -/8/: horas. Durante Durante este este periodo las sustancias sustancias nutriti nutritias as del medio difunden hacia la membrana y permiten que crezcan las bacterias dando lugar al n&mero de $UIPOS. 1 ca#as 4etri
Aedios de cultio=
1 4ipetas graduadas de 1 ml.
5gar 2osina 5zul 5zul de Aetileno
1 4ipetas graduadas de 1 ml.
5gar erde brillante
1 probeta de 1 ml - Aatraz 2rlenmeyer - ml. 1 2spátula, idrio de relo# Buantes de asbesto 1 mecher mechero o bunsen bunsen,, 4iceta 4iceta aguaNa aguaNalco lcohol, hol, asa ba bact cter erio ioló lógi gica ca,, 1 mech mecher ero o UIPOS 1 2spátula, probeta de 1 ml 4robetas de 1 ml. 4ipetas de 1 ml. 1 pipetas de 1 ml con graduación de .1 ml 1 5sa bacteriológica 1 Aechero bunsen - Aatraces 2rlenmeyer de - ml. 1 'a#as de 4etri de idrio de 1 x 1 mm. 1 7asos de precipitados de 1 ml. - 4iceta (agua y alcohol) 1 7idrio de relo# 1 par de guantes de asbesto 1 gradilla
REACTIVOS Aedios de cultio= 5gar de papa y dextrosa dextrosa 'aldo peptonado %raer por equipo 5lgodón, gasa papel, estraza, estraza, masQing tape, cerillo, franela. Auestra de alimento= pan, tortilla, cereal o cacahuates diferente producto por equipo
METODOLOGÍA 4reparación de la muestra. 4esar 1 gr. del alimento en condiciones asépticas, transferir a un frasco de dilución con @ ml, de solución de peptonada y agitar igorosamente para homogeneizar la muestra. (2n su caso licuarla por 1 min.).'on las muestras liquidas tomar 1 ml y realizar la l a misma operación. 2sta primera primera dilución dilución corresponderá corresponderá a 1 1, y a partir de ella se harán tantas diluciones decimales como sea necesario (1 8-, 180, 18/, etc.). De la dilución 181 se toma 1 ml. Y lo paso a un tubo de con tapón de rosca, el cual contiene @ ml. De diluyente, este tubo a ser la dilución 18-* y así sucesiamente hasta llegar a la dilución 18/. "embrar por estría cruzada una placa de 5gar Dextrosa8"abouraud o una de 5gar de 4apa y Dextrosa con .1 ml. de cada dilución preparada e incubar a - 8 0 ' por - + días.
RESULTADOS "acar las ca#as de incubación y contar las colonias características de mohos y leaduras, reportando él n&mero de colonias multiplicado por el factor de dilución, nos dará el recuento de mohos y leaduras por gramo de alimento.
CUESTIONARIO 1.8 Aencione las características generales de los mohos y leaduras. -.8 Fué características tiene el medio de cultio para que se desarrollen los hongos y leaduras. 0.8 C'ómo influyen los hongos y leaduras en alimentosE /.8 Aenciona cinco hongos que tienen utilidad industrial.
RE+ERENCIAS 4elczar G. A. y 'han 2. '. ". 1@@: H2lementos de AicrobiologíaI. 2ditorial Ac. BraJ ill. Aéxico.
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COMISION ACADEMICA NACIONAL S AREA AGRO-INDUSTRIAL ALIMENTARIA
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MANUAL N#. ' RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS OBETIVO Determinación de microorganismos enterobacter en en alimentos. INTRODUCCIÓN 5l inestigar la presencia de entero bacterias en un alimento se hace, no sólo sobre los gérmenes Bram negatios fermentadores de la lactosa (coliformes), sino también sobre la lactosa negatia* tan importante como los Salmonella, Shigella y otros. !a familia familia 2nterobact 2nterobacteriace eriaceae ae está integrada por bacilos bacilos Bram negatios, negatios, generalment generalmente e móiles móiles por flagelos perítricos, a eces inmóiles (Shigella), que fermentan la glucosa con producción frecuente de gas, aunque otras eces no y reducen los nitratos a nitritos. 2l recuento total de enterobacterias consiste en la determinación del n&mero de enterobacterias por gramo o mililitro de alimento.
MARCO TEORICO 13
!os organismos entéricos son un grupo de bacilos Bram negatios que, no esporulados cuyo habitad es el intestino del hombre y de los animales. 5lgunos (por e#emplo 2scherichia coli) forman parte de la flora normal y del intestino, intestino, otros (por e#emplo las Salmonellas y las Shigellas) son generalmente patógenos para el hombre. !as bacterias intestinales son aerobias, fermentan una gran ariedad de carbohidratos y poseen una estructura antigénica muy comple#a. !a mayoría de las bacterias Bram negatias poseen lipo8polisacaridos comple#os en su pared pared celula celularr. 2stas 2stas substa substancia ncias, s, endoto endotoxin xinas, as, tie tienen nen una arieda ariedad d de efecto efectoss fis fisiop iopato atológ lógicos icos.. !as endotoxinas de las bacterias Bram negatias son lipo8polisacaridos comple#os y deriados de la membrana de la célula bacteriana y muchas eces liberadas por la lisis de la bacteria. Después dedel su sistema introducción en elendotelial cuerpo dedespués los mamíferos, las endotoxinas son eliminadas principalmente las células retículo de la adsorción transitoria inicial en los leucocitos depor la circulación. !as bacterias coliformes son un grupo grande y heterogéneo de bacilos Bram negatios que en cierta forma son similares similar es a la Escherichia coli . !a comple#idad del grupo, las ariaciones en los resultados de las pruebas bioquímicas y las relaciones ecológicas cambiantes han conducido a una profusión confusa de nombres. Gunto a 2. coli habitante del intestino, los siguientes grupos se incluyen frecuentemente entre los coliformes= 1. E5 g;7# K54:6455 Klebsiell iella a pneumoniae pneumoniae 8"= inicialm inicialment ente e K54:6455"-E! "-E!4;#:" 4;#:"84;-( 84;-("ncuba >ncubarr a 09O' 09O' duran durante te -/ -/ + /: ora orass
RESULTADOS !as colonias de estafilococos aparecen negras, brillantes, con bordes reducidos blancos y rodeados de zonas claras que contrastan con el medio opaco. "e cuenta el n&mero de colonias que tienen estas características y se multiplica por el factor de dilución. 5 continuación se procede a identificar las colonias sospechosas de Staphylococus aureus, inestigando la presencia de las enzimas. 4rueba de la Dnasa= 5 partir de una colonia típica, sembrar sobre una placa de Dnasa %est 5gar bien seco, practicando solo tres estrías separadas. >ncubar a 09O' 1: + -/ horas. 'ubrir las placas con 'l 13 y obserar el aclaramiento del medio alrededor de las áreas de crecimiento, en cuyo caso es Dnasa positio. 4rueba de la coagulasa= 5 partir de las colonias negras crecidas en agar Raird84arLer, Raird84arLer, sembrar en medio de infusión cerebro8corazón (Rrain eart >nfusión) e incubar -/ horas a 09O'. Del crecimiento resultante pasar - ó 0 gotas a un tubo de hemolisis que contenga . ml de plasma de cone#o. >ncubar a 09O' y obserar periódicamente para comprobar si ha coagulado. 3ormalmente la coagulación tiene lugar antes de las / horas, h oras, en cuyo caso se demuestra la producción de coagulasa por el microorganismo.
CUESTIONARIO 1.
>nest >nestiga igarr las cara caracte cterís rístic ticas as de crec crecimi imient entos os de los los staph staphyloc ylococc occus us y estreptococos.
-.
C'uál C'uál es la la finali finalidad dad y reacc reacción ión que que se lle llea a a cabo cabo en el medio medio de plasm plasma a de cone cone#oE #oE..
0.
C'u C'uál es la rea eaccci ción ón que que se lle llea a a cab cabo en el medi medio o de Dnas Dnasa a %es estt ag agar ar y 'l 'l 1 3. 3.,, con con el microorganismoE
/.
C'ómo C'ómo se se trans transmit mite e la enfer enfermed medad ad produ producid cida a por la toxin toxina a de esta estafil filococ ococosE osE
.
Aencio Aenciona na tres tres alimen alimentos tos inol inolucr ucrado adoss en el contag contagio io de entero enterotox toxina inass de est estafi afiloc lococo ocos. s.
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COMISION ACADEMICA NACIONAL AREA AGRO-INDUSTRIAL ALIMENTARIA
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MANUAL N#. & IDENTI+ICACIÓN ) RECUENTO DE BACILLUS CEREUS OBETIVO >dentificara los microorganismos Bacillus cereus en alimentos.
INTRODUCCIÓN 2ste microo 2ste microorga rganis nismo mo sapróf saprófito ito,, consid considera erado do como como no patóge patógeno no por ía oral, oral, pr produ oduce ce toxiin toxiinfec feccio ciones nes alimentarias cuando tiene la oportunidad de desarrollarse en los alimentos en n&mero igual o superior a 1 M colonias coloni as por gramo. gramo. "us esporas esporas resisten a la acción del calor por lo que de esta forma pueden pueden sobreiir en productos alimenticios que han sido sometidos a calentamiento. 2s un bacilo, móil por flagelos perítricos, esporulado, con esporas termod&ricas, es decir, que resisten a la pasteurización e incluso a tratamientos más fuertes. 2labora una fuerte lecitinasa.
MARCO TEORICO 2s una causa de enfermedad transmitida por los alimentos que se reconoce con poca frecuencia. %iene una morfología celular similar a la del B. anthracis pero a diferencia de éste en general es móil y no es susceptible a la penicilina o al gama8fago. (1) 18
!a intoxicación alimentaria por B. cereus puede causar dos síndromes clínicos= 1. tiene un periodo periodo de incubación incubación bree bree de cuatro cuatro horas. horas. "e caracteriza caracteriza por náusea náuseass y ómitos seeros seeros y con frecuencia se confunde con la intoxicación i ntoxicación alimentaria estafilocócica. -. tie tiene ne un period periodo o de incubació incubación n más prolongad prolongado o (19 hr hrs) s) y se caracte caracteriz riza a por cólicos cólicos abdomi abdominal nales es y diarrea. abitualmente se confunde con la intoxicación alimentaria al imentaria por clostridios. (1)
G4!4;"53"346 Bacillus cereus causa intoxicaciones alimentarias a traés de la ingesta de alimentos contaminados. 2n general
se admite que, debido a la leedad del d el cuadro y a que la detección microbiológica de esta bacteria no se realiza rutinariamente en pacientes diarreicos, la incidencia real puede ser superior a la estimada. !a bacteria elabora dos tipos distintos de toxinas relacionadas con dos síndromes clínicos diferenciados= síndrome emético y síndrome diarreico. D"g!68# 98;#:#5g8# 2n medios no selectios de uso generalizado como agar sangre esta bacteria origina grandes colonias beta hemolíticas planas con apariencia de idrio esmerilado. "in embargo, en los casos de toxi8infección alimentaria la presencia de flora potimicrobiana en las muestras (heces, ómitos, alimentos) hace aconse#able el empleo de medios selectios diferenciales como manitol8polimixina8yema de hueo, medio de Qim8Boepfert o manitol8 polimixina8piruato8yema de hueo con azul de bromotimol o p&rpura de bromocresol. 2n estos medios polimixina R act&a como agente selectio. 2l carácter diferencial iene mediado por la actiidad lecitinasa de incapacidad para catabolizar catabolizar el manitol. !os medios se incuban Bacillus cereus sobre la yema de hueo y su incapacidad 09P' durante /: horas. 2n ocasiones puede ser coneniente emplear un medio preio de enriquecimiento como caldo de so#a tripticasa con polimixina.
MATERIAL= REACTIVOS ) E>UIPOS 4ipetas estériles de 1 ml* 1 de 1 ml 1 5sa bacteriológica 1 'a#as 4etri estériles 0 matraces 2rlenmeyer de - ml 1 Aechero 1 2spátula 1 Bradilla %ubo de ensaye 1 7idrio de relo# 1 probeta graduada 1 ml 4ar de gu guan ante tess de asbes asbesto to,, 4i 4ice ceta ta ag agua ua y
M43#6 34 875?#F 5gar sal y manitol >ndicador ;o#o metilo 'aldo peptonado 1 yema de hueo Auestra= Auestr a= cualqu cualquier ier aliment alimento o a base base de tri trigo, go, maíz o arroz
alcohol METODOLOGIA 1. 4or duplicado duplicado y a partir de las dilucion diluciones es decimales decimales del alimento, alimento, se deposita deposita .1ml .1ml de cada dilución dilución sobre la superficie bien seca del medio de agar manitol -. "e extiend extiende e el inócul inóculo o por toda la superfi superficie cie con ar arilla illa de idrio idrio estéril estéril y se incuban incuban las placas placas a 0O' 0O' durante -/8/: horas. 0. 5l cabo cabo de este este tiemp tiempo o se hace hace la lect lectura ura..
RESULTADOS !o !oss B. Cereu Cereus s dan colonias rosas rodeadas de una zona de opacidad de la yema de hueo debida a la lecitinasa. !as colonias son planas con tendencia a inadir, de contornos irregulares, con aspecto seco y rugoso. 2l medio de Aossel contiene manitol. !os microorganismos manitol positios hacen irar el ro#o fenol a amarillo. 2l B. Cereus es manitol negatio, por lo que no hace irar el indicador. !a polimixina ni inhibe el crecimiento del B. Cereus pero si el de la flora secundaria. !a lecitina de la yema de hueo, al crecer el B. Cereus, se precipita por acción de la lecitinasa l ecitinasa de este microorganismo. 19
!a confirmación bioquímica se hace sembrando las colonias sospechosas en el medio para la reacción de la gelatinasa y en el agua de peptona para ro#o metilo. "e incuban los cultios -80 días a 0O'.
RECUENTOF 2l B. Cereus es=
;o#o metilo
T
Belatina
T
!ecitinasa
TT
2l recuento de B. Cereus se hace contando las colonias típicas sobre el medio de Aossel y multiplicando el n&mero por el factor de dilución para referir el resultado a un gramo de producto.
CUESTIONARIO 1.8 C'ómo se desarrolla e influye el R. 'ereus en los alimentosE -.8 C'uáles son los factores de crecimiento de estos microorganismosE 0.8 C'uál es la sustancia que produce este microorganismoE
RE+ERENCIAS arrigan, U.dentificara y determinará la cantidad de salmonella contenido en un alimento INTRODUCCIÓN 2n los los alim alimen ento tos, s, las Salmonellas, como como cons consec ecue uenc ncia ia de la na natu tura rale leza za de la cont contam amin inac ació ión n se en en acompa6adas de gran cantidad de enterobacterias muy similares. De aquí la necesidad de su enriquecimiento. 'omo a pesar de su enriquecimiento suele ser difícil demostrar su existencia, éste debe hacerse en arios medios selectios, ya que parece ser que cada uno de estos medios puede frenar e inhibir el desarrollo de ciertas cepas de Salmonella. MARCO TEORICO G4!4;"53"346 !as salmonellas son bacilos bacilos Br Bram am negati negatios os,, oxidasa oxidasa negati negatios os,, anaero anaerobios bios facult facultati atios os,, amplia ampliamen mente te distribuidos en diferentes ambientes. 4roducen principalmente cuadros gastrointestinales, fundamentalmente asociados a intoxicaciones alimentarías con una alta incidencia en los países desarrollados. %ambién %ambién gérmenes pertenecientes a la misma especie son los causantes de las fiebres tifoideas y paratifoideas ( Salmonella typhi y Salmonella paratyphi !, B y C ). ). 2n 2spa6a, durante el período 1@@81@@-, el :/W de las toxi8infecciones alimentarías fueron debidas a alguno de los serotipos de Salmonella sp de la subespecie subespecie >. !a incidencia incidencia de la fiebre fiebre tifoidea ha disminuido de una forma considerable en los <imos a6os, hasta una tasa por 1. habitantes de 1,: en 1@@0. !a do dosi siss infec infecta tant nte e de las las salmonellas oscila entre 1 y 1@ $3B? $% D2! "$; D2! 2"%5D? D2 A2K>'? $% D2 !5 $5"%2'5 >D5!B$23"2 $% D2 35Y5;>%
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