Practicas 2 y 3 de Bioquimica 2019

 

Manual de Praácticas de Bioquíámica mica

PRACTICA 2 COLORIMETRIA Y FOTOMETRIA Muchos Much os expe experi rime ment ntos os en bioq bioquí uími mica ca depe depend nden en de la abs absor orci ción ón de la lu luzz mono mo nocr crom omát átic ica, a, de una una so solu luci ción ón,, en la regi región ón visi visibl ble e y ul ultr trav avio iole leta ta del del es espe pect ctro ro electromagnético. Muchas moléculas de interés biológico absorben la luz en la longitud de onda comprendida entre !! " #!! nm ó !!! " #!!! $. %or e&m., purinas, pirimidinas y ácidos aromáticos, así mismo los ácidos nucleicos y las proteínas. 'tros e&m., son las hemoproteínas (citocromos, hemoglobina y mioglobina) carotenoides y esteroides. Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda* pero en otras casos es necesario trans+ormar la sustancia a un derivado coloreado, usando un reactivo adecuado. anto el color (colorimetría) como la transmitancia (+otometría) de la luz de una solución pueden usarse como medida de su concentración. -a colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un material de concentración desconocida se compara, mediante el color, con un estándar que contiene una concentración conocida del mismo material. oy se usa poco ésta técnica. -a mayor parte de procedimientos analíticos usan el principio +otométrico, es decir, la medida de potencial transmisor de luz de una solución coloreada, a una longitud de onda espectral especí+ica. Muchos Muc hos aparato aparatoss llamad llamados os /color /coloríme ímetros tros// son realme realmente nte +ot +otóme ómetros tros seg0n seg0n la estric estricta ta de+inición. i la longitud de onda puede seleccionarse a lo largo de un intervalo continuo, interponiendo un prisma o una red de dispersión, entre la +uente de luz y la muestra, el instrumento se denomina /espectro+otómetro/. 2n +otometría o en espectro+otometría se compara la transmitancia de la luz a través de una solución que contiene materiales absorbentes con la transmisión de la misma luz a través de otra solución que solo contiene disolvente. 2sta 0ltima se denomina solución de re+erencia o reactivo blanco o simplemente blanco* debe ser idéntica a la primera excepto en que carece de los materiales absorbentes de la luz que han de estudiarse. 3mbas soluciones deben medirse ba&o idénticas condiciones de longitud de onda, intensidad de luz incidente y anchura de cubeta (longitud de paso de luz).

1. ENERGIA RADIANTE -a -ass ra radi diaci acione oness elec electro troma magn gnéti éticas cas,, conoc conocid idas as co corr rrien ientem temen ente te co como mo lu luz, z, es está tán n compuestas por paquetes de energía llamados +otones o cuantos. 4e acuerdo a laa 8!! longitud de onda, se conocen tres zonas5 a) 6ltravioleta (67), comprende radiaciones de 1!! nm de longitud* b) -uz 7isible (color), está constituida por radiaciones electromagnéticas de 89! a ::! nm de longitud de onda y c) 2l ;n+rarro&o, entre !!! a 8!!!! nm. 6na onda de luz posee campos eléctricos y magnéticos oscilantes que están en +ase, pero son perpendiculares a la dirección de propagación. -a longitud de onda, de la luz, se da en cm y se relaciona con la velocidad de luz en el vacío, en cmO Falibrar el espectro+otómetro a cero utilizando agua destilada como blanco. -uego, determinar la extinción de solución problema, usando todo el rango espectral del equipo. Medir en un tubo de ensayo 1 ml de ro&o de +enol adicionarle una gota de a' y mezclar.  3note las absorbancias para cada longitud de onda y para la solución problema, teniendo especial cuidado de anotar la longitud de onda de máxima absorbancia

DATOS DAT OS E;PERIMENTALES E ;PERIMENTALES  

R!@! de "e%!'

RES7LTADOS DISC7SI0N CONCL7CI0N BIBLIOGRAFA %ara obtener los espectros de absorción y la longitud de máxima absorbancia, utilice papel milimetrado y gra+ique los valores de absorbancia de la solución (corregidos para la absorción del disolvente, si se usó otro en vez de agua) en las ordenadas en +unción de la longitud de onda que se coloca en las abscisas. -uego unir los puntos con un trazo suave.  3notar en la grá+ica, la longitud de onda de máxima absorbancia para cada solución. -uego co cons nsig igne ne la di disc scusi usión ón,, la conc conclus lusió ión n o conc conclu lusi sion ones es a la lass qu que e ar arri riba ba y la bi bibl blio iogr gra+ a+ía ía consultada. E;PERIMENTO N< 2. DEMOSTRACION DE LA LEY DE BEER Y CONSTR7CCION DE C7R9AS DE CALIBRACION OB>ETI9OS %oner %oner en evid eviden enci cia a la ley ley de @eer @eer""-amb ambert ert ha haci cien endo do us uso o de co conc ncent entra raci cion ones es progresivas del ro&o de +enol. F7NDAMENTO 1

 

Manual de Praácticas de Bioquíámica mica i se mantiene constante la longitud de onda de máxima absorción, la absorbancia dependerá de la concentración

MATERIALES 2spectro+otómetro. ubos de ensayo Pradillas %ipetas Ko&o de +enol 1x1! "B M @u++er borato !.1 M, p 9.#  3gua destilada

METODO DE TRABA>O a) C4ra de $a'#bra$#% *ara e' r!@! de "e%!'. %repare un sistema de tubos como se indica a continuación y lea a CB! nm5 T7BO N< @u++er borato !.1 M, p 9.# Ko&o de +enol 1 x 1!"B M  3gua destilada

B' B.! "" 1.!

1 B.! !.1 !.9

2 B.! !. !.#

3 B.! !.B !.>

 B.! !.> !.B

( B.! !.# !.

, B.! 1.! ""

DATOS DAT OS E;PERIMENTALES E ;PERIMENTALES T4b! N<

C!%$e%tra$#% de R!@! de Fe%!' M

Ab

F$

@l 1  8 B C >

RES7LTADOS DISC7SI0N CONCL7SI0N BIBLIOGRAFA %ara obtener las curvas de calibración, calibración, utilice utilice papel milimetrado milimetrado y gra+ique gra+ique los valores de absorbancia en las ordenadas y la concentración del colorante en las abscisas. 4ebe tener  en cuenta quepara el tamaIo loslínea e&es en el plano deben ser del mismo tamaIo, independiente de la escala, obtenerdeuna recta de aproximadamente BCQ. 4eterminar el +actor de calibración promedio. -uego consigne la discusión, la conclusión o conclusiones a las que arriba y la bibliogra+ía consultada.

C7ESTIONARIO 1. 6n compues compuesto to presen presenta ta un máximo máximo de absor absorció ción n a >>! nm. %ar %ara a una concen concentra tració ción n !.:C RM se obtuvo una absorbancia de !.B. abiendo que el límite de sensibilidad del método utilizado es de !.1 RM a 8 RM, calcule la concentración de este mismo compuesto correspondiente a una absorbancia de !.#C. .

2l coe+i coe+icie ciente nte de absor absorció ción n espe especí+i cí+ico co de un comple comple&o &o de glucóg glucógeno eno"io "iodo do a 1C! nm es !,!. Falcular la concentración de glucógeno en una disolución del comple&o yodado que tiene una absorción de !.8# en una cubeta de 8 cm de espesor .

8.

6n enzima enzima puro puro que contien contiene e molibdem molibdemo o tiene tiene un coe+icie coe+iciente nte de absorc absorción ión especí+ especí+ico ico de 1

 

Manual de Praácticas de Bioquíámica mica 1.C en una cubeta de 1 cm de espesor. 6na disolución concentrada de la proteína se vio que contenía 1!,C> mg de Mo B

pGa



! Nig.1. de la mglicina. ml deFurva ácido de titulación l de álcali

e puede notar dos sectores en donde la curva tiende a la horizontalidad, es decir en donde ocurren las menores variaciones en el p, no obstante que la cantidad de a' aIadida, es la misma que para otros sectores de la curva. i reparamos en que p ocurren estos horizontalidad laoxim curva, notaremos muy próximos aes, .8 y 9.>* 9.>* losectores qu que e quier quide ere ecasi de deci cirr qu que e en las lade s prox pr imid idad ades es de dell pGque deestán su suss gr grupo upos s io ioni niza zabl bles , el aminoácido tendrá una mayor acción amortiguadora del p. 2sto nos permite anotar que de los di+erentes aminoácidos, la histidina (por su n0cleo imidazol) es el más importante en el control del p de los líquidos extracelulares, que como se sabe es de aproximadamente :.B. 2n el punto isoeléctrico los aminoácidos son menos solubles en agua y no migran a ning0n electrodo ba&o la in+luencia de una corriente eléctrica.

AISLAMIENTO Y SEPARACION DE AMINOACIDOS -os aminoácidos pueden ser separados por Fromatogra+ía de intercambio iónico, en este procedimiento las moléculas de las soluciones son separadas por di+erencias en sus propiedades ácido"base. %ara tal +in, se usan columnas con resinas sintéticas, la cual tiene gr grup upos os qu quím ímic icos os con con una una carga carga de deter termi mina nada. da. 6na 6na de la lass más más us usada adass co corr rres espo ponde nde al " polies pol iestir tireno eno,, con grupos grupos de ácido ácido sul+ón sul+ónico ico ('8 ) unidos unidos cooval coovalent entemen emente te a los anillo anilloss bencénicos. 2sta resina, por intermedio de sus grupos sul+ónicos puede captar cationes e 1

 

Manual de Praácticas de Bioquíámica mica intercambiarlos con otros cationes (resina de intercambio catiónico). 2n virtud de la propiedad de los aminoácidos de adoptar determinada +orma eléctrica se seg0 g0n n el p de dell medi medio o en que que se en encu cuent entre ren, n, lo loss amino aminoáci ácidos dos pu pued eden en se serr se sepa parad rados os +ácilmente por 2lectro+oresis. -a técnica consiste en suspender a los aminoácidos en un medio de p determinado y colocar la solución sobre un soporte, que puede ser simplemente papel y someterlo a la acción de un campomigrarán eléctrico.aeg0n intensidad demayor carga oy menor secundariamente seg0n su tamaIo, los aminoácidos uno u la otro polo y con velocidad. 2xiste otro método muy usado para la separación de aminoácidos y que no está basado en sus propiedades eléctricas sino en la di+erente solubilidad que tienen en una mezcla de solventes no miscibles. Fuando un aminoácido se disuelve en una mezcla de solvente no miscible se reparte entre ellos de acuerdo a su grado de solubilidad, que en la práctica corresponde a su coe+iciente de partición o de reparto. 2ste principio se aplica en la técnica denominada Fromatogra+ía de %apel y Fromatogra+ía de Fapa Nina.

PARTE E;PERIMENTAL E;PERIMENTO E;PERIMENT O N< 1. REACCION CON NINIDRINA F7NDAMENTO -os aminoácidos reaccionan con la ninhidrina dando un color azul violáceo. 2n esta reacción la ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y descarboxilado. MATERIAL ubos de ensayo %ipetas Pradillas @aIo maría olución de aminoácidos !.1 M (glicina, metionina, cisteína, histidina, arginina, tirosina, tripto+ano y cistina) Faseína 1A 'voalb0mina !.1A (o Flara de uevo CA) inhidrina !.1A en etanol de 9CA METODO DE TRABA>O %repare el siguiente sistema de tubos5  

ubo Q  3minoácidos !.1 M Faseína 1A 'voalb0mina !.1A  3gua destilada inhidrina !.1A

1 !.C " " " 1.C

 " !.C " " 1.C

8 " " !.C " 1.C

B

" !C 1.C

Mezclar mediante agitación suave y llevar a baIo de agua hirviente por 1! minutos. Ketire y en+ríe.

DATOS DAT OS E;PERIMENTALES E ;PERIMENTALES  3note sus observaciones. ;ndique si la reacción es positiva o negativa seg0n corresponda.

1

 

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REACCI0N Faseína 'voalb0mina  3gua destilada RES7LTADOS DISC7SI0N CONCL7SI0N BIBLIOGRAFA %resente +otos de la reacción y explique los resultados. E;PERIMENTO E;PERIMENT O N< 2. REACCION ;ANTOPROTEICA ;ANTOPROTEICA F7NDAMENTO 2s una prueba positiva para aminoácidos aromáticos (tirosina, +enilalanina y triptó+ano). e basa en la nitración del n0cleo de benceno (anillo aromático) dando derivados amarillos, cuando se calientan con ácido nítrico concentrado* estos derivados se tornan anaran&ados por  adición de a' (se +orman sales). MATERIAL ubos de ensayo %ipetas Pradillas @aIo maría olución de aminoácidos !.1 M (glicina, tirosina y tripto+ano) 'voalb0mina Faseína 1A !.1A (o Flara de uevo CA)  3cido nítrico concentrado a' 1 

METODO DE TRABA>O %repare el siguiente sistema de tubos5 ubo Q  3minoácidos !.1 M Faseína 1A 'voalb0mina !.1A  3gua destilada  Xcido ítrico

1 1.! " " " 1.!

 " 1.! " " 1.!

8 " " 1.! " 1.!

B " " " 1.! 1.!

 3gite suavemente y lleve a baIo maría por 1! minutos. Ketire y en+ríe. 3dicione 1.! ml de a'.

DATOS DAT OS E;PERIMENTALES E ;PERIMENTALES  3note sus observaciones. ;ndique si la reacción es positiva o negativa seg0n corresponda. REACCI0N Faseína 'voalb0mina  3gua destilada

RES7LTADOS DISC7SI0N CONCL7SI0N BIBLIOGRAFA %resente +otos de la reacción y explique los resultados.

E;PERIMENTO E;PERIMENT O N< 3. REACCION DE MILLON 1

 

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F7NDAMENTO 2sta prueba para ser positiva requiere la presencia de un radical hidroxibenceno, y por  lo tanto, es especí+ica para tirosina y sus derivados ya sea que estén libres o en una proteína o en sus productos de hidrólisis. 2sta reacción también se emplea en la cuanti+icación de tirosina. 2l reactivo de Millon es una solución de nitratos mercuriosos y merc0ricos, conteniendo ácido nítrico. -as proteínas del tipo de las alb0minas de huevo, que precipitan por ácidos minerales +uertes, producen un precipitado blanco que se va volviendo ro&o a medida que se calienta. 'tras proteínas como las proteosas y peptonas solo producen una coloración ro&a en las mismas condiciones, debido a que las soluciones contienen sales inorgánicas (Fl ") en gran cantidad, precipitando el reactivo de Millon, este método no se emplea para determinar  proteínas en la orina

MATERIAL ubos de ensayo %ipetas Pradillas @aIo maría olución de aminoácidos !.1 M (tirosina) Faseína 1A 'voalb0mina !.1A (o Flara de uevo CA) Keactivo de Millon METODO DE TRABA>O %repare el siguiente sistema de tubos5

 

ubo Q  3minoácidos !.1 M Faseína 1A 'voalb0mina !.1A  3gua destilada Keactivo de Millon

1 1.! " " " 1.!

 " 1.! " " 1.!

8 " " 1.! " 1.!

B " " " 1.! 1.!

Mezclar y llevar a baIo de agua hirviente por C minutos. Ketire y en+ríe.

DATOS DAT OS E;PERIMENTALES E ;PERIMENTALES  3note sus observaciones. ;ndique si la reacción es positiva o negativa seg0n corresponda. REACCI0N Faseína 'voalb0mina  3gua destilada

RES7LTADOS DISC7SI0N CONCL7SI0N BIBLIOGRAFA %resente +otos de la reacción y explique los resultados. E;PERIMENTO N< . REACCION CON ACETATO DE PLOMO F7NDAMENTO Fuando un compuesto orgánico que contiene azu+re, es tratado con una solución +uerte de a', este se hidroliza seg0n5 1

 

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2ste sul+uro inorgánico es altamente ionizable y como resultado de esto se puede obtener alg0n test de precipitación para el ion sul+uro. 6no de los más comunes es la precipitación por el plomo. 2n e+ecto, la adición de acetato de plomo causa la +ormación de sul+uro de plomo (negro o pardo). 2l azu+re de la cisteína reacciona +ácilmente con el acetato de plomo en cambio el azu+re de la metionina a causa de su gran estabilidad no ennegrese con el plomo. -a mayor  parte de las proteínas contienen contienen azu+re +ormando +ormando parte de la metionina. on excepciones las queratinas, insulina y ciertas seroalb0minas que contienen azu+re en +orma de cistina o cisteína. -a +ibroína de la seda y algunas protaminas no contienen azu+re. -a ergotioneina también contiene azu+re y puede dar esta reacción.

MATERIAL ubos de ensayo %ipetas Pradillas @aIo maría olución de aminoácidos !.1 M (cisteína, cistina y metionina) 'voalb0mina !.1A (o Flara de uevo CA) a' B!A  3cetato de %lomo !.C M

METODO DE TRABA>O %repare el siguiente sistema de tubos5 ubo Q  3minoácidos !.1 M Faseína 1A 'voalb0mina !.1A  3gua destilada a' B!A  3cetato de plomo !.C M

1 .! " " " 1.! !.C

 " .! " " 1.! !.C

8 " " .! " 1.! !.C

B " " " .! 1.! !.C

Mezclar y llevar a baIo de agua hirviente por 8 minutos. Ketire y en+ríe.

DATOS DAT OS E;PERIMENTALES E ;PERIMENTALES  3note sus observaciones. ;ndique si la reacción es positiva o negativa seg0n corresponda. REACCI0N Faseína 'voalb0mina  3gua destilada

RES7LTADOS DISC7SI0N CONCL7SI0N BIBLIOGRAFA %resente +otos de la reacción y explique los resultados. E;PERIMENTO N< (. REACCION M$CARTY-S7LLI9AN F7NDAMENTO 1

 

Manual de Praácticas de Bioquíámica mica irven para identi+icar la presencia de metionina. %ara tal e+ecto se utiliza nitroprusiato de so sodi dio o ( (a a'Ne(F)C) desar desarro rollllánd ándose ose un una a co colo lorac ració ión n ro& ro&a a en prese presenc ncia ia de di dich cho o aminoácido.

MATERIAL ubos de ensayo %ipetas Pradillas @aIo maría olución de aminoácidos !.1 M (glicina, metionina) 'voalb0mina !.1A (o Flara de uevo CA) a' >  itroprusiato de sodio (! gO %repare el siguiente sistema de tubos5 ubo Q  3minoácidos !.1 M Faseína 1A 'voalb0mina !.1A  3gua destilada a' >  itroprusiato de sodio

1 1.! " " " 1.! !.C

 " 1.! " " 1.! !.C

8 " " 1.! " 1.! !.C

B " " " 1.! 1.! !.C

-leve los tubos a baIo maría a temperatura no mayor de B!QF durante 1! minutos. -uego en+ríe y por las paredes del tubo tubo deslice 1.! ml de Fl. Fl.

DATOS DAT OS E;PERIMENTALES E ;PERIMENTALES  3note sus observaciones. ;ndique si la reacción es positiva o negativa seg0n corresponda. REACCI0N Faseína 'voalb0mina  3gua destilada -uego agite los tubos y observe otra vez

RES7LTADOS DISC7SI0N CONCL7SI0N BIBLIOGRAFA %resente +otos de la reacción y explique los resultados. E;PERIMENTO E;PERIMENT O N< ,. REACCION DE OPINS-COLE F7NDAMENTO 2sta prueba es positiva para aminoácidos que poseen un anillo indol como el tripto+ano. 2l grupo indol del tripto+ano reacciona con el ácido glioxílico (F'"F'') del reactivo en presencia del ácido sul+0rico dando un color p0rpura o violeta en la inter+ase de los dos líquidos. MATERIAL ubos de ensayo %ipetas 1

 

Manual de Praácticas de Bioquíámica mica Pradillas @aIo maría olución de aminoácidos !.1 M (glicina, tripto+ano) Faseína 1A 'voalb0mina !.1A (o Flara de uevo CA)  3cido sul+0rico concentrado Keactivo op=ins"Fole METODO DEdeTRABA>O %repare el siguiente sistema de tubos5 ubo Q  3minoácidos !.1 M Faseína 1A 'voalb0mina !.1A  3gua destilada Keactivo op=ins"Fole

1



8

B

1.! " " " !.C

" 1.! " " !.C

" " 1.! " !.C

" " " 1.! !.C

Folor  observado

4espués de aIadir el reactivo de op=ins"Fole agite y agregue a cada tubo, deslizando por las paredes, 1.! ml de ácido sul+0rico concentrado, luego lleve al baIo de agua hirviente por 8 minutos. Ketire y en+ríe.

DATOS DATOS E;PERIMENTALES E ;PERIMENTALES  3note sus observaciones. ;ndique si la reacción es positiva o negativa seg0n corresponda. REACCI0N Faseína 'voalb0mina  3gua destilada

RES7LTADOS DISC7SI0N CONCL7SI0N BIBLIOGRAFA %resente +otos de la reacción y explique los resultados. C7ESTIONARIO 1. Falcul Falcular ar el punto isoeléc isoeléctri trico co de los siguien siguientes tes aminoác aminoácido idos5 s5 a) glicina, glicina, b) ácido ácido glutámi glutámico co y c) lisina. 4esarrolle las reacciones de disociación .

Fuáles Fuáles son las movil movilida idades des electr electro+o o+oréti réticas cas relati relativas vas a p C.># de alanina alanina,, arginina arginina,, ácido glutámico, serina y triptó+ano.

8.

6na soluci solución ón que contiene contiene ácido ácido aspártic aspártico o (p;D.9#) (p;D.9#),, glicina glicina (p;DC.9: (p;DC.9:), ), leucina leucina (p;DC.9# (p;DC.9#)) y lisina (p;D9.:B) en tampón citrato pD8 es aplicada a una columna cambiadora de cationes equilibrada con el mismo tampón. 2n qué orden eluirán los aminoácidos de la columnaY

B.

6n determ determina inado do péptido péptido +ue +ue tratado tratado con el reacti reactivo vo de anger anger y al realiza realizarr la hidrólis hidrólisis is se observó que el 1"+luoro, ,B"dinitrobenceno (4N@) no reaccionó con ning0n aminoácido, Fómo explicaY

1