Practica No. 8

Práctica No. 8 ³INFLUENCIA DEL pH URINARIO EN LA EXCRECIÓN DE FÁRMACOS´ OBJETIVO y

Determinar las variables farmacocinéticas.

y

Determinar la influencia del pH urinario en la excreción de fármacos a través de la cuantificación de ácido acetilsalicílico en orina.

FUNDAMENTO La

medición de fármacos en orina se ha venido utilizando principalmente

para la investigación y la determinación de ciertos problemas renales (diagnostico). El análisis de fármacos en fluidos biológicos constituye una de las bases del desarrollo de las ciencias farmacéuticas. De acuerdo al propósito buscado en el análisis de fármacos van a variar los requerimientos que deben de cumplir los métodos analíticos a aplicar. Entre los fluidos biológicos más comúnmente utilizados se encuentra la orina y debido a que ésta es muy variable en su composición, volumen y pH, la mayoría de los métodos analíticos exigen una preparación previa de la muestra.

FUNCIONES DEL RIÑON Las

principales funciones del riñón son:

1. Regulación del volumen y composición del líquido líquido corporal. 2. Equilibrio acido-básico. 3. Metabolismo y excreción de materiales no esenciales, incluso drogas. 4. Elaboración de renina, la cual participa en los mecanismos mecanismos reguladores extrarrenales.

Función del glomérulo y los túbulos La

filtración glomerular produce cerca de 180 L de líquido glomerular cada

día. La filtración no requiere gasto de energía metabólica, sino que se debe a un equilibrio entre la fuerza hidrostática y oncótica. La membrana glomerular tiene poros de carga negativa que permiten el paso de agua y iones de carga negativa menores de unos 40 (peso molecular menor de 15 000). Las sustancias entre 40 y 80 (peso molecular aproximado de 40 000) pasan de manera ordinaria, si tienen carga neutra. Las sustancias mayores de 80 no se filtran. El índice de filtración glomerular normal es de 125 ml por minuto. La

función tubular reduce los 180 litros de líquido filtrado por día hasta

cerca de un litro diario de líquido excretado; altera su composición por medio de transporte activo y pasivo. El transporte es pasivo cuando se debe a fuerzas físicas, como gradientes eléctricos o de concentración. Cuando el mecanismo de transporte se realiza en contra de gradientes electroquímicos o de concentración, se requiere de energía metabólica y el proceso se denomina transporte activo. Las

sustancias pueden reabsorberse o secretarse a través de los túbulos;

ambos procesos pueden ser activos o pasivos. También, es posible que las sustancias se muevan en ambas direcciones por medio de transporte tanto activo como pasivo. La dirección del tránsito de las sustancias que se reabsorben es del túbulo al intersticio y a la sangre; las sustancias que se excretan tienen un tránsito inverso. La secreción es la principal vía de eliminación para fármacos y toxinas, específicamente cuando están unidos a proteínas plasmáticas. Debemos recordar que el pH de la orina puede modificar el grado de ionización de numerosos fármacos, lo que se traduce como una mayor o menor  facilidad para poder ser reabsorbidos y pasar a la sangre o ser excretados en la orina. A la vista de todo lo anterior, se puede afirmar que la velocidad de excreción

renal de un fármaco es igual a la velocidad de filtración más la secreción, menos la velocidad de reabsorción.

Concentración y dilución de la orina. Las

asas de Henle permiten la formación de orina hipertónica en relación con el

plasma. Mientras mayor sea la longitud de las asas, la orina puede concentrarse más. La producción de orina hipertónica requiere de la presencia y función normal de asas de Henle. Para una mayor eficiencia del mecanismo de concentración de la orina en los túbulos se requiere del transporte activo de iones y del equilibrio osmótico del agua. El transporte pasivo de agua se conoce como multiplicación de la concentración a contracorriente.  A partir del glomérulo, el equilibrio de las fuerzas hidrostática y oncótica favorece la filtración del plasma a un ritmo cercano a 180 litros por día. En el túbulo contorneado proximal, el sodio pasa de manera pasiva a favor de un gradiente de concentración hacia el ambiente deficiente de sodio de las células que recubren el túbulo contorneado proximal. El cloro lo sigue de manera pasiva para mantener la neutralidad eléctrica, al igual que el agua, como respuesta a los gradientes osmóticos. En seguida, el sodio se transporta activamente contra un gradiente de concentración hacia el intersticio renal. La

mayoría de los datos existente acerca de las características

biofarmacéuticas y farmacocinéticas del ácido acetilsalicílico (AAS) se basan en datos obtenidos gracias al análisis de salicilatos totales. Este hecho se debe en parte a la rápida hidrólisis del AAS y otra, a que los distintos productos obtenidos por metabolización del AAS tienen generalmente, una actividad terapéutica parecida al AAS. La

constante de absorción tiene una gran variabilidad interdividual y está

influenciada por las condiciones fisiológicas del tracto gastrointestinal. Se calcula

que aproximadamente un 30% de la dosis de AAS administrado por vía oral se metaboliza a ácido salicílico (AS) antes de su distribución sistémica. La excreción urinaria de AS sin metabolizar depende del pH y puede oscilar entre un 2 y un 30% aunque existe una gran variabilidad interdividual.

PROCEDIMIENTO: A) El estudio de realizará en tres equipos:

EQUIPO No. 1: Estudiará la excreción de aspirina en un pH urinario alcalino. EQUIPO No. 2: Estudiará la excreción de aspirina en un pH urinario ácido. EQUIPO No. 3: Estudiará la excreción de aspirina en un pH normal. Dentro del mismo equipo se nombrará un voluntario, el cual tomara una dosis de 500 mg de ácido acetilsalicílico V.O. y procederá de acuerdo al protocolo experimental.

B) Criterios de inclusión y/o exclusión.

Criterios de inclusión.

i. Jóvenes sanos de 18 a 30 años de edad. ii. Sexo indistinto. iii. Estar sanos. iv. Respetar el protocolo experimental, mismo que se le dará a leer y explicará antes de iniciarse la práctica. v. Firmar carta de consentimiento informado, antes de iniciar el estudio.

Criterios de exclusión.

i. Padecer algún tipo de enfermedad crónica. ii. Padecer alguna reacción alérgica o de hipersensibilidad al fármaco en estudio. iii. Padecer

enfermedades

de

tipo

renal,

hepático

o

gastrointestinal. iv. Haber consumido, al menos una semana antes y durante el experimento, algún fármaco terapéutico, social o de abuso. v. Haber consumido bebidas alcohólicas al menos 3 días antes y durante el experimento.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL 1.

Los

voluntarios permanecerán en ayuno a partir de las 22 h del día anterior 

al estudio. 2. El día del experimento cada voluntario vaciará completamente la vejiga a las 5:30 am. Llevar a cabo la micción en un vaso de precipitado. Tomar el ph de la orina, anotar el valor en la hoja correspondiente y desechar la orina. 3. Ingerir 250 mL de agua 1.5 h antes de la administración del medicamento. 4. Antes de ingerir el medicamento vaciar la vejiga completamente y guardar  una muestra de 10 mL en un tubo de ensaye con tapón de rosca. Esta muestra corresponde al tiempo cero y se utilizara como blanco. 5. Tomar una tableta de ácido acetilsalicílico de 500 mg con 250 mL de agua natural. Anotar en la hoja correspondiente la hora exacta de la toma del medicamento. 6. A las 7:00 am tomar las siguiente solución: a. Equipo No. 1 (orina alcalina): tomar 2 g de bicarbonato de sodio. b. Equipo No. 2 (orina ácida): tomar 2 g de ácido ascórbico. c. Equipo No. 3 (control): tomar 250 mL de agua natural.

7. Asegurarse de tomar 250 mL de agua cada hora, las primeras 6 horas postadministración. Después de las 6 horas consumir agua al gusto. 8. Durante el experimento no consumir ninguna otra clase de líquido (bebidas carbonatas, agua de frutas, agua con saborizantes, etc.). 9. Colectar la orina durante 8 horas (última orina colectada a las 3:00 pm) post-administración del fármaco. Durante este periodo orinar cada vez que el cuerpo lo requiera. Asegurarse de cada vez de vaciar completamente la vejiga. Depositar la orina en un vaso de precipitado y medir el volumen total en una probeta graduada. No se deberá desechar ninguna porción de orina y en cada intervalo de muestreo grande se recolectará toda la orina de ese intervalo en un solo recipiente. Tomar el pH de la orina. Guardar una licuota de 10 mL y desechar el resto. Anotar volumen de orina, pH urinario y la hora de micción en la hoja correspondiente. 10. A las 9:00 am consumir un desayuno, el cual consistirá de 2 sándwiches; elaborados con una rebanada de jamón y una de queso, una rodaja de tomate y, lechuga y mayonesa al gusto. Además una manzana de tamaño mediano. 11. A las 14:00 consumir una comida al gusto. Incluir una bebida de té helado, máximo de 300 mL. 12. Cuantificar cada una de las muestras siguiendo el procedimiento descrito más adelante, preparando a la vez un blanco de orina y una curva patrón en orina a las mismas condiciones que las muestras.

NOTA:

Los

alumnos deberán guardar todas las muestras ³cero´ y, se

recolectará en un solo reciente la orina blanco de todos los voluntarios para formar un ³pool´ de orina, el que se diluirá 1:3 con agua (esta orina servirá para preparar la curva patrón del estudio). Almacenar en el congelador cada muestra hasta el momento de usarse.

MATERIAL y

1 matraz volumétrico de 100 mL

y

1 matraz volumétrico de 50 mL

y

1 matraz volumétrico de 25 mL

y

3 pipetas volumétricas de 1 mL

y

1 pipeta volumétrica de 5 m L

y

12 tubos de ensaye de 13 x 120 mm

y

1 perilla

EQUIPO y

Balanza analítica

y

Espectrofotómetro UV ± visible

y

Centrifuga

y

Agitador vortex.

REACTIVOS y

Salicilato de sodio

y

Nitrato férrico nonahidratado

y

Cloruro mercúrico

y

Ácido clorhídrico 1N

MUESTRA BIOLÓGICA y

Orina

SOLUCIONES Reactivo para desarrollar color (reactivo de Trinder): Preparación:

Pesar con exactitud y por separado 4 g de nitrato férrico

nonahidratado y 4 g de cloruro mercúrico, colocarlos en un matraz volumétrico de 100 mL. Adicionar un poco de agua destilada para disolver, añadir 12 m L de una solución 1 N de ácido clorhídrico y diluir hasta el aforo con agua destilada.

Solución patrón de referencia de salicilato de sodio a concentración de 100 µg/mL: Preparación:

Pesar con exactitud 50 mg de salicilato de sodio y depositarlos

en un matraz volumétrico de 50 m L, disolver totalmente en 20 mL de orina libre de medicamentos (diluida 1:1 con agua) y llevar hasta el aforo con la misma orina. De esta solución tomar con exactitud una alícuota de 2.5 m L y depositar en un matraz volumétrico de 25 mL, llevar al aforo con agua.



Método analítico para cuantificar salicilatos en orina

1 mL de muestra de orina

Resultados: Tabla I. Curva patrón Concentración (µg/mL) 50 100 250 500 1000 Intercepto (b) Pendiente (m) Correlación (r)

Absorbancia ( 540 nm) -0.0282 0.0318 0.2552 0.5644 1.3001 -0.1053335 0.00139472 0.999540506

Absorbancia ( 540nm) 1.4 y=

1.2

0.001x - 0.105 R² = 0.999

1 0.8

Absorbancia ( 540nm)

0.6

Linear (Absorbancia ( 540nm))

0.4 0.2 0 0

500

1000

1500

-0.2

Grafica de la curva patrón

Tabla II. Resultados de muestreo experimental alcalino Numero Muestra

Hora

pH  Orina

Volumen Excretado (mL)

No. de  Absorbancia micción (540 nm)

1

0

6

19

1

2 

7-8  am 8-9 am

6 

2 9

1

1. 2 990 

9

42 

1

1.1693

3

Concentracion de salicilatos

µg/ml

Total de salicilatos en la muestra µg/ml

4084.90566

118462.264

3677.04403

154435.849

Total de salicilatos total µg/ml

4 5  6  7  8  9

9-10  am 1011 1112  12 13 12 14 1415 

8

12 7

1

0.478 2 

8

49

1

0.8510 

8

303

1

0.0133

8

42 8

1

0.0943

8

32 6

1

0.0745 

8

57

1

0.2 800 

1503.77358

190979.245

2676.10063

131128.931

41.8238994

12672.6415

296.540881

126919.497

234.27673

76374.2138

880.503145

50188.6792

861161.321

Tabla. Resultados del muestreo experimental acido  NUMERO DE MUESTR  A

HOR  A

Ph orin a

Volume n extraido (ml)

Absorbancia s

1 2 3

5:35 7 7:49

7 6 6

215 65 42

0.3671

Concentració n de salicilatos µg/ml

1154.40252

4

8:53

6

45

0.8164 2567.2956

5

9:51

6

60

1.0797 3395.28302

6

10:50

6

166

0.4669 1468.23899

7

11:40

6

124

0.5082 1598.11321

8

12:57

6

250

0.2872 903.144654

9

1:54

6

184

0.3151 990.880503

10

2:55

6

90

0.4992 1569.81132

Total de salicilatos en la muestra µg/ml

48484.905 7 115528.30 2 203716.98 1 243727.67 3 198166.03 8 225786.16 4 182322.01 3 141283.01 9

Total de salicilatos total µg/ml

1359015.0 9

Tabla .resultados del muestreo experimental control  NUMERO DE MUESTR  A

HOR  A

Ph orin a

Volume n extraido (ml)

Absorbancia s

1

7:55

5

116

0.2915

Concentració n de salicilatos µg/ml

916.666667

2

8:40

6

92

0.2872 903.144654

Total de salicilatos en la muestra µg/ml 106333.33 3 83089.308 2

Total de salicilatos total µg/ml

3

9:50

6

120

0.3189 1002.83019

4

11

7

100

0.3168 996.226415

5

12:20

7

100

0.3321 1044.33962

6

13:00

7

110

0.3129 983.962264

7

13:50

7

90

0.3120 981.132075

8

15:10

7

100

0.3814 1199.37107

120339.62 3 99622.641 5 104433.96 2 108235.84 9 88301.886 8 119937.10 7

830293.71 1

Tabla. Concentración del fármaco a diferentes tiempos (alcalino) Muestra

hora

1

7-8 am 8-9 am 9-10 am 10-11 am 11-12  am 12 -13 am 12 -14 am 14-15 am

2 3 4 5 6 7 8

Concentración

(µg/mL)

del

fármaco 1145.47414 468.456113 833.659875 13.0289969 92.3785266 72.9819749 274.294671 1272.53135

Tabla. Concentración del fármaco a diferentes tiempos (acido) Muestra

hora

Concentración

1 2 3 4

5:35 7 7:49 8:53 9:51 10:50 11:40 12:57 1:54 2:55

-

5 6 7 8 9

10

(µg/mL)

del

fármaco

359.619906 799.76489 1057.69984 457.386364 497.844828 281.347962 308.679467 489.028213

Tabla. Concentración del fármaco a diferentes tiempos (neutro) Muestra

hora

Concentración

del

fármaco

(µg/mL) 7:55 8:40 9:50 11 12:20 13:00 13:50 15:10

1 2 3 4 5 6 7 8

285.560345 281.347962 312.402038 310.344828 325.333072 306.524295 305.642633 373.628527

CUESTIONARIO COMPLEMENTARIO

1.-¿Qué otro compuesto se puede utiliza para acidificar la orina? Cloruro de amonio 2.-menciona tres fármacos básicos y tres ácidos con los cuales se favorezca su excreción al acidificar o alcalinizar la orina. Los

tapón

alcalinizantes comprenden: bicarbonato de sodio, lactato de sodio,

trometamina

(THAM)

e

inhibidores

de

la

anhidrasa

carbonica

(acetazolamida), que bloquea la excreción renal de bicarbonato de sodio.

Los

fármacos utilizados con mayor frecuencia para acidificar la orina, a fin de incrementar la excreción de bases como estricnina, anfetaminas y fenticinas son el acido ascórbico y cloruro de amonio.

Discusión La

capacidad de interferir en la excreción del fármaco según el pH se vio

interferido por la capacidad de una orina ácida, básico y a pH normal lo cual se observo que la cantidad de excreción se aumenta al tener un pH ácido. Lo cual nos dice que esto se ve afectado en la vida media del fármaco.

Conclusión: Se cumplió el objetivo de calcula los valores farmacocinéticas, así como observar la influencia del pH en la excreción urinaria del fármaco.