PRÁCTICA N 1 y 2

PRÁCTICA N° 1: OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS, MORFOLOGÍA MICROBIANA. EXAMEN EN FRESCO Y COLORACIONES SIMPLES. IVÁN SABOGAL TORI OBJETIVO El alumno de Medicina conocerá la utilidad de un examen en fresco y de las coloraciones simples.

INTRODUCCIÓN El examen en fresco, es uno de los exámenes más simples para observar cualquier microorganismo, especialmente especialmente si tiene movimiento y el tipo de movimiento. Las coloraciones simples se utilizan para visualizar la morfología y utilizan sólo un colorante. Ej. Azul de Metileno, Azul de Lactofenol y tinta china (da una coloración negativa; el microrganismo no se colorea). Uno de los aspectos más notables de los microorganismos es su tamaño pequeño. En bacterias las medidas se calculan en unidades de micrómetros (1um=0,001mm, hay 1000 micrómetros en un milímetro). La obervación de la bacteria puede darse en uno o varios planos, p lanos, pudiendo evidenciarse formas esféricas (cocos); éstos a su vez pueden disponerse en cadenas (estreptococos), en cadenas y de pares (diplococos); o en racimos (estafilococos). También se observan de forma alargada (bacilos), pudiendo ser alargadas y espiraladas (espiroquetas). (espiroquetas). Estas características morfológicas proporcionan la base principal para su sistematización morfológica. En cuanto a los hongos pueden presentar la forma redondeada como las levaduras o la forma filamentosa como los mohos. Los virus en cambio, nunca se pueden observar al microscopio compuesto, sólo se visualizan a través del microscopio electrónico por su tamaño menor de 300nm (1nm=0,000001mm). MATERIALES -

Tubo con mezcla bacteriana en medio líquido Láminas coloreadas con Azul de Lactofenol de un hongo filamentoso. Láminas montadas con tinta china (coloración negativa). Sirve para discriminar detalles estructurales de algunos microorganismos como las levaduras. Láminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Colorante Azul de Metileno.

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Asa en anillo. Aceite de cedro o de inmersión.

PROCEDIMIENTOS A. OBSERVACIÓN EN FRESCO

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Tomar una asada de la mezcla bacteriana. Cubrir con una laminilla y observar al microscopio con lente de menor y mayor aumento. Observar la morfología y movilidad de los gérmenes

B. COLORACIÓN SIMPLE: AZUL DE METILENO

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Preparar un frotis a partir del tubo con mezcla bacteriana. Fijar al calor. Cubrir el material con unas gotas de Azul de metileno y dejar actuar el colorante durante 3 a 5 minutos. Lavar con agua, secar la lámina al calor suavemente. Observar al microscopio con objetivos de inmersión agregando una gota de aceite de cedro. Anotar en el protocolo.

C. COLORACIÓN SIMPLE: AZUL DE LACTOFENOL:

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Se realiza un cultivo del hongo filamentoso en una gota de medio de cultivo, en una lámina. Cuando hay crecimiento se coloca una gota del colorante sobreel crecimiento. Se cubre con laminilla y se sella con bálsamo de Canada En la práctica se observar con lente de menor y mayor aumento, láminas ya listas. Anotar en el protocolo.

D. PREPARACIÓN CON TINTA CHINA

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Se colocar sobre una lámina portaobjetos una gota de tinta china. Se tomar una asada del cultivo a estudiar (Cryptococcus) y se le mezcla en la gota del colorante. Se cubre con laminilla. En la práctica se observa con lente de menor y mayor aumento, laminas ya preparadas. Anotar en el protocolo.

RESULTADOS Anote y esquematice sus observaciones

LÁMINAS

DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA

ESQUEMA DE LA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Examen en Fresco

Coloración con Azul de Metileno

Coloración con Azul de Lactofenol

Preparación con Tinta China

CUESTIONARIO 1.

¿Qué permite observar una coloración simple de un microorganismo al microscopio?  _________________________________________________________________________  _________________________________________________________________________ ¿Qué se observa en el microscopio al examen en fresco?  _________________________________________________________________________  _________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA 1.

Guia de Prácticas de Microbiologia Médica 2005. Departamento de Microbiología Médica UNMSM.

PRÁCTICA N° 2: COLORACIÓN DE GRAM-KOPELOV Y COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN IVÁN SABOGAL TORI OBJETIVO Los alumnos deben: -

Realizarar la Coloración Gram y reconocer microrganismos Cocos Gram Positivos, Cocos Gram Negativos, Bacilos Gram Positivos y Bacilos Gram Negativos. Realizar la coloración Ziehl-Neelsen y reconocer los microorganismos Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes.

INTRODUCCIÓN La coloración Gram es necesaria para clasificar microorganismos, especialmente a las bacterias, en Gram Positivas y Gram Negativas. Los microorganismos Gram Positivos se tiñen de azul y los Gram Negativos se tiñen de color fucsia o rojas. Las bacterias Gram Positivas retienen Violeta de Genciana, por su pared gruesa rica en Peptidoglicanos, luego de resistir la decoloración con solución alcohol acetona. Las bacterias Gram Negativas no retienen Violeta de Genciana, por su pared delgada rica en lipopolisacáridos, y por lo tanto se decoloran totalmente con solución alcohol  – acetona, para luego teñirse con la fucsina básica. La Coloración Ziehl Neelsen nos permite identificar bacterias Ácido-Alcohol Resistentes. Esta coloración se basa en que la alta cantidad de ácidos micólicos, dándole un gran contenido lipídico, en la pared de algunas bacterias. Los acidos micólicos retienen el colorante Fucsina fenicada luego de resistir la decoloración con la solución de alcohol-ácido.

MATERIALES -

Lamina con frotis de mezcla bacteriana. Lamina con frotis de esputo. Serie de Coloración Gram – Kopelov. Serie de Coloración Ziehl - Neelsen. Mechero de Alcohol. Lámina con Stafilococcus sp. Lámina con Streptococcus sp. Lámina con Branhamella catarrahlis. Lámina con Bacillus sp. Lámina con Escherichia coli . Lámina con Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes.

PROCEDIMIENTO a. Realizar la Coloración Gram en la lámina con mezcla bacteriana: -

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Cubrir el frotis con solución de Violeta de Genciana, agregar dos gotas de Bicarbonato de Sodio. Dejar que el colorante actúe por dos minutos. Lavar la lámina con Lugol de Gram y cubrir la lámina con la misma solución por dos minutos. Lavar la lámina con agua corriente. Agregar solución decolorante de alcohol - acetona por el borde de la lámina, no directamente sobre la mezcla de bacterias. Se observa como se desprende la Violeta de Genciana. Dejar actuar solo por 10 segundos. Lavar inmediatamente con agua corriente. Cubrir la lamina con solución de fucsina básica. Dejar actuar por 30 segundos. Dejar secar la lámina parada.

b. Realizar la Coloración Ziehl  – Neelsen en la lámina con frotis de esputo: -

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Cubrir el frotis con solución de Fucsina Fenicada. Aplicar el calor de la llama del Mechero de Alcohol tres veces, observar la formación de 3 vapores (humitos). Se aplica el calor de lallama una vez, se observa y se deja actuar por un minuto, y asi los tres humitos. Evitar que hierva el colorante. Lavar la lámina con agua corriente. Agregar solución decolorante de alcohol - ácido por el borde de la lámina, no directamente sobre el frotis. Se observa como se desprende la Fucsina fenicada. Dejar actuar solo por 2 minutos máximo. Lavar inmediatamente con agua corriente. Cubrir la lamina con solución de azul de metileno. Dejar actuar por 60 segundos. Dejar secar la lámina parada.

c. Observar las láminas con bacterias de diverso tipo. d. Enfocar los microscopios con aceite de inmersión. RESULTADOS Lamina Coloracion Gram

C. Ziehl-Neelsen

Descripción morfológica

Esquema de observación microscópica

Comentarios

CUESTIONARIO 1. ¿Qué importancia tiene la pared bacteriana en la coloración Gram y la Coloracion ZiehlNeelsen?  __________________________________________________________________________  __________________________________________________________________________ ¿Identifica otras formas especiales de bacterias y su forma de agruparse con la coloración Gram?  _________________________________________________________________________  _________________________________________________________________________ ¿Identifica otros elementos que se observa en la Colracion Ziehl Neelsen?  _________________________________________________________________________  _________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA 1.

Manual de Prácticas y Atlas. Asignatura de Microbiología y Parasitología. Departamento de Microbiologia Médica. EAP Enfermeria. Dra. Hilda María Solis Acosta. 2009.

2.

Guía de Prácticas. Microbiología. Médica. Curso Microbiología Medica Básica. Escuela Académico Profesional Medicina Humana. Departamento Academico de Microbiologia Medica. Dr. Rito Zerpa Larrauri. 1998.

3.

Manual de Prácticas Atlas de Microbiología Médica a Color. Curso Microbiología Medica Básica. Escuela Académico Profesional Medicina Humana. Departamento Academico de Microbiologia Medica. Dr. Rito Zerpa Larrauri. 2009.

4.

Microbiologia e Inmunologia Medicas. Warren Lavinson. Octava Edicion McGraw-Hill Interamericana de España SAU. 2004.