Practica Kunitz

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS PRÁCTICA: “DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIAD DE ENZIMS PROTEOLÍTICAS. MÉTODO DE KUNITZ” Alumno: Amaro Beatriz Uriel Grupo: 5QM1 Sección: 1 Profesor que evalúa: Benitez Ibarra Rogelio

Fecha de entrega: 22/09/2016

FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE KUNITZ El método se fundamenta en el cambio de solubilidad de una proteína en ácido tricloroacético (ATC) cuando está sujeta a la acción de una enzima proteolitica. 2 Mide la cantidad de péptidos y/o aminoácidos que sean solubles durante la hidrólisis. Dichos compuestos, o al menos algunos, absorberán a 280 nm. OBJETIVOS   

Establecer una curva de actividad enzimática estándar. Determinar la actividad enzimática de la bromelaína y la papaína (enzimas proteolíticas) a partir de una curva estándar de actividad enzimática de la Tripsina. Determinar cuál de las enzimas empleadas tienen mayor actividad enzimática sobre el mismo sustrato.

RESULTADOS Tabla 1. Datos para la curva de Actividad enzimática de la Tripsina y de los Problemas de las enzimas a determinar su actividad. Tubo T1 T2 T3 T4 T5

y y y y y

1 2 3 4 5

TI y I TII y II Tlll y lll TlV y IV

Conc. de Tripsina (mg/mL) 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2

A280 Problem Testigo a 0.221 0.049 0.367 0.051 0.455 0.059 0.549 0.054 0.588 0.067 Problemas Bromelaína 0.727 0.44 1:10 Bromelaína 0.417 0.269 1:20 Papaína 1:2 1.147 0.331 Papaína 1:4 0.681 0.216

A280 corregid a

0.172 0.316 0.396 0.495 0.521 0.287 0.148 0.818 0.465

12 10 8

A280 corregida

6 4 2 0 0.02 0.04f(x) 0.06 =0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22 R² = 0

Concentración de Tripsina (mg/mL)

Gráfica 1. Curva de Actividad enzimática de la Tripsina. Se tomaron en cuenta únicamente los datos de absorbancia corregida de los tubos T1 y 1 al T4 y 4. (Ver discusión).

Unidades Trípticas: Pendiente de la recta = 2.6225 = 0.1311 UT/mg 20 min. 20 min. Tabla 2. Datos para la Curva de actividad enzimática específica para la digestión de caseína por tripsina.

Tubo

Unidades Trípticas.

1 2 3 4

0.005245 0.01049 0.015735 0.02098

A280 corregid a 0.172 0.316 0.396 0.495

0.6 0.5 0.4

f(x) = 20x + 0.08 R² = 0.98

A280 corregida 0.3 0.2 0.1 0 0

0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02

Unidades Tripticas

Gráfica 2. Curva de actividad enzimática específica. Se tomaron en cuenta

únicamente los datos de los tubos T1 y 1 al T4 y 4. (Ver discusión). Tabla 3. UT/g de muestra en piña y papaya (bromelaína y papaína, respectivamente)

Bromelaína 1:10 Bromelaína 1:20 Papaína 1:2 Papaína 1:4

UT

UT/g de muestra:

0.010225

0.12679

0.003275

0.08122

0.036775 0.019125

0.064724 0.06732

Cálculos: Absorbancia corregida: A280 problema - A280 testigo  0.221 – 0.049 = 0.172 Unidades trípticas: 2.6225/20 min. = 0.1311 UT/mg de tripsina 1 mg de tripsina  0.131 UT 0.4 mg tripsina  0.0052 UT A partir de la ecuación e la recta de la curva de actividad enzimática específica, obtenemos: y = 20x + 0.0825 Para obtener las UT de muestra despejamos “x” de la ecuación anterior: x = y – 0.0825/20 donde “y” es la A280 corregida de las diluciones de bromelaína y papaína, entonces, por ejemplo para el tubo con solución de papaína 1:2: x = 0.818-0.0825/20 = 0.036 UT

Después, para los UT/g muestra:

Considerando el valor anterior de UT, el factor de dilución, el volumen del extracto y el peso de la muestra: UT/g muestra: [UT] (Factor de dil.) (Vol. De extracto) = [0.036](2)(22mL) = 0.0647 UT/g muestra: Gramos de muestra 25 g.

DISCUSIONES

El uso de los tubos testigos es principalmente el de tener tubos sin actividad enzimática para poder comparar pero además nos pueden ayudar a detectar la presencia de sustancias que absorban a 280 nm y que se encuentren presentes antes y después de la hidrólisis de la caseína. Dichas sustancias afectan la lectura de absorbancia, debido a que después de realizar la hidrólisis en los tubos problema, la solución absorberá como si ésta tuviera una cantidad de proteína mayor a la que pusimos. Por lo tanto debe obtenerse una absorbancia corregida, siendo esta la diferencia entre la absorbancia del problema y la absorbancia del testigo, lo anterior se hace con la finalidad de obtener resultados experimentales más confiables. A través de una curva de actividad enzimática realizada con tripsina sobre caseína se puede utilizar para conocer la actividad proteolítica de otras enzimas como la papaína y bromelaína, puesto que los datos de dicha curva son independientes de la enzima proteolítca utilizada sobre el sustrato (en este caso caseína) siempre y cuando se mantengan las mismas condiciones para la determinación (pH = 7.6, T = 35ºC). Para la elaboración de las curva de actividad enzimática y act. Enzimática específica no se tomó en cuenta la absorbancia de los tubos T5 y 5, pues al graficarlo se observaba que ese dato ya no cumplía con la tendencia líneal que nosotros requeríamos para elaborar la curva tipo. Comparando los valores de UT de la tripsina con los de las enzimas que estudiamos, observamos que éstas tienen una mayor actividad proteolítica (hidrolizan más a la caseína), puesto que el valor de UT calculados son mayores a los obtenidos para la tripsina. Aunque hay que considerar que los valores de UT para la papaína y bromelaína las obtuvimos por gramo de muestra. Observamos además que por tener una mayor actividad proteolítica las enzimas trabajadas, las concentraciones de UT no entran dentro de la curva de actividad específica. Comparando la actividad enzimática de la papaína y la bromelaína, obtuvimos que ésta última tiene mayor actividad enzimática puesto que tiene valores más altos de UT/g de muestra. Lo anterior podría relacionarse con que éstas 2 enzimas son utilizadas en algunos lugares como ablandadores de carne, y se ha visto que la eficiencia de la papaína en este particular aspecto es bastante menor que la eficiencia de la bromelina.3

El número de UT/g muestra para la papaína es muy similar independientemente de la dilución, pudiendo sugerir que la actividad enzimática de la papaína sería similar a pasar de estar en menos concentración. Sin embargo el último tubo al que se le añadió enzima fue justamente el tubo de papaína 1:4, y puede que haya transcurrido más tiempo de acción de la enzima y por eso haya una actividad enzimática similar a la del tubo menos diluido (1:2). El grado de maduración de los frutos pudiera ser un factor importante también, puesto que si es más maduro el fruto mayor será el contenido de enzimas hidrolíticas que éste contiene. La piña de la cual hizo el extracto estaba muy madura, más que la papaya, lo cual podría explicar también por qué es mayor la actividad enzimática en este caso de la bromelaína. CONCLUSIONES -Se puede obtener una curva de actividad enzimática estándar que sea independiente de la enzima proteolítica siempre y cuando se utilice el mismo sustrato y las mismas condiciones experimentales (pH, Temperaura, etc.) -Se obtuvo una actividad enzimática para tripsina de: 0.1311 UT/mg -Se obtuvo una actividad enzimática para bromelaína de: 0.126 y 0.081 UT/g mta. (respectivamente para dilución 1:10 y 1:20). -Se obtuvo una actividad enzimática para papaína de: 0.064 y 0.067 UT/g mta. (respectivamente para dilución 1:2 y 1:4).

PREGUNTAS ADICIONALES a)Defina: Actividad enzimática: Capacidad de la enzima para inducir una reacción química determinada.1 Actividad enzimática específica: Relación de la actividad enzimática y la cantidad de proteína en la mezcla.1

b) Clasificación de las proteasas en función de su mecanismo de acción y diga en qué grupo se ubican las determinadas en la práctica.

La papaína y la bromelaína pertenecen al grupo de las cisteín proteasas. c) ¿Para qué se añade cisteína en las muestras de piña y papaya? El mecanismo catalítico de las cisteín-proteasas involucra la formación de un intermediario enzimático acilado. El ataque nucleofílico se realiza a través de in grupo tiol reactivo de una cisteína presente en el sitio activo. El tiol se transforma en un nucleofilo al desprotonarse gracias a un residuo de His ayacente. Tienen actividad proteolítica debido a que bromelina y papaína que se activan por la cisteína, tiosulfato y glutatión.3 d) ¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina? La tripsina rompe el enlace peptídico después de residuos con largas cadenas laterales cargadas positivamente, a saber, arginina y lisina. BIBLIOGRAFÍA: 1. Styer, L. Bioquímica. 6ª edición. Reverté. Barcelona. 2008. Pp. 67. 2. Ramírez, K. et al. ENZIMATICA S DE ACTIVIDADES PROTEOLITICAS DE PRODUCTOS UTILIZANDO LATEX DE PAPAYA (Carica Papaya) PARA LOGRAR EL ABLANDAMIENTO DE LA CARNE. (En línea) Departamento de Graduados e Investigación en Alimentos. ENCB-IPN. Consulta: 18/09/2016. Disponible en: [http://www.smbb.com.mx/congresos %20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/CIII-8.pdf ] 3. Clavijo, Diego; Portilla Martinez, Maghdiel Cecilia; Quijano Parra, Alfonso Cinética de la bromelina obtenida a partir de la piña perolera (Ananas Comosus) de Lebrija-Santander Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Básicas, vol. 10, núm. 2, 2012, pp. 41-49