Práctica II Fermentación de etanol-Bioprocesos FUA.pdf

FUNDACIÓN UNIVERSIDAD DE AMÉRICA INGENIERÍA QUÍMICA BIOPROCESOS II PRÁCTICA DE LABORATORIO CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN UN CULTIVO BATCH 1. OBJETIVOS   

Realizar el montaje para la preparación de una fermentación de etanol a partir de levadura comercial Observar el crecimiento de un microorganismo a través del incremento de biomasa Determinar el comportamiento de la concentración de la biomasa en función del tiempo durante la fermentación para la producción de etanol

2. MARCO TEÓRICO En general, el proceso de fermentación implica el empleo de microorganismos para llevar a cabo transformaciones de compuestos orgánicos catalizados por enzimas provenientes de la levadura, éstas actúan sobre sustancias poliméricas para convertirlas en otras de menor peso molecular (degradarlas) con desprendimiento de CO2, agua y calor. La fermentación alcohólica de define como el proceso bioquímico por el cual las levaduras transforman los azúcares del mosto en etanol y CO2. Para que la fermentación se realice de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en condiciones anaerobias. Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la producción de etanol. Saccharomyces cerevisiae es la levadura más comúnmente utilizada. S. cerevisiae crece en hábitats ricos en azúcares tales como frutas, flores y cortezas de árboles. Dentro de los usos industriales más importantes está la producción de alcohol etílico a partir de materiales que contienen carbohidratos; este proceso es usado en cervecerías, destilerías, panadería y vinatería. El punto de partida de cualquier fermentación es un recipiente limpio que ha sido esterilizado con el medio de cultivo estéril (nutrientes). Posteriormente, el fermentador se inocula con el microorganismo adecuado. El tamaño del inoculo generalmente es del orden del 1-10% del volumen total del medio. Si es inferior a esta proporción puede existir un período de latencia excesivamente prolongado, lo que prolongará el período de fermentación. Para evitar estos problemas, el proceso de fermentación se lleva a cabo en cuatro etapas: I. II. III. IV.

Preservación del inoculo Multiplicación del inoculo Cultivo de pre-fermentación Fermentación de producción

Etapa I: Preservación del inoculo La preservación de las cepas de producción a lo largo de un período largo de tiempo es un requisito básico para una fermentación práctica. El objetivo no es la mera

FUNDACIÓN UNIVERSIDAD DE AMÉRICA INGENIERÍA QUÍMICA BIOPROCESOS supervivencia de las cepas. Los microorganismos pueden ser mantenidos viables fácilmente a través de un período de transferencia, pero lo que debe ser preservado es su capacidad de formar el producto de interés. El objetivo de la preservación busca mantener las cepas durante tanto tiempo como sea posible sin división celular. Las cepas maestras no deberían ser cultivadas más que una vez cada dos años controlando los niveles de actividad con cada uso. Dependiendo de la cepa, deben ser llevados a cabo periódicamente programas de selección. Las cepas de trabajo derivan de las cepas maestras. Las cepas de trabajo deben ser inspeccionadas en relación a su pureza y su capacidad de formar productos para posteriormente ser almacenadas hasta su uso. Etapa II: Crecimiento del inoculo El cultivo preservado se reaviva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo líquido en agitación o en medio sólido si se requiere la formación de esporas. Las condiciones utilizadas en el cultivo inicial (composición del medio, temperatura de incubación, pH, etc.) dependerán del proceso específico. Etapa III: Pre-cultivo en fermentador A fin de obtener suficiente inoculo para el fermentador de producción, deben realizarse pre-cultivos en fermentadores más pequeños. Si un fermentador de producción se inicia con poco inoculo, el crecimiento se retrasa y la velocidad de formación del producto puede ser insatisfactoria. La concentración óptima del inoculo para el fermentador de producción determina el número de etapas del pre cultivo que son necesarias. En general se requieren las siguientes concentraciones de inoculo: Organismo Actinomicetos Otras bacterias Hongos

Proporción en volumen del inoculo (%) 5-10 0,1-3 5-10

A veces el medio de cultivo de producción se utiliza en la última etapa de formación del inoculo a fin de inducir la formación del producto. Etapa IV: Fermentación de producción Dependiendo de la fermentación se utilizan bio-reactores de distinto tamaño y configuración. 2.1 Factores que influyen en la fermentación alcohólica Existen factores tanto físicos como químicos que inciden positiva o negativamente en el transcurso de la fermentación alcohólica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentación. Los más relevantes son los siguientes:

FUNDACIÓN UNIVERSIDAD DE AMÉRICA INGENIERÍA QUÍMICA BIOPROCESOS 2.1.1 Temperatura: A mayor temperatura la fermentación transcurre más rápidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y más cantidad de compuestos secundarios. Las levaduras a 30°C tienen su temperatura óptima de desarrollo. Por encima de 35°C la actividad disminuye rápidamente y mueren a antes de 45°C. 2.1.2 Oxigeno: Aunque la fermentación es un proceso anaeróbico, las levaduras mantienen una leve respiración utilizando para ello el oxígeno disuelto en el mosto. 2.1.3 Nutrientes: Los azúcares son fuente de energía para las levaduras.

3. MATERIALES 3.1 Equipos   

Baño termostatado o estufa Balanza analítica Agitador orbital o Shaker

3.2 Reactivos      

Levadura Saccharomyces cerevisiae, fresca o liofilizada (25 g) Glucosa (20 g). Puede ser reemplazada por miel, panela raspada o melaza Sulfato de amonio (fuente de N) o Urea Fosfato de potasio (fuente de fosforo) Harina de trigo o de soya Solución HCl para ajustar pH (1 N y 0,1 N)

3.3 Materiales (por grupo)       

Termómetro 4 vasos de precipitado de 250 ml 1 probeta de 250 ml 1 Erlenmeyer de 250 ml 1 pipeta graduada de 10 ml 1 espátula 1 agitador de vidrio

Nota: Por parte del estudiante traer la levadura comercial (fresca o liofilizada) y la harina de trigo o de soya 4. METODOLOGIA a) Para preparar el inoculo de fermentación, se debe adicionar una relación de 50 g/L de levadura comercial a un Erlenmeyer de 100 ml, (ya preparado con la siguiente composición sulfato de amonio o urea (2g/L), fosfato de sodio (1 g/l) y glucosa (10 g/l) con un pH de 4,5). Una vez pesada la levadura y adicionada en el Erlenmeyer,

FUNDACIÓN UNIVERSIDAD DE AMÉRICA INGENIERÍA QUÍMICA BIOPROCESOS disolver con la ayuda de un agitador de vidrio y colocar en un agitar orbital o shaker a 150 rpm por un tiempo de 40 min. b) Rotule y marque 3 vasos de precipitado de 100 ml c) Añada a cada uno de los vasos las siguientes sustancias, en orden Sustancia Harina (g) Glucosa (g) Agua (ml)

Vaso 1 Vaso 2 25 25 3 3 22,5 15

Vaso 3 25 3 0

d) Una vez pasen los 40 minutos de agitación del inoculo de fermentación, retire del shaker y adicione a cada vaso de precipitado el siguiente volumen de inoculo Vaso 1 Vaso 2 Volumen de inoculo (ml)

7,5

Vaso 3

15

30

e) Mezcle con ayuda del agitador de vidrio muy bien la solución resultante f)

Pese cada una de las muestras preparadas

g) Vierta el contenido de cada uno de los vasos en tres probetas de 100 ml diferentes (márquelas antes de usar) h) Mida el volumen ocupado por cada muestra i)

Coloque las probetas en un baño de María a 30º C

j)

Lea y registre las alturas de las muestras en la probeta a tiempo cero (apenas coloca en el baño de María) y a intervalos de 2-5 min, durante 30 min

5. Datos Realizar el seguimiento del incremento del volumen de fermentación en el tiempo, registrando el volumen observado. Una vez finalice los 30 min, volver a pesar y registrar el peso final. Tiempo (min) Volumen (cm3) 0 2 4 6 8 10 12

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6. RESULTADOS ESPERADOS 6.1 Discuta los resultados obtenidos con la variación de la biomasa 6.2 Realice un diagrama de proceso de la fermentación etanólica a gran escala. 6.2 Explique en qué consiste un sistema de fermentación tipo: batch, continua, por lote alimentado, por lecho empacado (inmovilización de células). 6.3 Consulte teóricamente cual es el rendimiento YP/S de una fermentación etanólica. 6.4 Qué significa la inhibición por producto y por sustrato en un proceso de fermentación