Practica Del Nmp

UNC CIENCIAS AGRARIAS INDUSTRIAS ALIMENTARIAS CURSO: MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS I TEMA: PRÁCTICA DEL NMP NOMBRE: JUDIT SANDINA ABANTO ATALAYA. PROFESOR: LIC. RODOLFO OREJUELA CHIRINOS FECHA: 20/04/14

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PRACTICA DEL NMP I.

OBJETIVOS:

*Aprender los métodos de recuento , especialmente con el NMP. *Determinar la presencia de coliformes totales y fecales por el método del Número Más Más Probable. *Detectar si la muestra traída es apta para el consumo humano.

II.

INTRODUCCION

Debido a que las aguas residuales son de composición variada provenientes de descargas de usos municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrícolas, pecuarios, domésticos, incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier uso, así como la mezcla de ellas, contienen diferentes tipos de microorganismos contaminantes y las diferentes concentraciones, dependiendo dependiendo de su fuente. fuente. La variada población de microorganismos en esta agua, proviene del suelo y de origen intestinal, incluyen aerobios y anaerobios estrictos y facultativos así como también numerosos virus como: Poliovirus y virus de la hepatitis. Igualmente pueden contener formas parasitarias variables como quistes de Protozoarios y huevecillos de Helmintos (Metazoarios). Asimismo, existe en nuestro país el grave problema de contaminación de ríos, lagos acuíferos y costas debido a que estos son utilizados como depósito de todos los desechos generados por las actividades humanas. Estos microorganismos pueden sobrevivir al tratamiento, por lo que su reuso p.ej., en riego agrícola, actividades recreativas: Aguas de piscinas, baños de hidromasaje, aguas potables naturales, actividades piscícolas y aguas marinas superficiales (playas), representan un riesgo potencial a la salud pública. Por todo lo anterior, además del estudio de las características fisicoquímicas del agua se requiere de un estudio microbiológico. Para este propósito se deberán obtener muestras representativas usando los procedimientos de toma de muestras establecidos en las Normas Oficiales Mexicanas. Para la determinación del NMP de Coliformes Totales y Fecales en este tipo de aguas, es necesario proceder a preparar diluciones decimales decimales de la muestra, debido a que se espera espera que la concentración de coliformes colifor mes sea superior en éstas que en un agua potable. El número de diluciones varía mucho, dependiendo del origen de la muestra a tratar. Por lo demás, para su análisis de procede en la misma forma que para una muestra de agua potable.

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III.

MARCO TEORICO:

El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes. Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se puede estimar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística.1 La precisión del método del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan; cinco tubos por dilución se considera como una relación adecuada entre precisión y economía. Una condición del método es la necesidad de poder reconocer un atributo específico de la población en el medio de crecimiento que se emplee. La estimación de la densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en sucesivas diluciones en serie y el empleo del cálculo probabilístico.2 Hay muchas entidades discretas que son fáciles de detectar pero difíciles de contar. Una aplicación es el de cualquier clase de reacción de amplificación o reacción de catálisis que impide una cuantificación fácil, fáci l, pero permite que su presencia sea detectada de modo muy sensible. Algunos ejemplos comunes son: crecimiento de microorganismos, acción enzimática, o catálisis química. El método del NMP supone tomar la disolución original o muestra y subdividirla en un factor (frecuentemente 10 veces, o 2 veces) y evaluar la presencia/ausencia en múltiples subdivisiones. El grado de dilución para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los elementos se han diluido tanto que hay muchas submuestras en las que no aparece. Un juego de repeticiones para cualquier concentración dada permite una resolución más fina, para usar el número de muestras positivas y negativas que estiman la concentración original dentro del apropiado orden de magnitud. Este método se usa para contar microorganismos difíciles de cultivar en medio sólido, o para determinar el número de células que pueden crecer en un medio líquido determinado, como el análisis para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias Escherichia coli que pueden crecer en un medio con lactosa. La presencia de E. coli en el agua potable es una prueba de contaminación.

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hasta obtener partes alícuotas. Los cultivos son incubados y evaluados a ojo, eludiendo el tedioso recuento de colonias, o el caro y tedioso recuento microscópico. En biología molecular, una aplicación habitual se da en las plantillas de ADN diluidas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las reacciones sólo se dan si una plantilla está presente, permitiendo una forma de PCR cuantitativa, para así evaluar la concentración original de las moléculas de la plantilla. Otra aplicación consiste en diluir los depósitos de enzima en la disolución que contiene un sustrato cromogénico, o diluir antígenos en disoluciones para ensayos ELISA (Enzyme(EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay) o alguna otra reacción de detección en cascada de anticuerpos, para medir la concentración original de enzima o de antígeno. La principal debilidad de los métodos del número más probable es la necesidad de un gran número de copias duplicadas con la dilución adecuada para estrechar los intervalos de confianza. Sin embargo, es un método muy importante para recuento cuando el orden de magnitud es desconocido a priori y el muestreo es necesariamente destructivo. La potabilidad del agua es de gran importancia en cuanto a Salud Pública, ya que ésta puede servir como vehículo de microorganismos patógenos, es decir, productores de enfermedades llamadas comúnmente "de origen hídrico" tales como Salmonelosis (Tifoidea y Paratifoidea), Shigelosis, Cólera, Hepatitis, etc. Estos microorganismos son todos de origen entérico. Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los depósitos de agua, proceden de las descargas intestinales de hombres y animales. Además, ciertas especies de bacterias, particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos similares, denominados coliformes, Estreptococos fecales (como Streptococcus fecales) y Clostridium perfringens, son habitantes normales del intestino grueso de hombres y animales y en consecuencia siempre están en las materias fecales. Así pues, la presencia de cualquiera de estas especies en el agua es evidencia de contaminación fecal y el camino está abierto a los patógenos ya que se encuentran en las materias fecales. La evaluación rutinaria del agua en busca de microorganismos patógenos, como Salmonella spp. Y Shigella spp. puede ser difícil de realizar ya que el número de estas bacterias es relativamente escaso, por lo que se tiene que recurrir a pruebas bacteriológicas del agua potable que demuestren la presencia de microorganismos indicadores que siempre estén presentes en materia fecal, fácil de demostrar y que sirva de guía para conocer el grado de contaminación fecal. Surge así el concepto de "Indicador de contaminación fecal", el cual será utilizado para la valoración de la potabilidad bacteriológica de las aguas. De acuerdo con lo anterior, se ha adoptado con carácter general, el "Grupo Coliforme" como indicador más digno de confianza. La OMS incluye dentro del grupo Coliforme todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram negativos, no esporulados, que producen ácido y gas al fermentar la lactosa, a 35  – 37 °C.

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contaminación fecal. En cuanto a la investigación de patógenos en agua, no existe un método único que permita aislar e identificar todos estos microorganismos.

El grupo Coliforme incluye todos los bacilos gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas, dentro de 24-48horas a 35°C Si consideramos este grupo en relación con la familia enterobacteriaceae se verá que incluye los géneros: escherichia, citrobacter, enterobacter y klebsiella.

 prueba presuntiva presuntiva

Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia. 1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una distribución uniforme de los microorganismos.

2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado, preparar diluciones. 3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL de la muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 mL de agua de dilución estéril, -1 obteniendo de esta manera una dilución de 10 . -1

4. Agitar el tubo de la dilución 10  y con otra pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL y -2 llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de dilución estéril para obtener una dilución de 10 . -3

5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilución de 10   o hasta donde sea necesario. 6. Inocular asépticamente con 1 mL de muestra por quintuplicado, tubos de fermentación conteniendo caldo lactosado o caldo lauril triptosa, a partir de las últimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores en refrigeración por si se requiere su utilización posterior. 7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24-48 horas. 8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos, es decir, con con producción de ácido, si el medio contiene un indicador indicador de pH, turbidez y producción de gas en el interior interior de la campana Durham. 9. Al hacer esta verificación es importante asegurarse que la producción de gas sea resultado de la fermentación de la lactosa, en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas de aire.

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11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales. 12. En caso de de no apreciarse crecimiento en el el resto de los tubos, incubación 24 horas más.

continuarán en

13. Después de 48 horas (±2h) a partir de la inoculac ión, se hace la lectura final. 14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni producción de gas, los tubos se toman como negativos. interpretacion: • si el total de tubos son negativos: el examen se da por terminado, reportando la ausencia de coliformes totales y fecales en la muestra analizada. • todos aquellos tubos que den positivos para prueba presuntiva se anotarán convenientemente y se procederá a realizar la prueba confirmatoria para coliformes totales y fecales.  prueba confirmatoria confirmatoria para para coliformes coliformes totales: totales:

1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB). 2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C. 3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas. interpretacion: • Si se observa turbidez y producción de gas:

La prueba se considera positiva, debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. • Si en ninguno ninguno de los tubos tubos se observa observa producción de gas, aun cuando se observe observe turbidez:

Se consideran negativos, estableciéndose estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP • Si todos los tubos dan negativos ó todos dan positivos, con base en los grados de dilución analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución

menores (mayores volúmenes de muestra) ó mayores (menores volúmenes de muestra), respectivamente.

 prueba confirmatoria para coliformes coliformes fecales: 1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli).

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si se observa turbidez y producción de gas: la prueba se considera positiva, debiendo anotar el número de tubos positivos positi vos para posteriormente hacer el cálculo del nmp. si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: se reporta la ausencia de coliformes fecales.

calculos : De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes Totales y Fecales, establecer los códigos correspondientes para calcular por referencia en las tablas estadísticas el NMP de Coliformes Totales y Fecales en 100 mL de agua.

En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear emplear para los cálculos la siguiente ecuación:

elaboracion y presentacion de resultados.

Los resultados se elaboran de la siguiente manera: • Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor cero. • A continuación se establece el triplete de valores correspondiente a las tres series anteriores a la del valor cero que podrá ser leída en la tabla del NMP. • Para efectos de expresar el valor obtenido basándose en 100 mL de muestra habrá de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de muestra inoculada i noculada en cada tubo de

la serie central de cada triplete escogido. En general se tiene:

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reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófano. Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha formado un complejo coloreado entre el indol y el p-dimetilamino benzaldehído. El alcohol amílico concentra el complejo coloreado en la superficie A la izquierda se observa un cultivo de E. coli y a la derecha otro de Salmonella s

Rojo de metilo (RM) Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo.

Voges-Proskauer Detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína). La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio (Ej. Arginina). La acetoína en contacto con el oxígeno y la potasa origina diacetilo. El alfa naftol incrementa la sensibilidad de la reacción. El diacetilo origina un compuesto de color rosado. La prueba será positiva si en 20 minutos aparece una coloración roja. Los cultivos negativos se incuban 1-2 horas a 37 oC en posición inclinada efectuándose de nuevo la lectura. (El contacto con el oxígeno y la elevada temperatura favorecen la reacción). A la izquierda cultivo de Serratia spp. Y a la derecha de E. coli

Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple T riple Azúcar Hierro) El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia

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Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

E.M.B. agar Contiene colorantes de azul de metileno y eosina Y, que inhiben las bacterias grampositivas en cierto grado. Los colorantes también actúan como indicadores diferenciales en respuesta a la fermentación de la lactosa o la sacarosa por parte de los microorganismos. Los coliformes producen colonias de color negro azulado, mientras que las colonias de Salmonella y Shigella son incoloras o de color ámbar transparente. Las colonias de Escherichia coli pueden exhibir un brillo verde metálico característico debido a la rápida fermentación de la lactosa. El conjunto de medios de aislamiento de baja selectividad para Salmonella en muestras fecales y de otros tipos incluye el EMB Agar (con y sin sacarosa). Este medio puede inhibir el crecimiento de las bacterias gram-positivas como los estreptococos fecales, estafilococos y levaduras, o bien favorecer su crecimiento con formación de colonias puntiformes.

Característica de las colonias: E. coli : Colonias grandes, color negro azulado, brillo verde metálico Enterobacter/Klebsiella:: Colonias grandes, mucoides, color negro azulado Enterobacter/Klebsiella Proteus: Colonias grandes, incoloras Salmonella: Salmonella: Colonias grandes, desde incoloras hasta color ámbar Shigella: Shigella: Colonias grandes, desde incoloras hasta color ámbar Pseudomonas: Colonias irregulares, incoloras Bacterias gram-positivas: gram-positivas : Crecimiento escaso o nulo

-Microorganismos fermentadores de lactosa y / o sacarosa: colonias de color negro azulado o amarronado. Pueden tener centro oscuro y brillo metálico.

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Mac Conkey Agar

El medio del cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de las sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. -Microorganismos fermentados de lactosa: colonias rosadas-rojizas. Puede observarse algo de precipitación biliar. -Microorganismos no fermentadores de de lactosa: colonias del color del medio, incoloras

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-Baño maría para Coliformes fecales a una temperatura constante de 44 °C (±0.5 °C). -Asas - Estufa -caldo lauril sulfato triptosa -Caldo brilla mas agua peptonada -Caldo lactosado -Caldo MacConkey -Reactivo Kovacs − Cerillos ó encendedor. − tubos de 18 x 150 mm conteniendo 9 mL de agua de dilución estéril. − Pipetas de 1 mL estériles. − tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo caldo lactosado estéril de concentración sencilla. −  tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante estéril. − tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo caldo E.C. estéril. − Cajas de Petri conteniendo Agar Endo estéril. − Tubos de 18 x 150 mm conteniendo agar nutritivo inclinado estéril. − Agitador de tubos Vortex. − Gradillas para tubos − Asa Bacteriológica. − Incubadora a 35 °C.

IV.

RESULTADOS:

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Según la revisión de las tablas tablas nos da la lectura lectura de 0,7UFC /ct ml. Método presuntivo = coliformes totales NMP: - Test presuntivo Coli total - Test confirmamos Coli fecal usamos dos tubos y utilizamos caldo lauril sulfato

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Estudio de la composición y características de coly fecal Pruebas bioquímicas

ROJO (COLI +)

V.

AMARILLO (COLI -)

DISCUSIONES:

 prueba presuntiva : • Si el total de tubos son negativos: el examen se da por terminado, reportando la ausencia de coliformes totales y fecales en la muestra analizada.

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si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: se reporta la ausencia de coliformes fecales.

VI. 

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CONCLUSIONES:

El método del recuento del numero mas probable es de gran utilidad para saber si el agua potable es apta o no para el consumo humano El análisis de coliformes totales y fecales requiere de mucho cuidado higiénico, de organización y de desinfección y esterilizado antes y después de las tomas de las muestras. El agua Potable de la unc como muestra es muy apta para el consumo humano, mientras que la otra muestra tene presencia de colis totales y fecales

VII.

BIBLIOGRAFÍA:

*Secretaria de Comercio y Fomento industrial. 1987. NNX-AA-42-1987. Calidad del agua determinación del numero más probable (NMP) de coliformes totales, totales, coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia Coli presuntiva. 21 p. p. * Manual de laboratorio para identificación de prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos de patógenos bacterianos de importancia para salud pública en el mundo en desarrollo. USAID, OMS, CDC 2004. *http://es.scribd.com/doc/6456981/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-N-05Determinacion-de-coliformes-totales-y-fecales *http://www.bing.com/search?q=practica+de+GUA+NMP&form=LECNTX&pc=MALNJS&mkt=e s-pe&scope=

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