Practica de Lowry ENCB

Instituto Politécnico Nacional Escuela nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Métodos de Análisis

Determinación de proteínas por el método de Lowry

Profesor: Francisco Fernández López Alumna: Chato morris gutierrez Grupo: 4IM1

Semestre: 15/2

Sección: 3

OBJETIVOS: a) Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico. b) Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry. c) Conocer el efecto de sustancias no proteicas, en el desarrollo de color.

d) Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas. FUNDAMENTO: El método de Lowry utiliza tres sistemas para producir coloración por la presencia de proteínas. En primer lugar, el Cu +, forma complejos de coordinación con dos enlaces peptidicos consecutivos de las proteínas, dando lugar a un compuesto coloreado azul. En segundo lugar, este compuesto es capaz de reducir el reactivo de Folin-Ciocalteu (ácido fosfotungstico y fosfomolibdico), dando un color mas azulado. Por último, el reactivo de FolinCiocalteu también reacciona con los restos tirosinil (residuos de tirosina) de la cadena polipeptidica, produciendo así mismo un color azul por la reducción de fosfomolibdato en medio básico. RESULTADOS: Tabla 1. Curva de calibración de albúmina Tubo No.

Cantidad de proteína

A595 Serie a

Serie b

(μg) 1

25

0.023

0.029

2

50

0.080

0.043

3

75

0.119

0.110

4

100

0.142

0.130

5

125

0.186

0.188

Tabla 2. Resultados de la regresión lineal Aplicando la regresión lineal a la curva graficada R

0.9815

A

0.001586

B

-0.0139

Curva de calibración (Lowry) f(x) = 0x - 0.01 R² = 0.96

Grafica 1. Representación de la curva de calibración. De la ecuación de la curva y=0.001586x - 0.0139 donde y es la absorbancia y x la concentración de proteína, despejando a x obtenemos; x= ( y +0.0139) ⁄ 0.001586 . Tabla 3. Replicas para el análisis estadístico obtenidas con la ecuación de la curva. Tubo No.

A595

Cantidad de proteína (x); (μg)

1

0.132

92.0239

2

0.110

78.1525

3

0.124

86.9798

4

0.121

85.0882

5

0.107

76.2610

6

0.104

74.3648

7

0.108

76.8915

8

0.108

76.8915

9

0.108

76.8915

10

0.109

77.5215

Tabla 4. Resultados del análisis estadístico realizado con las concentraciones obtenidas. XX 80.1070

μ = XX͞

±

S

S2

%C.V.

μ

5.8051

33.6991

7.2466

75.95-84.25

μ = 80.10 ± %C.V. =

t: “t” tablas (2.262)

ts/ √ n

S XX

(2.262 x 5.80)/ √10 x 100

%C.V. =

μ = 80.10 ± 4.12

5.80 80.10

x 100 = 7.24 %

Tabla 5. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el método de Bradford. Tubo No.

sustancia

A595

Cantidad de proteína

Tipo de interferenci a generada

1

Tris 1M, pH 7.0

0.156

107.15

Positiva

2

Glicerol al 1% (v/v)

0.147

101.48

Positiva

3

Detergente comercial al 1%

0.161

110.30

Positiva

4

Dodecil sulfato de sodio al 1%

0.134

93.28

Positiva

5

Ácido tricloroacéti co al 5%

0.129

90.13

Positiva

Tabla 6. Comparación del método de Lowry con otros métodos de determinación de proteína (ventajas y desventajas) Método de Biuret

Método de Bradford

Método de absorción en uv (280nm)

ventajas

desventaja s

En un método general

Es menos sensible

Su A máxima es a 540nm

Tiene que ser en medio alcalino

Es más rápido

No detecta N2 de fuentes no proteicas

ventajas Es más rápido

desventaj as

ventajas

desventa jas

Reacciona con los iones amonio

Es rápido

Los ácidos nucleicos también absorben a 280nm

Es más sensible detecta 1μg/ml

El color varia con diferentes tipos de proteína

Es más sensible

La solución debe ser lo más clara posible

Necesita más cantidad de muestra

Reacciona con los 20 aminoácido s

Los detergente s interfieren

No existe interferenci as con los Buffer

Se requiere un sistema puro

Presenta opalescencia por presencia de carbohidrato s

Su A máxima es a 595nm

El color puede unirse a las celdas de cuarzo

No destruye las proteínas

Es solo para aminoácid os aromatico s

La reacción se puede completar en 2 min.

Preguntas: a) ¿Cumple su curva la Ley de Bouguer y Beer? R: Si b) ¿Entre qué límites de cantidad de proteína? R: En las concentraciones más bajas y más altas de la proteína determinada (25-125μg). DISCUSIÓN: En la práctica me toco realizar la curva de calibración en la cual se obtuvo un coeficiente de correlación de .9815 el cual es aceptable, pero al visualizar la grafica se observan los puntos alejados de la linealidad y esto puede deberse a que el día de la realización de la practica me encontraba con gripa y esto

genero un poco de distracción en mi manera de trabajar lo cual ocasiono que agregara algunas gotas de mas en los tubos. Para el análisis estadístico le correspondió elaborar las repeticiones a mi compañero en las cuales obtuvo un %C.V. de 7.24 pero ya que la concentración obtenida para las concentraciones viene de el despeje de la ecuación de la curva y esta nos dio una ordenada al origen negativa la cual se esperaba positiva, dicho resultado también se debe a la forma de trabajar que tuve en el momento del desarrollo de la práctica, teniendo en cuenta no solo que tenia gripa sino que esta es la primer practica que realizo en un año tenía un poco olvidado el manejo de el material en el laboratorio. De la obtención de la ecuación de la curva es de donde provienen los resultados obtenidos en cuanto a las concentraciones de las interferencias y estas nos dieron como resultado para la práctica una interferencia positiva lo que quiere decir que entonces nuestras concentraciones en las repeticiones nos dieron elevadas por causa de dichas interferencias. Pero al tener en cuenta que él %C.V. es de 7.24 se tiene un poco en duda los resultados obtenidos de esta determinación. CONCLUSIÓNES:    

El método de Lowry cumple la ley de Bouguer y Beer y sirve para la cuantificación de proteínas Es un método específico ya que identifica solo aminoácidos aromáticos. El método de Lowry es un método más utilizado en cuanto a los otros métodos y es más sensible que el método de Biuret. El método de Lowry con respecto a Bradford es menos sensible y más tardado con el mismo nivel de confiabilidad.

BIBLIOGRAFÍA:

  

Voet, Donald. Fundamentos de bioquímica: la vida a nivel molecular. 2° edición. Editorial Panamericana, p.c. 99. Roca, Pilar. Bioquímica. Técnicas y métodos. Editorial Hélice, 2003, p.c. 155-158 http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Proteinas.pdf

ANEXO

Pruebas para establecer diferencias en exactitud y precisión entre los métodos de Lowry y Bradford.

Prueba de la t

tcalculada = D x

√n SD

XX1 SD XX2 tcalculD prueba están ada ( XX1(Bradfo dar XX2) rd) (Lowr y)

tcalcul “t” confianza 1.89 diferencia entre los

79.9896

Fcalculada= S2 Lowry 209.280

√ 10 8.52

= 1.89

89.5006

78.152 11.348 5 1

83.4298

86.979 -3.55 significativa en la exactitud 8