practica de escala McFarland

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR ESCUELA DE BIOANALISIS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA 2 Lcda. Elena Granda M. TEMA 7: Escala McFarland Objetivo: El estudiante aprenda a:  Preparar estándares para su utilización a nivel del laboratorio  Realizar comparaciones con cultivos inoculados con microorganismos Introducción El patrón o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos herméticamente cerrados, previamente calibrados y con una densidad óptica diferente originada por la aparición de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reacción entre el cloruro de bario (Cl2Ba) al 1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H2SO4) al 1% (0,36N). Esta turbidez puede interpretarse ópticamente o por métodos espectrofotométricos y cada una de ellas se corresponde a una concentración conocida de bacterias/ml. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (cél/ml) que genera una turbidez similar. Para asegurar la densidad del estándar de McFarland así preparado puede ser chequeado usando un espectrofotómetro con una celda de cuarzo de 1cm; para el estándar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede estar entre 0,08 a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estándar de McFarland puede ser verificado por ajuste de una suspensión de una cepa control (por ejemplo, E. coli ATCC 25922) a la misma turbidez, preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en placa. La suspensión así ajustada puede tener un conteo de 1,5x108 ufc/ml. Materiales:  Agar Plate count fundido  Tubos con 5 ml de BHI  Cajas petri estériles  Caja petri con cepa ATCC pura E.coli  Asas  Puntas azules estériles  Cloruro de Bario al 1%  Ácido sulfúrico al 1%  Perillas de seguridad  Pipetas serológicas de 1ml Equipos  Pipetas automáticas (1ml)  Incubadora 35-37°C  Turbidímetro  Espectrofotómetro  Mecheros  Baño María

Procedimiento: Preparación: Se adicionan cantidades crecientes (o decrecientes según corresponda) de BaCl2*2H2O al 1 % (p/v) en H2SO4 al 1% (v/v) de acuerdo a la siguiente tabla para obtener la equivalencia deseada:

Primera parte: Para preparar la escala de McFarland 05, proceda de la siguiente manera: Tubo 0,5

Cl2Ba 1% 0,05

H2SO4 1% 9,95

UFC/ml 1,5 x 108

Segunda Parte:  Leer en el turbidímetro la escala de McFarland realizada y copiar las DO obtenidas de acuerdo a cada tubo de la escala  Leer en el espectrofotómetro en el filtro 546nm la escala de McFarland realizada y copiar las DO obtenidas de acuerdo a cada tubo de la escala  Comparar las DO obtenidas en los dos equipos Tercera Parte:  A partir del tubo que contiene caldo BHI realice una escala McFarland 0.5, con la cepa pura que se encuentra en la caja  Lea en el turbidímetro la DO de su siembra y compare con la DO obtenida en la escala McFarland  Si el resultado no es el esperado y está sobre el valor, aumente caldo BHI estéril al tubo inoculado y vuelva a realizar las mediciones de DO, si al contrario está por debajo del valor esperado aumente colonias.  Al obtener la DO esperada ésta preparación con una pipeta automática colocar el 1 ml de caldo BHI inoculado a la caja petri estéril y añadir 15 ml de medio de cultivo TSA fundido, realizar los movimientos respectivos (sentido de las manecillas de reloj, de arriba hacia abajo, en L y en contra de las manecillas del reloj)para homogenizar la muestra.  Espere a que se solidifique el agar e incube a 37°C por 48 horas

 Realice un recuento y compare si los resultados obtenidos concuerdan con lo esperado es decir 1.5 x 108 UFC/ml. Anexo: Conservación: El estándar de McFarland puede ser almacenado hasta por 6 meses en la oscuridad y a temperatura ambiente entre 22º a 25ºC. Sin embargo, se recomienda almacenarse a ser posibles en refrigeración. Cuidados Descartar después de 6 meses o antes si su volumen es menor. Antes de cada uso, debe agitarse muy bien usando un shaker, hasta que el precipitado blanco de sulfato de bario se haya disuelto en todo el medio.

Consulta: 1. Casos en los que se puede utilizar esta escala de turbidez. Fundaméntelos

Bibliografía correspondiente