Practica 7

Biología molecular

[NOVIEMBRE 2013]

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA CON EL PLÁSMIDO pGLO

RESUMÉN Para desarrollar la transformación bacteriana bacteriana con el plásmido pGLO se hizo uso del kit de transformación transformación proporcionado por BIO-RAD. Este kit nos plantean los protocolos protocolos de una forma clara y secuencial secuencial para así poder obtener una transformación transformación exitosa. exitosa. El desarrollo desarrollo implica tres etapas; etapas; en la primera se realizo la preparación del agar, la ampicilina y la arabinosa, rotulación de las placas, se sirvió el medio y finalmente se almaceno, todos estos protocolos se realizaron de 3 a 7 días antes de la transformación por parte del personal de laboratorio. La segunda etapa implico la rehidratación rehidratación de las bacterias bacterias ( E. coli K-12 ), se sembró en las placas placas para obtener colonias aislada y finalmente finalmen te se preparo el plásmido pGLO, todos estos protocolos se realizaron realizaron 24 -48 horas horas antes de la transformación transformación por parte del personal personal de laboratorio. Finalmente en la etapa tres se prepararon las alícuotas alícuotas y se desarrollo la transformación transformación bacteriana, tomando el plásmido ya rehidratado y la bacteria rehidratada, preparando así así un caldo bacteriano, bacteriano, el cual se sembró sembró en las placas y se llevo a incubación incubación durante 24- 48 horas a 35 °C. Paralelo a este protocolo protocolo se realizo un control de la transforma transformación ción que implico el sembrar el microorganismo microorganismo en los medios medios sin haberle haberle inoculado el plásmido. plásmido. Al día siguiente se llevo a cabo la lectura l ectura y se observo las colonias transformadas.

Palabras clave: Plásmido pGLO, E. coli K-12, Transformación. Transformación.

Biología molecular

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INTRODUCCION El proceso de transformación es la alteración de la composición genética de un organismo, involucra la captación de material genético extraño presente en el exterior de la célula, su reconocimiento y la expresión. La transformación generalmente se hace en bacterias, pero cualquier organismo que cumpla con los requisitos (organismo competente) es susceptible a un cambio y apto para el proceso. De manera natural, la transformación transformación ocurre en algunos tipos de bacterias; el hombre ha logrado manipular bacterias competentes con protocolos específicos que involucran cambios de temperatura para dilatar las membranas de la célula y facilitar el ingreso del material genético. En muchas ocasiones, la transformación se evidencia fácilmente por cambios fenotípicos en el organismo; como es el caso de la incorporación del plásmido pGLO a E. coli. Este plásmido contiene el gen responsable de la síntesis de la proteína GFP (Green Fluorescent Protein) regulable con la adición de arabinosa al medio de cultivo y un gen de resistencia al antibiótico ampicilina. Los genes utilizados para la transformación pueden ser extraídos de plantas, animales, bacterias, hongos etc. y ser insertados en un organismo con características específicas o carecientes de ellas. Actualmente se utiliza la transformación en bacterias para obtener metabolitos útiles en medicina como la inulina, la producción de variedades de plantas resistentes a plagas, enfermedades y ambientes anegados; sin olvidar el sector industrial de producción de alimentos, sustancias químicas, materiales con propiedades especiales, especiales, etc. Debido a esto esto los objetivos de la práctica práctica de laboratorio laboratorio son conocer los principios básicos y las aplicaciones de la transformación transformación bacteriana de E.. coli familiarizándonos familiarizándonos con la técnica que implica la transformación de las células con cloruro de calcio ( Transformación química) de tal forma que podamos analizar e interpretar los resultados experimentales experimentales y cualquier eficiencia de la transformación. transformación.

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MATERIALES Y METODOS El desarrollo de la práctica de laboratorio conllevo tres etapas: Las etapas I y II son realizadas por la asistente del laboratorio de genética y biología molecular.

Etapa I [3 a 7 días antes de la transformación] Preparación del agar Para preparar el agar, se procedió a añadir 500 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Añadir el contenido del paquete de agar LB. Agitar el matraz para disolver el agar, y calentar hasta ebullición en el microondas. Volver a agitar y calentar unas tres veces más hasta que el agar se disuelva, teniendo cuidado de dejar enfriar el matraz antes de agitarlo, para evitar que el medio caliente salte a la mano. Este procedimiento realizarlo mínimo tres días antes de la transformación, de los cuales los dos últimos se deben llevar en refrigeración. Preparar la arabinosa y la ampicilina La arabinosa se encuentra deshidratada en un pequeño vial. Con una pipeta estéril, se añade 3 ml de la solución de transformación en el vial para rehidratar el azúcar. Agita el vial con la ayuda de un vortex. Con otra pipeta estéril, se añade 3 ml de la solución de transformación al vial para rehidratar el antibiótico. Rotular las placas La rotulación de las placas se realizo a 40 placas de agar, cerca del borde de la placa de la siguiente manera; 16 placas como LB, 16 como LB/amp y 8 como LB/amp/ara. Añadir el agar LB en las placas Luego de preparado el medio LB y de haber rotulado las placas se procede primero a, añadir el agar LB en las placas marcadas como LB, a

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continuación, añadir la ampicilina ya hidratada al agar LB sobrante en el matraz. Agitar el matraz brevemente para mezclarla. Rellenar las 16 placas rotuladas como LB/amp. Almacenar las placas Después de dejar las placas dos días a temperatura ambiente se pueden utilizar o se pueden almacenar en columnas de hasta 20 placas de altura introduciéndolas en bolsas. Guardar las placas en la nevera de forma invertida y dentro de las bolsas hasta su uso.

Etapa II [24  –  48 horas antes de la transformación] Rehidratar las bacterias Con una pipeta estéril, rehidratar el liofilizado de E. coli K-12 añadiendo 250 ml de la solución de transformación en el vial. Tapar el vial y dejar la suspensión 5 minutos a temperatura ambiente. Agitar el vial antes de añadirlo a las placas de LB. Guardar la bacteria rehidratada en la nevera hasta el momento de su uso (en 24 horas a ser posible, y no más de 3 días). Sembrar las placas para obtener colonias bacterianas aisladas Tomamos con un asa estéril una muestra de las bacterias ya hidratadas y realizamos la siembra en las placas en forma masivas, con el fin de obtener algunas colonias aisladas, posteriormente se incuban a 37° C [Usarlas 24 36 horas siguientes para la transformación]. Preparar el plásmido pGLO Con una nueva pipeta estéril añadir 250 ml de la solución de transformación en el vial que contiene el plásmido pGLO liofilizado. Si es posible, guardar el ADN rehidratado en la nevera.

Etapa III [antes de la transformación] Preparar alícuotas Añadir 1 ml de la solución de transformación (CaCl2) y 1 ml del caldo LB en los tubos Eppendorf de 2 ml del kit.

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Protocolo final Etiquetar los tubos Eppendorf cerrados, uno como +pGLO  y otro como  – pGLO. Luego abrir los tubos y con una pipeta estéril añadir 250 ml de la solución de transformación (CaCl2), para colocarlos finalmente en hielo. Posteriormente con la ayuda de un asa de siembra estéril coger una colonia de la placa. Abrir el tubo +pGLO e introducir el asa en la solución de transformación. Girar el asa entre los dedos índice y pulgar hasta que la colonia se disperse totalmente en la solución de transformación (sin que queden fragmentos flotantes). Dejar el tubo en la gradilla en hielo. Con otro asa estéril repite la operación con el tubo  – pGLO. Después introducimos una nueva asa estéril en el vial que contiene el plásmido y coger solución plasmídico (como si cogiéramos jabón para hacer pompas de jabón). Llevarlo al tubo +pGLO, cerrarlo y dejar el tubo en la gradilla en el hielo. Cerrar también el tubo  – pGLO, pero sin añadir el plásmido. Incubamos los tubos en hielo 10 minutos. Nos aseguramos de que el fondo de los tubos está en contacto con el hielo. Mientras que los tubos permanecen en el hielo etiquetamos las placas de agar en la base de la siguiente forma: una placa LB/amp  y una LB/amp/ara como +pGLO, y otra LB/amp y otra LB/amp/ara como – pGLO. Luego de la incubación en hielo, realizamos un choque térmico, llevando los tubos en la gradilla al baño ya preparado a 42 ºC, e introducirlos allí durante 50 segundos exactos. Pasados los 50 segundos, llevar de nuevo los tubos al hielo. El cambio de hielo al baño y viceversa debe hacerse con rapidez. Dejar los tubos en el hielo 2 minutos. Posteriormente sacamos la gradilla del hielo y la dejamos en la mesa. Abrimos uno de los tubos, y con una nueva pipeta estéril, añadimos 250 µl de caldo LB al tubo y lo cerramos. Repetimos la operación con otra pipeta estéril en el otro tubo. Incubar los tubos 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente agitamos los tubos golpeándolos con el dedo. Con una pipeta estéril para cada tubo, pasamos 100 µl de cada tubo a las placas correspondientes. Luego Usando un asa de siembra estéril para cada tubo, extender el líquido por toda la superficie de la placa, haciendo

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estrías en el agar en todas las direcciones, por último se llevan las cajas a incubación a 37°C en posición invertida.

RESULTADOS FIGURA 1.

Imagen ilustrativa donde se ve el

etiquetaje de las cajas

con

LB/amp   y una

LB/amp/ara como +pGLO, y otra LB/amp y otra LB/amp/ara como  –pGLO.

FIGURA 2. Imagen ilustrativa donde se observa cómo se alícuota los tubos Eppendorf con la solución transformación. La imagen de la izquierda corresponde a +pGLO, la imagen de la derecha a  –pGLO

FIGURA 3.

Imagen ilustrativa donde se ve

la incubación en hielo de los tubos Eppendorf

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FIGURA 4. Imagen ilustrativa donde se observa cómo se toma la colonia de

E. coli .

(Izquierda) y posteriormente de inocula el tubo Eppendorf (Derecha).

FIGURA 5. Imagen ilustrativa donde se observa la inoculación de pGLO

en la caja de

petrí (Izquierda) y posteriormente la siembra con el asa estéril utilizando la técnica de agotamiento (Derecha).

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FIGURA 6. Imagen ilustrativa donde se realiza la lectura usando el transiluminador. La imagen de la izquierda corresponde al medio LB/amp, la imagen de la derecha al medio

LB/amp/ara. Ambas correspondientes a + pGLO

FIGURA 7. Imagen ilustrativa donde se realiza la lectura usando el transiluminador. La imagen de la izquierda corresponde al medio LB/amp, la imagen de la derecha al medio

LB/amp/ara. Ambas correspondientes a - pGLO

DISCUSIONES Y CONCLUSIONES Destacamos la realización del protocolo completo que propone el Kit de transformación bacteriana con pGLO de BIO-RAD, el cual se baso en tres etapas, de las cuales las dos primeras son llevadas a cabo por el personal del laboratorio y la etapa final se llevo a cabo por los estudiantes. Para poder discutir los resultados los analizaremos en de la siguiente forma: La lectura de las cajas correspondes a + pGLO del medio LB/amp, y al medio LB/amp/ara. Nos muestran una contrariedad, para el primero se esperaba crecimiento bacteriano, pero no la característica de fluorescencia, lo cual es corroborado con nuestros resultados, ya que esta característica dada por el gen GFP es activada en presencia de arabinosa, y este medio la carencia, fenotípicamente se observo el crecimiento con un color crema, algunas colonias aisladas con forma redondeada y bordes lisos.   [1] Para el segundo se esperaba crecimiento bacteriano y fluorescencia, pero en nuestros resultados se observo solo crecimiento bacteriano, la fluorescencia no fue activada, este resultado en si es contradictorio, ya que si la transformación por el plásmido pGLO no

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hubiese sido exitosa no hubiese habido ni crecimiento ni fluorescencia, pero el caso es que E. coli K-12 fue modificada por el gen bla, éste le confirió la capacidad de crecer en un medio con antibiótico ( ampicilina), pero el gen GFP no tuvo éxito, probablemente el manejo de los tiempos en el choque térmico no fueron exactos, lo que no permitió la permeabilidad optima de la membrana celular , también se puede considerar la efectividad del kit de acuerdo al tiempo de uso, ya que se pudo haber degradado la muestra de ADN con el paso del tiempo, y más aún si consideramos las condiciones de conservación ( estas deben ser precisas). La lectura de las cajas correspondes a - pGLO del medio LB/amp, y al medio LB. Para estos resultados podemos decir que son totalmente contradictorios, ya que en la primera caja no debía crecer debido a que el medio tenía ampicilina y como la E. coli que se sembró en ese medio es susceptible a los antibióticos ( López et al., 2009 ) no había forma de que manifestara su crecimiento. Podemos correlacionarlo con aspecto tales como s; el primero es que la bacteria liofilizada que viene en el kitt no es pura, por lo cual manifiesta características no propias, que la ampicilina se ha degradado y ha perdido sus características como antibióticos o finalmente que hubo un error humano y le inoculo con + pGLO  ´estos medios. Para el segundo es el control, lo que me significa que el crecimiento se debe dar de manera normal. Después de considerar los resultados obtenidos, compararlos con los resultados idóneos propuestos en el kit podemos inferir de manera general que: 

Es de vital importancia la concentración de arabinosa agregada al medio para la producción de fluorescencia.



Se debe conservar en óptimas condiciones las cepas bacterianas que contengan pGLO para realizar extracciones y transformaciones exitosas.



La temperatura en el choque térmico es de gran importancia para que se pueda dar la inserción del plásmido correctamente.



Una transformación exitosa dependerá de muchos factores, entre los cuales se encuentra el estado del plásmido, la inserción del mismo

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en las células competentes ya sea por electroporación o choque térmico, entre otras.

CUESTIONARIO PROPUESTO POR EL KIT De revisión 1. ¿En cuál de las placas esperas encontrar bacterias más similares a las colonias de E. coli no transformadas que observaste inicialmente? En los medios que tienen - pGLO, ya que no tiene el plásmido, por lo tanto no hay transformación.

2. Si hay bacterias transformadas, ¿En qué placa(s) aparecerán? En las placas que tienen + pGLO, ya que ese es el plásmido que me transforma la bacteria.

3. ¿Qué placas se deben comparar para determinar si se ha producido transformación genética? ¿ Por qué ¿ Las placas que tienen el plásmido [ +pGLO ] con las que no lo tienen [- pGLO ] Ya que las placas que tienen el plásmido van a expresar las características de los genes insertados como es la luminiscencia y el crecimiento en un medio con antibiótico, frente a las que no tienen el plásmido, porque estas no van a tener luminiscencia y en un medio con presencia de antibióticos no va a haber crecimiento.

4. ¿Qué se entiende por placa control? Placa control es una placa que no se le ha realizado ningún tratamiento o protocolo, esta tipo de placa control sirve para llevar a cabo una revisión y/o comparación de mi tratamiento o protocolo realizado a otras placas frente a unas sin tratamiento con la finalidad de evaluar la eficiencia del tratamiento o protocolo.

Recogida y análisis de resultados A. Observa atentamente y dibuja lo que ves en cada placa. Pon tus dibujos en la tabla de resultados en la columna de la derecha. Apunta los resultados para poder comparar las observaciones de las células +pGLO con las observaciones de las células no transformadas.

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Se observa crecimiento a lo largo de la línea de siembra, lo que representa el total de la caja, el color del crecimiento es blanco, característico de E. coli. No se observan colonias aisladas.

Se observa crecimiento a lo largo de la línea de siembra, la cual esta mucho más definida el color del crecimiento es crema, característico de E. coli. Se observan muy pocas colonias aisladas (15)

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Se observa crecimiento masivo, con un color crema. No se observan colonias aisladas.

Se observa crecimiento masivo, con un color crema. No se observan colonias aisladas.

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B. ¿Qué características inicialmente observadas en E. coli no parecen haberse alterado?

Característica inicial

Observaciones

Se observo una coloración crema en el crecimiento de la bacteria.

Después de la transformación se observa el color del crecimiento bacteriano coincidiendo con un aspecto cremoso.

1. Si las células transformadas han adquirido la capacidad para crecer en presencia del antibiótico ampicilina, ¿qué puedes deducir acerca de los otros genes presentes en el plásmido utilizado para la transformación? Que se han insertado exitosamente en el ADN bacteriano, lo cual significa que se va a expresar la característica de estos.

2. Basándote en los resultados obtenidos, ¿cómo puedes demostrar que los cambios producidos se deben al proceso realizado? Si nos basamos en los resultados habrá mucha contradicción, ya que no hubo luminiscencia, pero si resistencia al antibiótico, usando + pGLO y  –  pGLO. Pero básicamente estos resultados se pueden demostrar comparándolos con la placa control, ya que esta no tiene pGLO.

3. ¿Qué indica esta observación sobre la fuente de fluorescencia? Que el plásmido pGLO tiene un gen ( GFP ) que me confiere esa característica.

4. Describe qué evidencias indican si la transformación genética se ha realizado con éxito o no. Consideramos que las evidencias son: 

El crecimiento de la bacteria en medio con ampicilina

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

La fluorescencia de las bacterias en el transiluminador, dichas bacterias han crecido en medio con arabinosa.

Interacción entre genes y medio 1. ¿Observas alguna colonia de E. coli en la placa LB que no contenga ampicilina y arabinosa? No, solo se ve crecimiento masivo.

2. Basándote en tus resultados, ¿puedes decir si estas bacterias son resistentes a ampicilina observándolas en la placa LB? Como hemos mencionado nuestros resultados fueron contradictorios, pero si somos consecuentes con el protocolo podemos decir que no son resistentes, ya que no son modificadas con el gen que les confiera esa resistencia.,

3. ¿Cómo modificarías el medio (el agar en el que están creciendo) para poder saber si son resistentes a ampicilina? Agregándole ese antibiótico en la composición del mismo

4. Muy a menudo las características de un organismo se deben a la combinación de sus genes y del medio. Reflexiona sobre el color verde que viste en las bacterias transformadas a. ¿Qué dos factores ambientales deben estar presentes para que puedas ver el color verde? El primero hacer referencia a un azúcar, la arabinosa. El segundo hacer referencia a observar las bacterias en el transiluminador ( rayos UV ) b. ¿Cuál de los dos factores ambientales señalados en la pregunta anterior hacen a la bacteria transformada que aparezca verde? Consideramos que es más importante la arabinosa, ya que este azúcar activa el gen GFP, el cual permite ser fluorescentes (verdes) c. ¿Qué ventajas tendrá para un organismo el poder activar o desactivar determinados genes en respuesta a diferentes condiciones?

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La supervivencia en condiciones adversas, o frente a algunos depredadores de éstos. Cálculo de la Tasa de transformación

1. Determinación del número total de colonias verde fluorescente que crecen en la placa LB/amp/ara. Sitúa tu placa LB/amp/ara bajo luz UV. Se supone que cada colonia de la placa procede de una única célula, la cual, tras múltiples y sucesivas reproducciones, origina la colonia bacteriana. La manera más sencilla de determinar el número total de colonias verde fluorescente es contar las colonias presentes en la placa.

Número total de células =

0

2. Determinación de la cantidad total de plásmido pGLO en las células bacterianas y presente en la placa LB/amp/ara. Para determinar la cantidad de ADN del plásmido pGLO que hay en las células bacterianas presentes en la placa LB/amp/ara necesitamos saber : (a) La cantidad de ADN con la que empezamos el experimento, y (b) qué fracción del ADN (en la bacteria) realmente se añadió a las placas de LB/amp/ara. Una vez calculado estos dos factores, tendrás que multiplicar la cantidad total de plásmido pGLO usada en el experimento por la fracción de ADN que aparece en las placas de LB/amp/ara.

(a) Determinación de la cantidad total de plásmido pGLO La cantidad total de ADN utilizada inicialmente es igual al producto de la concentración y el volumen utilizados: ADN (mg) = Concentración ADN (mg/ml) x Volumen ADN (ml) En este experimento utilizaste 10 ml de pGLO a la concentración de 0.08 mg/ml. Es decir, que cada microlitro de la solución contenía 0.08 mg del ADN plasmídico pGLO .

Calcula la cantidad total de ADN utilizada:

0,8 µg

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¿Para qué te sirve este dato? Para calcular la cantidad de ADN plasmídico que hay en las células bacterianas.

(b) Determinación de la fracción de ADN realmente transferido a la placa de LB/amp/ara. Dado que no todo el ADN añadido al cultivo bacteriano pasa a la placa de agar, necesitas saber cuánto ADN pasó realmente a la placa LB/amp/ara. Para calcularlo, divide el volumen de ADN que pusiste en la placa entre el volumen total que había en el tubo que contenía el ADN. La fórmula a utilizar sería: Fracción ADN utilizada = Volumen en la placa (µl) / Volumen total tubo (µl) Pasaste 100 µl de la solución de células que contenían el ADN, de un tubo con un volumen total de 510 µl. ¿Recuerdas por qué contenía 510 µl? Consulta el protocolo, anota los volúmenes que añadiste en cada paso y suma las cantidades. Usa la siguiente fórmula para calcular la fracción de ADN plasmídico pGLO que pasó a la placa LB/amp/ara.

Fracción de ADN =

0.196

¿Para qué te sirve este dato? Para calcular la cantidad de ADN plasmídico que hay en las células bacterianas. Por tanto, ¿cuántos microgramos de ADN del plásmido pGLO pasaste a las placas LB/amp/ara? Para contestar esta pregunta, debes multiplicar la cantidad total de ADN pGLO usada por la  fracción de ADN pGLO que pasó a la placa de LB/amp/ara: ADN pGLO transferido (µg) = cantidad total de ADN pGLO usada (µg) x fracción de ADN pGLO

ADN pGLO (µg) =

0.1568

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¿Qué te dice este dato? Mira todos los cálculos hechos hasta ahora, y rellena la siguiente tabla: Este dato nos dice que hay o.1568

µg de ADN del plásmido en las células bacte rianas

0

0.1568

Ahora usa los datos de la tabla para calcular la tasa de transformación: Tasa de transformación = Nº total de células que crecen en la placa / Cantidad de ADN (mg) en la placa

Tasa de

0

Transformación =

Análisis La tasa de transformación es un número muy elevado, por lo que los científicos a menudo lo expresan en forma logarítmica. Por ejemplo, si la tasa de transformación es de 1.000 bacterias/mg de ADN, lo expresan así: 103 células transformadas/mg (10  3 es como 10 x 10x 10, o como 1.000)

· ¿Cómo expresarían 10.000 células transformadas/µg? 104 células transformadas/µg Complicándolo un poco más, imagina que los científicos calculan una tasa de 5.000 bacterias/µg ADN.

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Lo expresarían como:

5 x 103 células transformadas/mg (5 veces 1.000). · ¿Cómo expresarían 40.000 células transformadas/µg? 4 * 10 4 células transformadas/µg Un último ejemplo: Si se calculara una tasa de 2.600 células transformadas/µg, la notación científica sería: 2,6 x 103 células transformadas/µg (2,6 veces 1000) De la misma forma que en los siguientes ejemplos: 5.600 = 5,6 x 103 271.000 = 2,71 x 105 2.420.000 = 2,42 x 106 · ¿Cómo expresarías 960.000 células transformadas/µg en notación científica? 9,6 * 105 células transformadas/µg

-

Expresa la tasa de transformación obtenida en notación científica: 0 células transformadas/µg

-

Explica en una o dos frases lo que significa la tasa de transformación que has calculado:

La tasa de transformación es un número, que representa el número total de células bacterianas que expresan la proteína GFP, entre la cantidad de ADN usada en el experimento. Nos indica el número total de células bacterianas transformadas por microgramo de ADN. Los biotecnólogos estiman que la tasa de transformación que generalmente se obtiene con el protocolo que tú has seguido se sitúa entre 8 x 102 y 7 x 103 células transformadas por microgramo de ADN. · ¿Cómo es tu tasa en comparación con estos valores? Nuestra tasa de transformación es nula ( 0 )

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· En la siguiente tabla, anota la tasa de transformación de los demás grupos del laboratorio:

2B

0 células transformadas/µg

3B

0 células transformadas/µg

4B

0 células

transformadas/

· ¿Cómo es tu tasa de transformación en comparación con la de los demás? Igual · Calcula la tasa de transformación que se obtendría en un experimento en el que se utilizara lo indicado en la siguiente lista: Concentración ADN plasmídico: 0.08 μg/μl 250 μl solución transformación CaCl2 10 μl solución plasmídico pGLO 250 μl caldo LB 100 μl células sembradas en cada p laca de agar

227 colonias de células transformadas

La tasa de transformación es 1418,75o 1,42 * 10 3 células transformadas/µg

Rellena el siguiente cuadro y enséñale tus resultados al profesor:

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0

0.1568

0 células transformadas/µg

· Pregunta extra: Si la tasa de transformación en un determinado experimento es de 3 x 103 bacterias/μg de ADN,

¿cuántas colonias de células transformadas crecerían en la placa LB/amp/ara? Asume que las concentraciones de ADN y el volumen de células sembradas en la placa de LB son las mismas que utilizaste en tu protocolo. Se obtendrían 470,4 ≈ 470 colonias.

CUESTINARIO PROPUESTO EN LA GUIA 1. ¿Puedo modificar genéticamente un organismo? ¿Qué organismo? Un organismo genéticamente modificado es un ser vivo cuyo material genético ha sido alterado usando técnicas de ingeniería genética. Actualmente los OGM incluyen bacterias, levaduras, algas, plantas, peces, reptiles y mamíferos. El avance de las investigaciones en ingeniería genética y las tecnologías que derivaron de ella, han permitido el desarrollo de organismos, vegetales y animales a los que se les ha modificado en parte su código genético, y que pueden ser utilizados tanto en la investigación, la alimentación, la industria, la medicina como en otros campos. En la evolución de estos métodos se llega hasta la hibridización interespecífica, es decir la reproducción entre especies diferentes pero fitogenéticamente cercanas, aunque en la naturaleza este intercambio de

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material genético se ve entorpecido por diferentes tipos de barreras biológicas o físicas. Con la aplicación de las técnicas de la ingeniería genética se ha cruzado esta barrera entre especies, provocando cambios no sólo en el área biológica (nuevas especies, insectos, mamíferos, peces, cultivos y otros), científica (nuevos desarrollos tecnológicos) y ambiental (agua, suelo, aire, degradación por uso intensivo de los recursos, nuevos agroquímicos), sino también en el aparato productivo de un país (monocultivo, sistema de siembra directa, mayor tecnificación del agro y la consecuente reducción de mano de obra rural, concentración económica), el comercio internacional (empresas multinacionales oligopólicas, patentes y regalías), la política y la sociedad. 2.

Desde hace dos décadas se ha observado la introducción de semillas, productos alimentarios o con fines farmacéuticos de origen transgénico, obtenidos a través de la biotecnología. Para modificar genéticamente un organismo, se debe insertar un nuevo gen en cada célula del organismo ¿qué organismo será más apropiado para ser modificado genéticamente, uno pluricelular o uno unicelular?

Organismo pluricelular están compuestos por varios trillones de células (pluricelulares) y tienen alrededor de 21,000 genes en sus 23 pares de cromosomas en cada una de sus células. Tenemos alrededor de cien mil proteínas diferentes codificadas por estos genes para llevar a cabo la mayoría de nuestras funciones biológicas. Las bacterias, organismos compuestos por una sola célula (unicelulares) tienen un solo cromosoma con alrededor de 4,000 genes que codifican para 4,000 proteínas con las que viven y funcionan estos organismos (Avery et al. 1944, Watson y Crick 1953, Watson et al. 1988 y 1996, Bolívar 2007, Hayden 2011). Por lo que se consideraría conveniente un organismo unicelular pues su manejo puede tener un mayor control sobre sus modificaciones y codificaciones de estos mismos. 3. Los científicos a menudo quieren saber si los organismos modificados genéticamente pueden pasar sus nuevas características a su descendencia y futuras generaciones. Para obtener esta información ¿Qué organismo será más apropiado para el experimentó? ¿uno que

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crezca y se reproduzca rápidamente, o uno que lo haga más lentamente? Las propiedades celulares no tienen por qué ser constantes a lo largo del desarrollo de un organismo: evidentemente, el patrón de expresión de los genes varía en respuesta a estímulos externos, además de factores endógenos. Un aspecto importante a controlar es la pluripotencialidad, característica de algunas células que les permite dirigir su desarrollo hacia un abanico de posibles tipos celulares. En  metazoos, la genética subyacente a la determinación del destino de una célula consiste en la expresión de determinados factores de transcripción específicos del linaje celular al cual va a pertenecer, así como a modificaciones epigenética. Además, la introducción de otro tipo de factores de transcripción mediante ingeniería genética en células somáticas basta para inducir la mencionada pluripotencialidad, luego este es uno de sus fundamentos moleculares. 4. La seguridad es otro factor importante al elegir el organismo ¿Qué características debe tener o no tener el organismo para asegurarnos de que no nos dañara ni a nosotros ni al medio ambiente? Características de flujo génico, de introgresión del gen novedoso y resultados de la expresión, de conferir alguna ventaja competitiva. Cada GM y su inocuidad deben ser evaluados individualmente, y que no es posible hacer afirmaciones generales sobre la inocuidad de todos los GM, la prevención de escape y diseminación durante su manejo. Los riesgos específicos corresponden a las recombinaciones genéticas que podían conferir a las bacterias una nueva resistencia a los antibióticos, un nuevo poder patógeno, incluso un poder cancerígeno (por clonación del ADN de virus cancerígenos). El

uso de este tipo de tecnología conlleva tanto beneficios como riesgos, en el caso de los primeros, a través de un uso responsable y sustentable del patrimonio genético y los segundos, por la característica de irreversibilidad de estas tecnologías. El Principio de Precaución en cuestiones de nuevas tecnologías y sus posibles impactos ambientales tiene en cuenta: lo atinente a la protección del ambiente, previniendo daños a los ecosistemas y los intereses de las futuras generaciones, Si bien la biotecnología responsable puede ofrecer grandes beneficios, las autoridades de regulación y control, responsables de la evaluación de los

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procedimientos deben actuar eficazmente en el mejoramiento y la bioseguridad de los productos y sus derivados. 5. Teniendo en cuenta las cuestiones anteriores ¿cuál será la mejor opción para realizar la modificación genética: una bacteria, una lombriz, un pez, o un ratón? En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse estos plásmidos para compartir sus genes beneficiosos o ventajosos. Este mecanismo permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. El reciente incremento de la resistencia bacteriana se debe a la transmisión de plásmidos. Los objetivos que se persiguen son: utilizarlos para la expresión de genes que permitan la producción de proteínas foráneas de interés farmacéutico, los que serían tratados como fármacos con controles estrictos. En otros casos, lo que se busca es aumentar la eficiencia en producción animal, como los peces con hormona de crecimiento. El caso de los organismos acuáticos es delicado, ya que si se escapan al ambiente el efecto sería prácticamente irreversible, por lo que el riesgo potencial es alto ya que los animales son sumamente caros y requieren un alto nivel de control y cuidados. Ratones genéticamente modificados se utilizan a menudo para estudiar las respuestas celulares y tejidos específicos a la enfermedad. Esto es posible puesto que los ratones pueden ser creados con las mismas mutaciones que se producen en los trastornos genéticos humanos, la producción de la enfermedad humana en estos ratones a continuación, permite tratamientos a ensayar. 6. ¿Qué son las células electrocompetentes? La transformación bacteriana es un proceso natural, en el que las bacterias ingieren ADN extraño y luego amplifican o clonarlo. En el laboratorio, este proceso puede ser inducida artificialmente, mediante el uso de pulsos de campo eléctrico de alto voltaje para crear poros en la membrana de la célula bacteriana, a través del cual puede pasar el ADN plásmido. La electroporación se refiere a este método. La electroporación hace uso de un dispositivo especializado llamado un electroporador. Normalmente las células se colocan en una cubeta de electroporación, que tiene

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electrodos en cada lado que hacen contacto eléctrico con la máquina una vez insertado. Las células bacterianas mezcladas con ADN se cargan en la cubeta de electroporación y un campo eléctrico en el orden de un 1,000 a 10,000 volts por centímetro se aplica durante unos milisegundos. Esto hace que el voltaje a través de la membrana para llegar a 0,5-1 voltios, que se cree que dar lugar a un reordenamiento de la bicapa de fosfolípido que comprende la membrana celular de tal manera que se forman poros. En este ADN plásmido estado pasará a través de la membrana y cuando pulsante se complete la bicapa se repararse a sí mismo. Habiendo asumido el plásmido, las bacterias entonces pueden crecer en placas de Agar que contienen antibióticos. Una alternativa a la electroporación es la transformación de choque térmico, que se basa en la exposición de las bacterias a tanto cloruro de calcio y el calor con el fin de introducir ADN en las células. En general, los de choque térmico es más suave en la bacteria de la electroporación y no requiere baja en sal. Reacciones de ligación, los que implican la inserción de su gen diana en el plásmido, se pueden utilizar directamente en la transformación de choque térmico. Transformación de choque térmico es más barato que la electroporación y no se basa en equipos o cubetas caras. Por otro lado, choque térmico conduce a menores eficacias de transformación que electroporación y toma más tiempo. También está limitado a bacterias, levaduras y protoplastos de la planta, mientras que la electroporación se puede aplicar a células de mamífero. Aquí puede ver fibroblastos embrionarios de ratón que se cargan en una cubeta de electroporación. Una vez que la electroporación es completa, eficacias de transformación se pueden determinar mediante la observación de la medida en que las células producen una proteína de fluorescencia verde codificada por el plásmido. La transfección es el término dado a la transformación de células de mamífero, que requiere típicamente más bajas intensidades de campo que las células bacterianas y mayores constantes de tiempo. La electroporación también se puede realizar en animales enteros como el embrión de pollo en desarrollo que ver aquí. El ADN del plásmido se inyecta en el cerebro del polluelo y luego una sonda de electroporación se utiliza para aplicar un campo eléctrico para el tejido cerebral. Después de un día o dos, proteínas fluorescentes verdes y rojos - codificada por el plásmido - se hacen por las neuronas, y los científicos pueden observar los cambios estructurales en el desarrollo del cerebro de pollo.

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7. ¿Cuáles son las ventajas de la electroporacion comparada con la trasformación con calcio. Uno de los métodos más baratos (y fiables) es la transfección mediante fosfato de calcio, originalmente descubierta por F. L. Graham y A. J. van der Eb en 1973. Una solución salina tamponada con HEPES y que contiene iones fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el DNA a transfectar. Cuando ambas se combinan, se forma un precipitado fino formado por el calcio cargado positivamente y el fosfato cargado negativamente, que el DNA en su superficie. Esta suspensión se añade a las células que se quieren transfectar (normalmente un cultivo celular en monocapa). Mediante un proceso no comprendido completamente, las células toman parte del precipitado, y  junto con él, el DNA. En biología molecular, el proceso de electroporación se usa habitualmente para la transformación de bacterias, levaduras yprotoplastos vegetales. Además de membranas lipídicas, las bacterias también tienen una  pared celular compuesta de peptidoglicano y sus derivados. Sin embargo, las paredes son porosas por naturaleza y sólo actúan como corazas que protegen a la célula de impactos ambientales severos. Si se mezclan bacterias y plásmidos,  éstos pueden transferirse al interior de las células durante la electroporación. En este proceso suelen emplearse varios cientos de voltios,  que atraviesan una distancia de varios milímetros. A continuación, las células deben manipularse cuidadosamente hasta que tengan la oportunidad de dividirse,  produciendo nuevas células que contendrán copias del plásmido. Este proceso es aproximadamente diez veces más eficaz que la transformación por métodos químicos.

Referencias [1] Kit de transformación bacteriana con el plásmido pGLO   (ADN fingerprint), bio-rad, Biotechnology Explorer™. Puerta, C y Ureña, C. 2002. Prácticas de biología molecular. Editorial Pontificia Universidad Javeriana. Colombia. 55p.

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Segal, A y Ortega, G. 2005. Manual de prácticas de biología molecular de la célula I. Las prensas de ciencias. México. 85p. Enlaces web: 

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