Practica 7 Reactivos Comerciales

INSTIT INSTITUTO UTO POLIT POLIT CNICO CNICO NACION NACIONAL AL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO LABORATORIO DE SISTEMAS DE CONTROL DE CALIDAD PROFESORES:

ALUMNO: PRÁCTICA 7 “EFECTO Y VERIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SUSTR ATO EN REACTIVOS COMERCIALES”

GRUPO 5QM1 SECCIÓN 3

FECHA DE ENTREGA: 08  – Mayo  – 2018

Introducción Las enzimas son catalizadores biológicos que disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, de forma que se aceleran sustancialmente la tasa de reacción. En una reacción catalizada por un enzima: La sustancia sobre la que actúa la enzima (sustrato), se une a una región concreta de la enzima (sitio activo), un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato, el grupo de aminoácidos que se encuentra en el sitio activo, así como la posición que estos tienen en el espacio tridimensional, le dan al sitio activo un tamaño, forma y comportamiento químico muy específicos. Gracias a estos aminoácidos, el sitio activo de una enzima es apto de modo exclusivo para unirse con una molécula objetivo en particular -el sustrato o sustratos de la enzima- y le ayudan a experimentar una reacción química. La cinética enzimática se encarga del estudio de la velocidad de reacciones catalizadas enzimáticamente. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima depende de 1. La concentración de moléculas de sustrato [S]. 2. La temperatura. 3. La presencia de inhibidores. 4. pH del medio, que afecta a la conformación (estructura espacial) de la molécula enzimática. Medida de actividad enzimática Los métodos más comunes de valoración de enzimas son: a) Volumétricos, cuando en la reacción enzimática se consume o se produce un producto gaseoso. b) Colorimétricos, cuando el producto formado es coloreado o da color en una reacción posterior (por ejemplo en la valoración de la fosfatasa alcalina). c) Espectrofotométricos, para aquellas reacciones enzimáticas que utilizan NAD (P) o NAD (P)H como coenzimas. d) Radiométricos, utilizando un sustrato marcado radiactivamente.

Objetivos  

Realizar la verificación de un kit comercial mediante el estudio de la actividad enzimática para calcular la concentración de sustrato a partir de la Km Establecer un criterio de aceptación o rechazo.

Fundamento  Al estudiar la actividad enzimática se observa la velocidad de reacción que se ve afectada por diversos factores entre ellos la cantidad de sustrato en la muestra. Para identificar si un kit comercial cumple con las concentraciones de sustrato requeridas para llevar a cabo la totalidad de la reacción la concentración de sustrato debe ser superior a 10 veces la Km (afinidad de enzima por sustrato).

Método

Inicio

Clocar 2 ml de sustrato (tubo 1) Con solución reguladora

Realizar diluciones seriadas 1:2 a 1:512

Agregar 20 µl de suero c/u

Comenzar a contar tiempo

Fin Mezclar Repetir Verter en celda Analizar CUMPLE Si

No cumple

Ajustar al aire a 405 nm Registrar en manual

Tomarvlecturas cada min.

No 10 veces menor a S

Si La lectura es constante?

No Calcular Km

Realizar gráficas

Continuar hasta los 5 min.

Calcular deltas

De ar de leer

Bitácora de resultados Fecha: 07/05/2018 EFECTO Y VERIFICACI N DE LA CONCENTRACI N DE SUSTRATO EN REACTIVOS COMERCIALES

Resultados y observaciones:

Tabla 1. Obtención de los resultados de incrementos de absorbancias por minuto. Tiempo(min) Sin dilución (1:2) (1:4) (1:8) A A A A Δ Δ Δ Δ 1 0.442 0.702 0.192 0.173 2 0.493 0.051 0.859 0.152 0.216 0.024 0.2 0.027 3 0.545 0.052 1.019 0.115 0.239 0.023 0.23 0.03 4 0.595 0.050 1.169 0.150 0.262 0.023 0.257 0.007 5 0.643 0.048 1.323 0.154 0.286 0.024 0.281 0.024 6 0.690 0.047 1.475 0.152 0.307 0.022 0.309 0.028 ∑ΔA 0.248 0.723 0.116 0.116 0.0496 0.1446 0.0232 0.0232 XΔA

(1:16) A Δ 0.045 0.051 0.006 0.057 0.006 0.064 0.007 0.07 0.006 0.076 0.006 0.031 0.0062

Tabla 2. Obtención de los resultados de incrementos de absorbancias por minuto (continuación). Tiempo(min) (1:32) (1:64) (1:128) (1:256) (1:512) Δ Δ Δ Δ Δ A A A A A 1 0.098 0.112 0.09 0.085 0,024 2 0.106 0.008 0.112 0 0.092 0.002 0.086 0.001 0.024 0 3 0.114 0.008 0.112 0.003 0.095 0.003 0-086 0 0.024 0 4 0.124 0.01 0.115 0.003 0.096 0.001 0.086 0 0.024 0 5 0.13 0.006 0.118 0.003 0.1 0.004 0.086 0 0.024 0 6 0.141 0.011 0.121 0.003 0.102 0.002 0.086 0 0.024 0 0.143 0.012 0.012 0.001 0 ∑ΔA XΔA 0.0086 0.0024 0.0024 0.0005 0 Determinación: Actividad enzimática de la fosfatasa alcalina Concentración del sustrato: 10 mM/L

Longitud de onda seleccionada: 405 nm Factor: 2760 UI/L

Tabla 3. Actividad enzimática. Sección 3. Dilución Media Concentración de sustrato (mmoles/L)

Actividad enzimática (UI/L)

1/(sustrato)

1/Actividad enzimática

Sin dilución

0.0496

10.000 mmol/L

397 UI/L

0.10

0.0072

1:2

0.1446

5.000 mmol/L

137 UI/L

0.20

0.0025

1:4

0.0232

2.500 mmol/L

64 UI/L

0.40

0.0156

1:8

0.0232

1.250 mmol/L

75 UI/L

0.80

0.013

1:16

0.0062

0.625 mmol/L

17 UI/L

1.60

0.058

1:32

0.0086

0.312 mmol/L

20 UI/L

3.21

0.049

1:64

0.0024

0.156 mmol/L

7 UI/L

6.41

0.142

1:128

0.0024

0.078 mmol/L

6 UI/L

12.82

0.1509

1:256

0.0005

0.039 mmol/L

2.38 UI/L

25.64

0.7246

1:512

0

0.019 mmol/L

0 UI/L

52.63

0

Tabla 4. Actividad enzimática. Sección 4. Dilución

Concentración de sustrato (mmoles/L)

Actividad enzimática (UI/L)

1/(sustrato)

1/Actividad enzimática

1:2

5.000 mmol/L

79 UI/L

0.20

0.0126

1:4

2.500 mmol/L

76 UI/L

0.40

0.0131

1:8

1.250 mmol/L

57 UI/L

0.80

0.0175

1:16

0.625 mmol/L

19 UI/L

1.60

0.0526

1:32

0.312 mmol/L

20 UI/L

3.21

0.05

1:64

0.156 mmol/L

10 UI/L

6.41

0.1

1:128

0.078 mmol/L

2 UI/L

12.82

0.5

1:256

0.039 mmol/L

8.28 UI/L

25.64

0.120

1:512

0.019 mmol/L

0.92 UI/L

52.63

1.086

Cálculos realizados :   ̅∆   =

∑  

  ̅∆   =

.+.+.+.8+.7 

= 0.0496 para concentración sin dilución.



[ ] =

1/[Sustrato]=

[ ] =

  

 

1/Act. Enzimática=

= 0.40

 

µ 

= 2.5

= 0.0156

Grafico de Absorbancia por dilución 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1    a    i 1    c    n 0.9    a     b    r 0.8    o 0.7    s     b 0.6    A 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Sin dilución 2 4 8 16 32 64 128 0

1

2

3 Tiempo

Grafica 1. Absorbancia por dilución (sección 3)

4

5

6

256 512

Grafica 2. Grafica de Michaelis-Menten V máxima = 397

V máx. /2. = 198.5

Km = 6.2

Gráfica de Lineweaber-Burk.

y = 0.0258x - 0.0172 R² = 0.9159

0.8 0.75 0.7 0.65 0.6    a 0.55    c    i    t 0.5    a 0.45    m    i    z 0.4    n    e 0.35     d 0.3    a     d    i 0.25    v    i 0.2    t    c 0.15    A     / 0.1    1 0.05 0 -0.05 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 -0.1 -0.15 1/concentracion de sustrato

Grafica 3. Gráfica de Lineweaber-Burk.

Unidades: mmoles r 2: 0.9159

Ecuación de la recta: y= 0.0258x + 0.0172 Calculo de la Km=  = =

 −.

− .7

− .7

.8

.8

 =  =

= -0.666

= 1.50

Km= 1.50 Concentración del sustrato

Sustrato P-nitrofenil fosfato

10mmol

Obtención de la Km Teórica

Grafico interpolación

Gráfico Lineweaber-Burk

4.48

6.2

1.50

Interpretación de resultados Verificación del kit comercial: Identificación de puntos críticos del procedimiento:    

Realizar las diluciones. Utilizar un blanco para ajustar. Tiempo correcto. Colocar suero.

Acciones correctivas que realizar:    

Hacer las diluciones adecuadamente. Ajustar con el blanco adecuado. Leer la absorbancia en el tiempo que corresponde. Colocar la cantidad de suero adecuada.

Acciones preventivas:    

Tener el material limpio, seco, en buen estado y completo. Revisar que los aparatos e instrumentos estén calibrados y en condiciones apropiadas para realizar el trabajo. Revisar la fecha de caducidad de los reactivos Utilizar micropipetas y adicionar el suero con cuidado y mezclar bien.



Bitácora

Fecha: 08/05/2018

Discusión Se obtuvo la cinética enzimática de la fosfatasa alcalina mediante diluciones de un sustrato (gráfica 1) en la cual se puede observar que a mayor concentración hay mayor actividad enzimática y disminuye a medida que se incrementan las diluciones. En la dilución 1:512 la actividad enzimática es de cero (ya no hay actividad enzimática). Esto nos permite saber que es necesario contar con una concentración de sustrato adecuada para poder llevar a cabo la reacción. Se realizó la gráfica de Michaelis-Menten con la actividad enzimática obtenida y la concentración de sustrato, para obtener la Km (concentración a la cual se tiene un medio de la velocidad máxima) el resultado fue de 6.2, este resultado no es muy confiable ya que solo es una interpolación de los datos y depende mucho del ajuste de la escala. Se realizó una gráfica de Lineweaver-Burk o doble reciproco en la cual se obtuvo la ecuación de la recta para calcular la Km. Para poder verificar si el kit cumple con la concentración adecuada de sustrato (el valor de Km debe ser 10 veces menor a la concentración de sustrato), esto indicaría que la reacción se está llevando a cabo completamente. Se obtuvo un valor de Km de 1.50. Para el Km calculado mediante interpolación la concentración del kit debería de ser de 62 mM aproximadamente y para el caso en que se calculó mediante el grafico de dobles recíprocos debería de ser una concentración de 15 mM aproximadamente. La concentración real del kit es de 10 mM por lo cual vemos que en ningún caso se cumple el requisito. Aunque hay una gran diferencia entre ambos resultados, podemos decir que el grafico de Lineweaver-Burk se aproxima más al valor real y es más confiable. Puede ser que las diluciones no se hayan llevado a cabo adecuadamente o que el tiempo de medición de la absorbancia no fuera el correcto. Existen muchas fuentes de errores ya que la valoración de este kit se realizó grupalmente. Lo ideal es que un solo analista haga la valoración del kit para no sumar más errores en el resultado final.

La fosfatasa alcalina es una enzima hidrolasa, responsable de eliminar grupos de fosfatos de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides. El proceso de eliminar el grupo fosfático se denomina desfosforilación. Estas enzimas proceden de la ruptura normal de las células sanguíneas y de otros tejidos, muchas de ellas no tienen un papel metabólico en el plasma excepto las enzimas relacionadas con la coagulación y con el sistema del complemento. En la práctica se realizaron diversas diluciones de la fosfatasa alcalina (tabla 1 y 2) y (grafica 1 y 2) para la serie A y B respectivamente, en ellas se puede observar que a mayor concentración hay mayor actividad enzimática, por lo tanto disminuye cuando se aumenta la dilución. En nuestra dilución 1:512 nuestra actividad enzimática fue nula con lo cual es muy importante contar con la cantidad de sustrato adecuada para poder llevar a cabo la reacción.  A partir del cálculo de la actividad enzimática se realizaron los gráficos de Michaelis-Menten (grafica 3) para poder determinar la Km, la representación gráfica de la ecuación de Michaelis  – Menten es una hipérbola en la cual la velocidad máxima corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental y la Km corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima, nuestro valor obtenido fue de 1.8,

sin embargo este valor no es del todo confiable por ello se realizó el grafico de Lineweaver  – Burk o de dobles recíprocos en la cual obtuvimos la ecuación de la recta con la que se pudo determinar el valor de Km. Para verificar que el kit cumpliera con la concentración adecuada de sustrato el valor de Km debe ser 10 veces menor a la concentración de sustrato para poder garantizar que la reacción de lleva a cabo completamente. La concentración del kit debería de ser de 10mM aprox. Y el valor es de 11, por lo que no se cumple con los requisitos. Esto puede deberse a que no se tomó el tiempo de forma correcta, no se mezcló adecuadamente e incluso no se tomó un volumen adecuado.

Conclusiones    

Al diluir la concentración de enzima la actividad enzimática es menor. El valor de Km en la gráfica de Michaelis - Menten es de 6.2 En la gráfica de Lineweaver  – Burk el valor de Km es de 1.50 Las Km obtenidas por diferente gráfico son 6.2 y 1.5 y la concentración real del kit es de 10 mM por lo que no cumplen con el requisito de concentración 10 veces mayor que Km para que se lleve a cabo la reacción por comleto.

Pregunta extra

Referencias.  

Gonzalez de Butrago J. M., Técnicas y métodos de laboratorio clínico, 2ª ed., Ed. Masson. Barcelona España. 2005. Las enzimas y el sitio activo (© 2018 Khan Academy) Disponible en: https://es.khanacademy.org/science/biology/energy-and-enzymes/introduction-toenzymes/a/enzymes-and-the-active-site2514 consulta (05/2018)