Practica #6 Regulacion

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

HIPÓTESIS Se sabe que E. coli   es capaz de utilizar lactosa como fuente de carbono y energía. Su enzima β-galactosidasa responsable del metabolismo, se sintetiza más rápido en presencia de lactosa y con una concentración pequeña de glucosa (1). Si ponemos a crecer E. coli   en un medio con glicerol y después de un tiempo agregamos lactosa podremos ver una inducción en la síntesis de β-galactosidasa, en cambio si a esta misma después de un tiempo y la lactosa se le adiciona glucosa se esperara provocar un efecto represor en la síntesis .

DISEÑO EXPERIMENTAL. a) Obtención de cultivo Para el desarrollo de la práctica se obtuvo un cultivo de Escherichia coli  en   en un matraz que contenía 50 ml de medio de cultivo adicionado de glicerol para una concentración final de 0.5%. El cultivo se incubo a 37 oC en agitación durante 18 horas, se adicionó con glicerol y se utilizó posteriormente para la determinación la actividad de la β-galactosidasa. β -galactosidasa.

Del cultivo anterior se inocularon con 10ml dos matraces Erlenmeyer que contenían 200 ml del mismo medio sintético, uno adicionado de glicerol para observar la actividad basal de la cepa con una concentración final de 0.5 % y otro de lactosa con una concentración final del 1% se incubaron a 37 oC en agitación durante 6 horas. Las células se cosecharon por centrifugación, se lavaron dos veces con regulador de fosfatos y el paquete celular se resuspendió en regulador. La lactosa adicionada permitió la inducción de la síntesis de la β galactosidasa al ser transformada en alolactosa por la misma enzima que se encuentra en niveles basales y esta alolactosa actuará a manera de inductor para la expresión de los genes contenidos en el operón lac. b ) Determinación de la actividad de la β -galactosidasa Cada una de las dos suspensiones de células obtenidas, se ajustó a 1.0 de absorbencia a 600 nm para igualar concentraciones y a 10ml de cada suspensión se le agrego 1 ml de tolueno. El tolueno solubiliza la membrana de la célula ayudando a la permeabilidad y liberación de la β -galactosidasa al medio, se agito en vortex para homogenizar y se colocó en baño de hielo. Posteriormente en una celda espectrofotométrica se colocó 3.8 ml de regulador de fosfatos, 0.1 ml de ONPG (ortonitro fenil galactopiranósido) y 0.1 ml de la suspensión celular, se agitó y se leyó inmediatamente a 420 nm. Las lecturas se registraron desde el tiempo cero y cada minuto durante 10 minutos.

El ONPG es un sustrato de la β -galactosidasa que al ser hidrolizado produce un compuesto (ortonitrofenol) que presenta un intenso color amarillo con el que se puede medir la concentración de β-galactosidasa en función de la intensidad del color. El tolueno ayuda al contacto de la β-galactosidasa β -galactosidasa y el ONPG. El aparato se ajustó a cero de absorbancia con una celda que contenía solamente 3.9 ml de regulador de fosfatos y 0.1 ml de ONPG.

BIOQUÍMICA MICROBIANA

1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

c) Velocidad de ind ucc ión y represión catabólica Se inoculó con 20 ml de cultivo de 18 horas (inciso a) a un matraz Erlenmeyer que contenía 200 ml de medio sintético adicionado de glicerol y fueron incubados a 37 oC en agitación durante 3 horas. Durante el inicio del experimento se retiró una alícuota de 10 ml (tiempo 0) y se adicionó al cultivo que quedaba en el matraz un volumen de lactosa estéril para una concentración final de 1.2 % para producir la inducción de los genes contenidos en el operón lac, ya que la alolactosa reconocería su sitio de afinidad en la proteína represora ubicada sobre la región promotora del operador ocasionando la perdida de afinidad por la región promotora dejándola libre para ser reconocida por la RNA polimerasa y llevar a cabo la síntesis (expresión) de los genes estructurales del operón, entre ellos a la β- galactosidasa, dicha expresión de estos genes irá aumentando en función del tiempo teniendo así un aumento en la cantidad de dicha enzima en las células. Se incubó a 37 oC en agitación y se siguió retirando alícuotas de 10 ml a los 2.5, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos para observar la actividad.

Cuando se retiró la alícuota al tiempo 30 se adiciono el volumen de glucosa lo cual produjo el fenómeno de represión catabólica gracias a que la glucosa al ser un mejor sustrato como fuente de carbono y pasar directamente hacia glicólisis sin necesidad de invertir enzimas como es el caso de la lactosa para producir glucosa y galactosa, entonces las enzimas involucradas en su catabolismo (lactosa) serán reprimidas para evitar gastos energéticos innecesarios en la célula y se retiraron las alícuotas de los tiempos 35, 40 y 50 minutos. Todas las alícuotas tomadas se reciben en tubos cónicos de polipropileno para centrífuga que contenían 0.1 ml de cloranfenicol. Después de que se retiró la última alícuota se centrifuga a 3000 rpm/10 min, se lavan las células con regulador de fosfatos y posteriormente se ajusta a 1.0 ml de absorbancia a 600 nm. Se trataron con tolueno y posteriorment e se midió la actividad de la β -galactosidasa conforme fue descrito en el inciso (b) efectuando dos lecturas de absorbencia, una a los 0 minutos y otra a los 10 minutos de incubación. La determinación de la cantidad de β -galactosidasa durante la adición de lactosa y posteriormente con glucosa se determinó de igual forma que en el inciso (b) es decir que la β-galactosidasa actuaría sobre el sustrato ONPG el cual como se observa en la siguiente figura al ser hidrolizado por la enzima libera galactosa y libero el o-nitro-fenol, compuesto de color amarillo, la intensidad de color será directamente proporcional a la cantidad de β galactosidasa sintetizada a durante el experimento. Para tener una idea de la cantidad contenida en cada alícuota de los diferentes tiempos los tubos cónicos estuvieron adicionados con cloranfenicol, un antibiótico que inhibe la síntesis de proteínas bloqueando la actividad de la enzima peptidil transferasa al unirse a la subunidad 50S del ribosoma, evitando la formación del enlace peptídico deteniendo así la síntesis de proteínas y por lo tanto de la β -galactosidasa, en cuanto al tolueno este es nuevamente utilizado para la perforación de las células y la liberació n de la β-galactosidasa.

BIOQUÍMICA MICROBIANA

2

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

3

Figura 1.- Hidrólisis del ONPG por acción de la β-galactosidasa y la liberación del o-nitro-fenol, de coloración amarilla

OBJETIVOS.  Analizar y discutir la actividad de la β -galactosidasa en Escherichia coli , a partir de suspensiones de células crecidas en glicerol y lactosa con y sin tolueno.   Demostrar el papel de la lactosa sobre la inducción del operón lactosa en Escherichia coli . Demostrar el papel de la glucosa sobre la represión del operón lactosa en Escherichia coli .







REGISTRO DE DATOS Tabla 1.- Actividad de la β-galactosidasa en

E. coli 

Suspensión de la células de E. coli crecidas en: Lactosa Tiempo de incubación

Glicerol

Con Tolueno

ΔAbs

Sin tolueno

Glicerol

Lactosa ΔAbs Con Tolueno

ΔAbs Sin tolueno

0 0.12 0.215 0.33 0.438 0.533 0.622 0.71

0 0.033 0.048 0.066 0.085 0.106 0.119 0.145

Absorbencia a 420 nm 0 1 2 3 4 5 6 7

0.299 0.296 0.295 0.299 0.305 0.307 0.312 0.315

0.336 0.456 0.551 0.666 0.774 0.869 0.958 1.046

0.334 0.367 0.382 0.400 0.419 0.440 0.453 0.479

0 0 0 0 0.006 0.008 0.013 0.016

BIOQUÍMICA MICROBIANA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

0.318 0.324 0.328

8 9 10

1.128 1.202 1.272

0.501 0.518 0.537

0.019 0.025 0.029

0.792 0.866 0.936

0.167 0.184 0.203

Grafica 1.- Actividad de la β-galactosidasa en E. coli  1

4

0.8    m    n    0 0.6    2    4    a    a    i 0.4    c    n    a     b    r 0.2    o    s     b    A

ΔAbs Glicerol Δabs Lactosa Con Tolueno ΔAbs Lactosa Sin Tolueno

0 0

2

4

-0.2

6

8

10

12

Tiempo (min)

Tabla 2.- Abs obtenidas en la determinación de la a velocidad de inducción y represión catabólica de β- galactosidasa en E.coli

Tiempo de incubación 0 10 20 30

35 40 50 60

Determinación de la actividad de la βgalactosidasa

Abs. a 420 nm

ΔAbs

t0'

t10'

(t0'-t10')

0.119 0.147 0.215 0.265 0.179 0.161 0.149 0.152

0.097 0.155 0.323 0.513 0.600 0.438 0.447 0.424

0.022 0.008 0.108 0.348 0.421 0.277 0.298 0.272

√ 

0.1483 0.0894 0.3285 0.5899 0.6488 0.5263 0.5458 0.5215

BIOQUÍMICA MICROBIANA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Grafica 2.- Cinética de Induccion y Represion catabólica de βgalactosidasa en E. coli  0.7    m0.6    n    0 0.5    2    4    a 0.4    a    i    c    n 0.3    a     b    r 0.2    o    s     b    A0.1

Δ Abs

Series2

0 0

10

20

30

40

50

60

70

Tiempo (min)

DISCUSIÓN DE RESULTADOS En la grafica1 se observa el comportamiento de la β-galactosidasa en un cultivo de el cual se hizo crecer en 2 medios diferentes, uno con lactosa y otro con Escherichia coli glicerol, a los cuales se les realizo un tratamiento con tolueno. Se observó que el cultivo crecido en lactosa que se trató con tolueno presento una alta actividad de la enzima βgalactosidasa, mientras que el medio crecido en glicerol también presento una pequeña cantidad de la enzima que se encuentra en estado basal, en cuanto al medio crecido en lactosa al cual no se le realizo un tratamiento con tolueno presento una actividad del 20% (comprando las pendientes ) con respecto al que se le realizo el tratamiento con tolueno, quedando demostrado su efectividad para su uso como un medio que facilita la permeabilidad de las membranas celulares. Con lo dicho anteriormente comprobamos quela enzima β-galactosidasa que es sintetizada por el operon lactosa es inducible cuando en el medio de crecimiento se encuentra presente la lactosa, y en caso de no estar presente solo se sintetizara la enzima β -galactosidasa en su estado basal. En la gráfica 2 (cinética de inducción y represión catabólica) notamos que al adicionar la lactosa la enzima β-galactosidasa no se sintetizara inmediatamente, esta requerirá de un tiempo de adaptación el cual al observar la gráfica fue de 10 minutos, tras los cuales la síntesis y actividad dela enzima fue aumentando, al cabo de 30 minutos se adiciono glucosa, observando también que tardo 5 minustos en detener la síntesis de β -galactosidasa, después de este tiempo se observó una disminución de la actividad enzimática para después estabilizarse ya que la enzima nunca se reprimirá totalmente. Con lo anterior comprobamos que la glucosa es un represor catabólico del operon lactosa debido a que Escherichia coli en el operon lactosa se presenta cuando la proteína CRP se encuentra en forma de dímero y solo es activa cuando lleva unido AMPc para poder sintetizar la enzima βgalactosidasa. El alto contenido de AMPc es debido a que en ausencia de transporte de

BIOQUÍMICA MICROBIANA

5

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

glucosa al interior celular se aumenta la actividad de la adelinato ciclasa (enzima encargada de la síntesis de AMPc) y empieza a consumir lactosa para poder obtener energía para su metabolismo. Por lo tanto, sin CRP o sin AMPc el sistema permanecería cerrado. Esto unido al hecho de que la glucosa disminuía los niveles de AMPc daba la explicación por la cual la glucosa ejercía una represión por catabolito.

CONCLUSIONES 



Se comprobó experimentalmente la actividad de la β -galactosidasa en Escherichia coli , a partir de suspensiones de células crecidas en diferentes medios, dando como resultado la mayor actividad al medio con lactosa toluenizada, y menor en el de glicerol, esto indica que existe la síntesis de β-galactosidasa, el operón lactosa también está sujeto a un control de tipo positivo, de manera que existe una proteína que estimula la transcripción de los genes estructurales. Se demostró que la lactosa es un inductor del operón lactosa y la glucosa es un represor en Escherichia coli . Se trata. por tanto de un sistema general de control positivo que se denomina represión catabólica  . Cuando E. coli crece en un medio con glucosa, los niveles de AMPc son muy bajos y como consecuencia no se transcriben los operones de otros azúcares.

.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA



“BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGÍA” Smith y Wood. Editorial Addison-Wesley

Iberoamericana. Universiada Panamericana México. pp 112-132.



http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Operon/Operon.htm

BIOQUÍMICA MICROBIANA

6