Practica 6 Preparacion de Piruvato

 

Laboratorio De Bioquímica II 

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Práctica No. 6 “Producción de Piruvato y Acetaldehído a Partir de Glucosa y Determinar su Presencia (Levaduras) ”  Universidad Autónoma de Ciudad Juárez  – Instituto de Ciencias Biomédicas Licenciatura en Química  – Laboratorio de Bioquímica II Gabriela Guadalupe González González

OBJETIVO:

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Determinar la presencia de piruvato por la fermentación de la glucosa por levadura.

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INTRODUCCIÓN: La fermentación es la primera etapa del catabolismo de glucosa es la producción de piruvato. Este proceso, que se efectúa mediante una serie de reacciones que involucran un número considerable de intermediarios, se conoce como glucólisis. La reacción total de una molécula de glucosa produce dos moléculas de piruvato, dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH. Este cofactor se encuentra en cantidades catalíticas (es necesario reoxidarlo para que el proceso no se suspenda), y es utilizado por la cadena respiratoria para obtener ATP dando así NAD+. Esto no es posible en condiciones anaeróbicas y en este caso la reoxidación se efectúa cuando el piruvato se convierte en acetaldehído, y luego en alcohol [1] Los intermediarios metabólicos son metabolitos como el piruvato y acetaldehído se encuentran presentes normalmente en muy baja concentración, por lo tanto, para demostrar su existencia como intermediarios en el camino metabólico, es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Este procedimiento se usa mucho para estudiar caminos metabólicos y se puede realizar:

  Bloqueando la enzima que cataliza la conversión del compuesto que se esta investigando mediante inhibidores.   Cambiando las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad máxima.

Usando un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse. La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitroprusiato de sodio o 2,4 dinitrofenilhidrazina [2].

METODOLOGÍA: En dos tubos de ensaye se colocaron 5 mL de glucosa, al tubo 1 se le agregaron 5 mL de levadura con Na2HPO4 (alcalina) y al tubo 2 se le agregaron 5 mL de levadura con KH 2PO4  (ácida). Se pusieron a baño maría a 37°C durante 1 hr más 2 mL de ac. tricloroácetico, se mezclaron y se centrifugaron por 10 min a 2500 rpm. Se tomaron 2 mL de sobrenadante sobrenadant e del tubo de cada tubo y se colocaron en otros tubos y se les agrego 1 gr de sulfato de amonio, se mezclaron y se le agrego por las paredes amoniaco concentrado, se observaron los resultados. Se tomaron 2 mL de sobrenadante del tubo de cada tubo y se colocaron en otros tubos con 1 mL de fenilhidrazina, se mezclaron y se le añadió 1 mL de NaOH, se diluyeron hasta obtener 5 mL con agua, se observaron los l os resultados.

Gabriela Guadalupe González González | 91325

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RESULTADOS: Se pudo observar que en el tubo 1 se formaron dos fases con un anillo en la superficie de la muestra, en el tubo 2 se observo la formación de un anillo de color rojo en la muestra.

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La presencia del piruvato se encuentra en muy bajas concentraciones, por lo cual se recomienda recurrir a este tipo de técnicas para comprobar su presencia.

BIBLIOGRAFÍA:  

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[1]  http://es.scribd.com/doc/49000859/BioquimicaPractica-Plummer-Chp10a 

  http://books.google.com.mx/books?id=GXKf  6ibU5gUC&pg=PA511&lpg=PA511&dq=por  que+se+forman+tioles+en+la+produccion+ de+piruvato+y+acetaldehido&source=bl&ot s=BKiUjVSNsU&sig=HK72vYq4W6vD5YIX nzbQAGKGR5Q&hl=es&sa=X&ei=bbtwT6 WdDqWe2AWDq6TjDg&sqi=2&ved=0CCM Q6AEwAQ#v=onepage&q=porque%20se% 20forman%20tioles%20en%20la%20produc cion%20de%20piruvato%20y%20acetaldeh ido&f=false   ido&f=false

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Imagen 1. Observación de la producción de piruvato.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN: Para determinar la presencia de piruvato mediante nitroprusiato de sodio, se pudo observar la formación de interfaces y de un anillo lo cual indico la presencia de grupos tioles en donde se observa en coloración azul o verdosa la reacción del piruvato como se puede observar en el primer tubo, en el segundo tubo se pudo observar la formación de un aro color rojo lo cual indica que si hay presencia de piruvato  ya se utilizo un agente que atrapo el intermediario y este formó for mó un compuesto que no pudo metabolizarse. La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitroprusiato de sodio o 2,4 dinitrofenilhidrazina formando un anillo de color rojo en la superficie, lo cual indica que la prueba fue positiva. Gabriela Guadalupe González González | 91325

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