Practica 6 Cinetica Enzimatica.

Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo 4 Medicina Veterinaria Zootecnista Reporte de práctica#6: Medición de la actividad enzimática. Cinética de la enzima ureasa.

Equipo #2:

Ciriaco Solano Lina Elizabeth Cruz Márquez Salvador  González Buendía María del Carmen Luna de Alba Antonio Vallejo Martínez Silvia Laboratorio Bioquímica

Profesores: Q.F.B. Juana Alicia Alquiciara Camacho M.V.Z. Francisco Javier Cervantes Aguilar  M.V.Z. Silvia Leticia Bonilla Orozco

Grupo: 2201

Fecha de entrega: 9 abril 2013

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INDICE

PÁGINA

Resumen………………………………………………………………………. 3

Introducción/Marco teórico………………………………………………….. 4

Objetivos………………………………………………………………………. 7

Material y Metodología……………………………………………………….8

Resultados……………………………………………………………………. 10

Discusión……………………………………………………………………… 14

Conclusión……………………………………………………………………. 14

Referencias…………………………………………………………………… 15

2

RESUMEN El pasado 2 de abril cumpliendo con el protocolo esta blecido por el “Manual de Practicas de Bioquímica para la Carrera de MVZ”, llevamos a cabo la Practica número 6, correspondiente a la “Cinética de la Enzima Ureasa”.

Bajo la supervisión de nuestro Profesor, elaboramos la experimentación estipulada, con un manejo adecuado del material que el laboratorio nos proporcionó. La práctica estaba comprendida por varios experimentos y debido a la complejidad y el tiempo que se requiere para elaborarlos, el Profesor decidió asignar un experimento diferente a cada equipo. El equipo numero 1 realizo el experimento número uno que corresponde a la determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (en este caso urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa, cabe destacar que este experimento es muy importante pues de ellos dependía el análisis de los mas resultados que posteriormente se explicaran en este trabajo. En nuestro equipo, es decir el equipo número 2, realizamos el experimento número dos, que correspondía a la determinación del efecto de la variación en la concentración de enzima (ureasa) sobre la velocidad de reacción de la misma, con un establecimiento adecuado del experimento logramos cumplir con dicha determinación, aunque los valores que se arrojaron fueron poco comunes, más adelante abundaremos en ellos.  Al equipo 3 le toco llevar a cabo el experimento número tres, que correspondía a la determinación del efecto de la variación de la temperatura sobre la velocidad de la reacción de la ureasa. El equipo 4 se encargó de la determinación del efecto de la variación del pH del medio sobre la velocidad de reacción de la ureasa. Habiendo realizado cada equipo su experimento, se obtuvieron resultados los cuales presentamos en el pizarrón a través de unas tablas que mostraremos en los resultados. Cumpliendo con los objetivos de la práctica y habiendo obtenido los resultados de los experimentos cada equipo anoto los resultados de los demás equipos para completar y complementar la practica en su totalidad. Fue así que el pasado 2 de abril concluimos la práctica número 6, a continuación expondremos el marco teórico y todo lo que engloba a dicha práctica.

3

INTRODUCCION/ MARCO TEORICO: ENZIMAS Las son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reacción. Actúan en condiciones muy suaves, a temperatura por debajo de 70°C,con un PH de +7.Tienen un alto Grado De Especificidad, solamente catalizan la reacción en que participa un sustrato o un grupo de sustratos con ciertas características químicas y geométricas comunes. Sustrato: es una molécula sobre la que actúa una enzima. El sustrato se une al sitio activo de la enzima, y se forma un complejo transformado en enzima-sustrato. El sustrato por acción de la enzima es producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro sustrato.

ESPECIFICIDAD, SITIO ACTIVO Y GRUPOS CATALÍTICOS. Las enzimas se unen a los sustratos por medio de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals. Los residuos de aminoácidos de la enzima que participan en la interacción con el sustrato están alejados unos de otros; pero como resultado de la unión del plegamiento de la proteína, se agrupan para formar el sitio activo de la enzima. Algunos residuos participan solo en la unión del sustrato y definen una región del sitio activo que se llama sitio de fijación o de unión de los sustratos. Los catalíticos (residuos), se encargan dela transformación del sustrato en producto. Normalmente, el número de residuos que intervienen en la unión del sustrato es mayor que el de residuos catalíticos. Debido al plegamiento de la proteína, su localización se encuentra en los surcos o huecos de la superficie de la enzima.

INHIBICIÓN Los inhibidores son moléculas que interactúan con la enzima y disminuye su actividad catalítica. Tienen gran importancia desde un punto de vista médico, debido a que un buen porcentaje de los medicamentos trabajan como inhibidores 4

de alguna actividad enzimática. Su importancia industrial radica en su uso como pesticidas e insecticidas. Dentro del campo de la investigación, como herramientas que se usan para indagar el orden de los componentes de una vía metabólica o una estructura y el mecanismo de reacción de una enzima. Conviene pensar en los inhibidores como herramientas poderosas de gran utilidad y no como moléculas que estorban en un ensayo enzimático.

INHIBICIÓN COMPETITIVA La característica más importante de este tipo de inhibición es que el sustrato y el inhibidor son mutuamente excluyentes. Generalmente, se encuentra que el inhibidor es una molécula con estructura similar a la del sustrato. Sin embargo también se puede dar el caso de que el inhibidor sea estructuralmente diferente al sustrato y que, al interactuar con otro sitio diferente de la enzima, induzca un cambio conformacional que modifique el sitio para el sustrato.

INHIBICIÓN NO COMPETITIVA Es un tipo de Inhibición que reduce la tasa máxima de una reacción química (Vmax) sin cambiar la afinidad aparente de unión del catalizador por el sustrato. La inhibición no competitiva normalmente se aplica a enzimas, y difiere de la inhibición competitiva en que el inhibidor siempre se une a la enzima por un sitio diferente al centro activo de la enzima. Esto afecta a la tasa de la reacción catalizada por la enzima ya que la presencia del inhibidor produce un cambio en la estructura y la forma de la enzima. En este tipo de inhibición, no hay competición entre en inhibidor y el sustrato, así que incrementar la concentración del sustrato no produce un aumento de la tasa de actividad enzimática.

INHIBICIÓN ACOMPETITIVA En la inhibición acompetitiva, el inhibidor sólo se une al complejo enzima ± sustrato, y no a la enzima libre. La adicción de más sustrato a la reacción da lugar  a un aumento de la velocidad de reacción, pero no hasta el grado que se observa en las reacciones sin inhibir. La inhibición acompetitiva suele observarse en las reacciones en las que las enzimas unen más de un sustrato.

INHIBICIÓN IRREVERSIBLE Los inhibidores irreversibles normalmente se unen covalentemente a la enzima,con frecuencia a una cadena lateral del lugar activo.

EFECTO DEL pH.

5

El pH no afecta la actividad enzimática directamente sino que modifica la concentración de protones. Los protones además de alterar la estructura de la enzima y el sustrato, pueden participar también en la reacción como sustrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta directamente la velocidad de la reacción. Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son proteínas, puede alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las propiedades catalíticas de una enzima.  A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación. La concentración de ion hidrógeno afecta a las enzimas de diversas formas. En primer lugar la actividad catalítica está relacionada con el estado iónico del lugar activo. Las variaciones de la concentración de ion hidrógeno pueden afectar a la ionización de los grupos de lugar activo .En segundo lugar, los cambios de los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Los cambios drásticos del pH frecuentemente conducen a la desnaturalización. La mayoría de las enzimas son activas dentro de un intervalo estrecho de PH. Por esta razón. Los seres vivos emplean amortiguadores para regular  estrechamente el pH. El valor de pH al que la actividad de una enzima es máxima se denomina pH óptimo, y varía considerablemente según la enzima.

EFECTO DE LA TEMPERATURA. Cuando se estudia la velocidad de una reacción química en función de la temperatura, y en ausencia de una enzima, se observa un incremento de la velocidad conforme se aumenta la temperatura. Se debe a dos razones:  A) Al incremento en el número de choques por unidad de tiempo, debido al aumento en la energía cinética de las moléculas con la temperatura. B) Al aumento en el número de moléculas con la energía de activación adecuada para que el choque entre los reactivos sea productivo.

6

OBJETIVOS: 



Determinar los diversos factores que influyen en la actividad de las enzimas y la manera en la que pueden ser observados y medidos en el laboratorio, tomando como ejemplo a la ureasa producida por el frijol de soya. Determinará la influencia del inhibidor bicloruro de mercurio (HgCl 2) en la reacción catalizada por la ureasa.

OBJETIVOS PARTICULARES:

 

Confirmar la habilidad y conocimientos de la titulacion en esta practica gracias a las prscticas anteriores. Implemetar y aprender a manejar graficas para el analisis de resultados.

7

Material y Metodología.

Material y equipo.          

6 tubos de ensaye grandes 3 pipetas (1,5 y 10 mL) 2 matraces Erlenmeyer de 250 mL 1bureta de 50 m L 1 soporte universal 1 pinzas de bureta 1 propipeta Gradilla para tubos de ensaye Vortex Baño Maria

Reactivos y soluciones.     

Urea 0.25 M Amortiguador de fosfatos 0.05 M, pH 7.2. Bicloruro de mercurio al 1% Ácido clorhídrico 0.1 N. Rojo de metilo al 0.04%.

Muestra biológica 

Extracto de Ureasa proveniente de frijol de soya.

8

METODOLOGIA . Montaje adecuado

1-Para la

2-Se agregaron

titulación se

3-En caso de

de experimento y

dos gotas de

midieron 5mL

obtener

preparación de los

rojo de metilo y

coloración

reactivos así como

del tubo 6

se observo la

amarilla

la elaboración de

(blanco) y se

coloración.

vertieron en un

proceda a

mezclas en cada tubo

matraz de 125

titular con

acido

mL.

clorhídrico.

En el experimento

En el experimento

Se realizo esto

4- Se titulo 5 m

3, se preparo los

2 se realizo la

para cada

L de cada uno

tubos y se realizo

titulación de cada

experimento

de los 5 tubos

la titulación.

tubo así como el

partiendo del

restantes.

Midiendo como

cálculo de VTC,

punto numero

afecta la

como se indica.

2.

temperatura la

Viendo como

velocidad de

afecta la

reacción,

concentración de ureasa

En el experimento 4, se continuo con

Se recojio y limpio el material usado

la titulación de

Se Tabularon los

cada tubo

resultados.

midiendo como el

pH afecta la velocidad de reacción de la

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RESULTADOS OBTENIDOS DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION EN LA CONCENTRACION DE SUSTRATO (UREA) SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA UREASA.

TUBO

µM de urea inicial en cada tubo

mL de HCL 0.1 N

VTC

µM de Urea hidrolizada

1

10 M

1.4 ml

-0.2ml

1.2 X 50

60

2

20 M

1.2 ml

-0.2ml

1.0 X 50

50

3

40 M

1.3 ml

-0.2ml

1.1 X 50

55

4

100 M

1.0 ml

-0.2ml

0.8 X 50

40

5

150 M

0.4 ml

-0.2ml

0.2 X 50

10

70

60

10, 60 40, 55

50

20, 50

40

100, 40

30

20

10

150, 10

0 0

20

40

60

80

100

120

140

160

10

DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION EN L A CONCENTRACION DE ENZIMA (UREASA) SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA MISMA

TUBO 1 2 3 4 5

mL de enzima inicial en cada tubo

0.1 ml 0.3 ml 0.5 ml 0.7 ml 0.9 ml

µM de Urea hidrolizada

mL de HCL 0.1 N

VTC

0.4 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.6 ml 0.7 ml

0.2 X 50 0.3 X 50 0.3 X 50 0.4. X 50 0.5 X 50

-0.2ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml

10 15 15 20 25

1 0.9

25, 0.9

0.8 0.7

20, 0.7

0.6 0.5

15, 0.5

0.4 0.3

15, 0.3

0.2 0.1

10, 0.1

0 0

5

10

15

20

25

30

11

DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA UREASA

TUBO

TEMPERATURA

1 2 3 4

0.1C 0.3 C 0.5 C 0.7 C

µM de Urea hidrolizada

mL de HCL 0.1 N

VTC

0.3 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.3 ml

0.1 X 50 0.2 X 50 0.2 X 50 0.1. X 50

-0.2ml -0.2ml -0.2ml -0.2ml

5 10 10 5

12

10

0.3, 10

0.5, 10

8

6 0.1, 5

0.7, 5

4

2

0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

12

DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION DEL PH DEL MEDIO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA UREASA.

TUBO 1 2 3 4 5

TEMPERATURA

VTC

µM de Urea hidrolizada

3.0 5.0 7.0 8.5 10

0.2 1.8 1.4

10 90 70

100 90

8.5, 90

80 70

10, 70

60 50 40 30 20 10

7, 10

0 0

2

4

6

8

10

12

13

DISCUSION En la práctica realizada se utilizaron varios factores para demostrar la actividad enzimática, en éste caso de la ureasa, en cuando a los resultados obtenidos podemos decir que: En la determinación del efecto de la variación de sustrato (urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa, la grafica obtenida adquiere esa forma debido a que en cada uno de los tubos fue aumentando la [S], entonces, al principio la grafica va ascendiendo, pero llega un punto en el que ésta se vuelve constante, esto es porque, a esa altura la enzima se ve saturada, tomando en cuenta de que las variables [E], T° y pH se encuentran constantes . En el caso de la determinación del efecto de la variación en la concentración de enzima (ureasa) sobre la velocidad de reacción de la misma, se fue agregando a cada tubo una cantidad mayor de [E], teniendo como resultado una grafica ascendente, esto debido a que la enzima no se satura y sigue formando producto, en ésta caso tuvimos contantes [S], pH y T°. En cuanto a la determinación del efecto de la variación de la T° y pH sobre la velocidad de reacción de la ureasa, la grafica que se obtuvo fue una campana de Gauss, esto se debe a que la enzima va actuar a determinada temperatura y determinado pH, aquí las constantes fueron [E] y [S].

CONCLUSIÓN Los objetivos planteados al principio de la práctica se llevaron acabo, ya que pudimos obtener los resultados del comportamiento de la ureasa con las diferentes variaciones y poder observar mediante las graficas el comportamiento de la enzima y poder comprender el fundamento. También se obtuvieron resultados de inhibidor utilizado que fue Bicloruro de Mercurio HgCl2 comprendiendo su acción sobre la enzima.

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Bibliografía Laguna J. Y Piña,E,1992.Bioquimica.Salvat.Mexico Lehniger A., 1993. “Principios de Bioquimica”. 2da edición. Ed. Manual Moderno. México Pacheco Leal 2012. “Bioquímica Medica”, 1ra edición. Limusa. México.

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