Práctica 5 “Extracción y Análisis de Lípidos en La Yema de Huevo”

Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Práctica 5 “Extracción y análisis de lípidos en la yema de huevo”

Equipo 10 Grupo 2401 Laboratorio de Bioquímica Celular y de los Tejidos I Fecha de entrega: 28/Marzo/2016

Objetivos  

Analizar las propiedades de los lípidos. Extraer los lípidos de la yema de huevo.  Cuantificar fosfatos de lípidos fosforilados y no fosforilados.

 Analizar la importancia biológica de los lípidos presentes en la yema de huevo. Resultados Tabla 1. Datos curva estándar # de Tubo

Blanco

Solución problema de lípidos (mL) Solución patrón de fosfatos (mL) H2O destilada Reactivo 1 Reactivo 2 Concentración fósforo (mg) Absorbancia a 640 nm

Lípidos

Acido (Fosforilados) Básico (Fosforilados) Acido (No Fosforilados) Básico (No Fosforilados)

Concentración (μg)

L.F acido 1

N.F básico 1

N.F acido 1

1

2

3

4

5

-

L.F basico 1

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

0.2

0.6

1.0

2.0

3.0

10 0.4 0.2 0.00

10 0.4 0.2

10 0.4 0.2

10 0.4 0.2

10 0.4 0.2

10 0.4 0.2

10 0.4 0.2

10 0.4 0.2

10 0.4 0.2

10 0.4 0.2

Absorbancia a 615nm

0 2 6 10 20 30 14,10526316

0 0,033 0,048 0,115 0,189 0,292 0,139

14,10526316

0,139

6,842105263

0,07

7,894736842

0,08

Curva Estandar Fosforo 0.35 0.3 f(x) = 0.01x + 0 R² = 0.99

0.25

Absorbancia a 615nm Linear (Absorbancia a 615nm)

0.2 Absorbancia

0.15

Linear (Absorbancia a 615nm)

0.14

0.1

Muestra problema

0.08 0.07

0.05 0 0

5

10

15

20

25

30

35

Concentración (μg)

Calculo para la concentración de fosforo en lípidos fosforilados y no fosforilados. x= Concentración de fosforo

x=

y−b m

Concentración de Lípidos fosforo (μg) Acido (Fosforilados) 14,10526316 Básico (Fosforilados) 14,10526316 Acido (No Fosforilados) 6,842105263 Básico (No Fosforilados) 7,894736842 Lípidos fosforilados en medio acido

0.139−0.005 =14,10526316 0.0095

Absorbancia a 615nm 0,139 0,139 0,07 0,08

Lípidos fosforilados en medio básico

0.139−0.005 =14,10526316 0.0095 Lípidos no fosforilados en medio acido

0.07−0.005 =6,842105263 0.0095 Lípidos no fosforilados en medio básico

0.08−0.005 =7,894736842 0.0095 Factor de corrección para la concentración de lípidos en la yema de huevo Lípidos fosforilados en medio acido

14,10526316 μg =0,282105263 μg 50 ml ml Lípidos fosforilados en medio básico

14,10526316 μg =0,282105263 μg 50 ml ml

Lípidos no fosforilados en medio acido

6,842105263 μg =0,136842105 μg 50 ml ml Lípidos no fosforilados en medio básico

7,894736842 μg =0,157894737 μg 50 ml ml Porcentaje de fosfato en el fosfatomonopotásico

0.4394 g

( 10001 gmg )=439.4 mg

439.4 mg =0.4394 mg 1000 ml ml Multiplicado por el factor de dilución

0.4394 mg∗1 ml

10

=0.04394 mg ml

Si el la masa de fosfatomonopotásico es de 136g y esto corresponde al 100% entonces los 31g que pertenecientes al fosforo dentro de esta molécula equivalen a:

136 g KH 2 P 04−−−−−−−100

31 gP−−−−−−−−−−22.79 Si 0.04394mg/ml equivalen al 100% el 22.79% es:

0.04394 mg KH 2 PO 4−−−−100 ml

0.01 mg P−−−−−−−−22.79 ml

Multiplicando el valor obtenido por el volumen de las alícuotas se obtiene. Volumen de alícuota (ml)

0.2

Producto entre el volumen y el factor de corrección.

0.2 ml∗0.01 mg

Concentración de fosforo (mg)

Concentración de fosforo en μg

0.002

2

0.006

6

0.01

10

0.02

20

0.03

30

ml

0.6

0.6∗0.01 mg ml

1

1∗0.01 mg ml

2

2∗0.01 mg ml

3

3∗0.01 mg ml

Concentración de

Absorbancia a

lípidos del patrón (μg) 615nm x 0 2 6 10 20 30

y 0 0,033 0,048 0,115 0,189 0,292

y=mx +b

m=

b=

n Σxy−ΣxΣy 2 2 nΣ x −( Σx )

ΣyΣ x 2−ΣxΣxy n Σ x 2− ( Σx )2

Σ x=68

Σy=0,677 Σ x 2=1440 Σxy=¿ 14.044

x promedio=11,33333333 y promedio=0,112833333

m=

b=

6 ( 14.044 )−0.677∗68 =9.518924303 x 1 0−3 2 6∗1440−68

0,677∗1440−68∗14.044 =4.952191235 x 1 0−3 2 6∗1440−(68)

Absorbancia (y)

y-y promedio 0 0,033 0,048 0,115

-0,112833333 -0,079833333 -0,064833333 0,002166667

2

( y− ypromedio)

0,012731361 0,006373361 0,004203361 4,69444E-06

0,189 0,292

0,076166667 0,179166667

Σ( y− ypromedio)2=¿ 0,06121483 y promedio=0,112833333

√

Σ ( y− ypromedio)2 S= n−1

S=

√

0,06121483 =0.1106479402 6−1

CV =

S 0.1106479402 = =0.9806316707 ypromedio 0,112833333

Calculo coeficiente de correlación

r=

σxy σx∗σy

σxy=

σx=

σy=

√ √

Σxi∗ yi −xpromedio∗ypromedio n Σx i 2 −( xpromedio)2 n Σ yi 2 −( ypromedio)2 n

x promedio=11,33333333

y promedio=0,112833333 Σ x 2=1440 Σxy=¿ 14.044

Σ y 2=0.137603

0,005801361 0,032100694

σxy=

σy=

σx=

r=

14.044 −11,33333333∗0,112833333=1.061888893 6

√ √

0.137603 −(0,112833333)2 =0.1010072883 6 1440 2 −( 11,33333333 ) =10.56198635 6

1.061888893 =0.9953613302 0.1010072883∗10.56198635

r 2=0.9907441776

Análisis de Resultados La presente curva estándar se realizó con seis valores de absorbancia y concentración respectivamente, de los puntos generados por estos valores, solo dos puntos concuerdan con la línea de tendencia, a pesar de esto los demás puntos están muy próximos a la línea de tendencia, por lo cual se pretende dar por buena esta curva, ya que lo observado es 2 respaldado por los cálculos estadísticos, pues se obtiene un valor de r muy próximo a uno, este fue de 0.9907 lo cual es un valor bastante aceptable, además que los valores de concentración de la muestra problema caen dentro de la curva estándar. Se obtuvieron cuatro valores, dos para los fosforilados uno en medio básico y otro medio acido, así como de los no fosforilados de los cuales al igual que en los fosforilados se tenían básicos y ácidos. Para el caso de los fosforilados tanto acido como básicos se obtuvo un mismo valor de absorbancia (0.139), lo cual no indica que no necesariamente se debe tener un determinado pH para realizar la lectura pues al parecer este no afecta en nada. Para el caso de los no fosforilados lo ideal sería tener una absorbancia igual a cero pues no se esperaba hallar lípidos fosforilados, debido a que durante la separación de fosforilados y no fosforilados, algunos lípidos fosforilados pudieron colarse con los no fosforilados, apareciendo así como impurezas y por lo tanto haciéndose presentes en la curva estándar. A pesar de esto la concentración de estos fue menor a la de los fosforilados. Tal vez se debió esperar un poco más durante el baño de hielo, para dar oportunidad a que la mayor cantidad de lípidos fosforilados precipitaran y estos no se fueran junto con los no fosforilados al decantar.

Conclusiones Gracias a la oxidación de la materia orgánica, seguida de la formación del complejo fosfomolibdato, se pudo cuantificar la cantidad de lípidos fosforilados y no fosforilados contenidos en la yema de huevo, pues el color del complejo nos permitió medir la

absorbancia en cada muestra. Al extrapolar los datos obtenidos en las muestras problema dentro de la curva estándar, fue posible conocer la concentración real de lípidos en la muestra.

Bibliografía Aguilar-Santelises L, García-del Valle A, Corona-Ortega MT, et al. Antología del laboratorio de Bioquímica Celular y de los tejidos I (complemento). Material en CD e impreso México: FES Zaragoza; 2007.