PRÁCTICA # 5- Extracción e identificación de Glicósidos antracénicos�

 PRÁCTICA # 5: Extracción e identificación de Glicósidos antracénicos Jose David Mateus (151426); Sebastián David Romero (125244) Laboratorio de Fitoquìmica, Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia Bogotá - Colombia, 24 Junio de 2015.

OBJETIVOS ●   General:   Realiz Realizar ar la extrac extracció ción n de los posibl posibles es alcalo alcaloide idess que que se encuen encuentre tren n angustifolia)  y extracto de Yagé presen presentes tes en extrac extracto to de hojas hojas de Sen ( Cassia angustifolia) (Banisteropsis caapi) ●   Específico: 1. Deter Determin minar ar la presen presencia cia de glico glicosid sidos os antra antracen cenico icoss a partir partir de un prueba prueba de reconocimiento utilizando la reacción de Borntrager-Kraus 2. Realiza Realizarr una cromatog cromatografía rafía en capa delgad delgada a (CCD) utilizan utilizando do como revelado revelador  r  una solución de KOH:EtOH (10%) como prueba de confirmación

MARCO TEÓRICO 1. Glicosid Glicosidos os antracéni antracénicos cos Los glicosidos antracénicos son un grupo de productos naturales poco distribuidos en la naturaleza que derivan del antraceno y que biosinteticamente se originan de la ruta del malonilCoA y vía del Ácido shikimico + ácdio mevalonico. La mayoria de estos compuestos se encuentran en forma de quinonas naturales, las cuales tienen efecto de laxion y regulador del tono intestinal y se emplean como laxante o catartico en el tratamiento del (1). estreñimiento (1). Los compuestos antraquinonicos son frecuentes en especies de las familias Rhamnaceae (cáscara sagrada, frangula, Rhamnus spp), Polygonaceae (ruibarbo), Rubiaceae (Rubia tinctoria), Leguminaceae (hojas y frutos de sen), Liliaceae (aloe o sábila) y tambien han sido aislados de líquenes y hongos (1). (1). Las antraquinonas y otros derivados del antraceno como antrona, antranol, antraquinona, oxantrona, diantrona o diantranol existen en las plantas en forma hidroxilada (en los carbonos 1 y 8 principalmente), carboxilada o metilada (principalmente en el carbono 3), libre como agliconas o azucarados como glucosidos, lo cual genera un enorme numero de compuestos como el crisofanol, emodina, aloe emodina, reina, senedina, senosidos, entre (1). otros (1).

Fig. 1. Estructura del antraceno (2)

Fig. 2. Enumeración de los carbonos en la antraquinona(3)

2. Identificación Las antraquinonas y sus formas reducidas pueden reconocerse en muestras vegetales a traves del denominado ensayo de Borntranger-Kraus. En este ensayo, la porcion del extracto vegetal se pone en ebullicion con una solución de H2SO4 (50%) y H2O2 (20%). Posteriormente se pone en ebullicion con una solucion de NaOH. El principio de este método radica en la hidrolisis del glicosido antracénico hasta generar las formas tautoméras de la antraquinona. Las porciones tratadas con estos reactivos son separados mediante una mezcla de solventes organicos formando sales de antraquinona en presencia de soluciones alcalinas que adquieren una coloración roja (Ver Fig. 4.) (4). 3. Hojas de sen Comercialmente se conocen el "Sen de  Alejandría", el cual corresponde a la especie Cassia senna (Leguminosae); el "Sen de Tinnevelly o de la India" el cual corresponde a Cassia angustifolia (Leguminosae); y otras especies como C. acutifolia y C. obovata. La droga la constituyen las hojas y frutos desecados (3).

Fig. 3. Núcleos básicos de compuestos antracénicos (3)

Fig. 4. Determinación colorimétrica de glicosidos antracenicos a partir de la reaccion de Borntrager-Kraus (4)

Los componentes de las hojas son glicósidos antraquinónicos, glicósidos de antronas, 2.5 a 5% de senósidos A, B, C y D (Ver Fig. 5). Además aloé-emodina, reína y 2-naftalénglucósidos. La farmacopea europea Vol I. especifica que la droga debe contener no menos de un 2.5% de componentes antracénicos, calculados como senósido B. Estas drogas se utilizan como laxantes y purgantes, en forma de tisanas, polvos, extractos, sales cálcicas de los senósidos A y B cristalizadas, etc. Sin embargo se ha reportado que el uso prolongado de esta droga conlleva a arritmia cardiaca. La acción laxante de las 1,8dihidroxiantraquinonas presentes en el sen depende del número de moléculas de azúcar ligadas, siendo las agliconas prácticamente inactivas (3). Fig. 5. Estructura general de un senósido (glicosido antracénico presente en las hojas de Sen) (5)

4. Extracto de Yagé El yagé (Banisteropsis caapi ) es un arbusto o extensa liana que se encuentra en bosques tropicales. La corteza es generalmente marrón chocolate y suave. Las hojas son opuestas, de forma ovalada, verde, marginalmente enteras. El fruto es una nuez samara, 5 mm de largo. Las semillas en forma de abanico son de color verde cuando está fresco, pero se vuelven marrones con la edad . El principal metabolito que podemos encontrar en esta planta es la Harmalina, aunque también se encuentra la Harmala. No se encuentran reportes acerca de la presencia de glicosidos antracénicos en esata droga vegetal (6). PROCEDIMIENTO Tanto para el extracto de Banisteriopsis caapi como para extracto de Cassia aungustifolia se tomó 1 g de extracto y se disolvió en 10 ml de una solución agua – etanol (7:1) y se calentó a 60ºC por 10 minutos aproximadamente. Se filtro y se separo 1 ml en un tubo de ensayo, a el resto del filtrado se le adicionó 1 ml de H 2SO4 al 50% y 1 ml H 2O2 al 20% con el objetivo de que se oxidara hasta antraquinona, luego se calentó con agua hirviendo durante

10 minutos, se dejo enfriar y se trasvaso a un embudo de decantación donde se realizo la extracción con 2 porciones de 5 ml de tolueno. En la fase acuosa obtenida por el acido y el peróxido quedan azucares, compuestos mas polares, entre otros. La fase orgánica se deshidrato con sulfato de sodio anhidro y se concentro. Se realizo la prueba de reconocimiento con una solución de NaOH al 5% que contiene 2% de NH 4OH porque unos reaccionan mas fácil con uno que con otro. A el mililitro que se separó de la primera filtración se le añadió 1 ml de tolueno y se retiró la fase orgánica con una pipeta Pasteur a la cual se le realizo la prueba de reconocimiento mencionada anteriormente. Finalmente se realizó la cromatografía en capa delgada la cual primero se revelaba a luz ultravioleta y luego con KOH al 10% etanol. RESULTADOS

Tabla No. 1: Resultados de la identificacion de glicosidos antracenicos presentes en Cassia angustifolia y Banisteriopsis caapi utilizando la reacción de Borntrager-Kraus ● Tratamiento: Adición de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno, calentado enfriado y filtrado. ●

Prueba:

Tabla No. 2: Resultados de la identificación de glicosidos antracenicos presentes en Cassia angustifolia y Banisteriopsis caapi, sin tratamiento previo (Reacción con NaOH) ●

Prueba:

Fig. 6. CCD sin revelar utilizando una mezcla de tolueno-acetato de etilo-ácido acetico (75:24:1) como fase movil

Fig. 7 CCD utilizando una mezcla de tolueno-acetato de etilo-ácido acetico (75:24:1) como fase movil. Luz uv como revelador

Tabla 3. Imagenes de las CCD realizadas con los extractos obtenidos en el labortorio

ANÁLISIS DE RESULTADOS La finalidad de la realización de dos tipos de pruebas, teniendo una un tratamiento previo el cual consiste en agregar 1ml de acido sulfurico, y 1ml de peroxido de hidrogeno, y la otra solo calentamiento durante un tiempo de 30 minutos, se realiza para verificar la presencia de glicósidos antracenicos de manera oxidada, libre y purificada. En algunos tipos de plantas no existe la necesidad de realizar un tratamiento previo, esto se debe a que estos núcleos ya se encuentran libres como en el caso del rizoma de ruibarbo (7) en los que se encuentran los glucosidos en forma de antraquinona o antraglucosidos, los cuales cambian directamente de color a una tonalidad marron - rojisa al agragar NaOH. Para el caso de las hojas de sen, al realizar la prueba con NaOH el extracto pasa de una tonalidad transparente a una tonalidad rojiza oscura, debido a la concentracion de glicósidos antracenicos que aunque no se encuentran presentes como antraquinonas, si se encuentran en forma de heterosidos (senosidos). En el extracto de yagé no se encontró presencia de glicósidos antracenicos, y remitiendonos a la literatura, encontramos que la planta de yage no se caracteriza por  posee este tipo de compuestos (6), si no que presenta en su composicion una alta cantidad alcaloides (Harmala y Harmalina), por este motivo en las pruebas se obtuvieron resultados negativos, sin importar si se haya realizado un tratamiento previo ó no. Se puede verificar la presencia de glicósidos antracénicos en las muestras de Cassia angustifilia y Banisteropsis caapi , mediante una prueba de identificacion por cromatogrfia en capa delgada (CCD). En la CCD se realizo la siembra de los extractos de las muestras ( Cassia angustifolia derecha y Banisteriopsis caapi  izquierda) y se evidencia la presencia de glicósidos antracenicos en la muestra de sen, sin necesidad de revelar la placa cromatográfica con KOH (10%). Se observa una luminiscencia notable de tonalidad anaranjada Fig. 6, la cual se incrementa al realizar el revelado con KOH, esto se puede explicar debido a que la base aplicada a los compuestos antracenicos encontrados que se encuentran de manera neutra, retiran los protones de grupos hidroxilo haciendo que la estructura adopte una carga negativa, incrementando el flujo electronico debido a la resonancia tan marcada que se da en la molecula. Al pasar la placa por la luz ultravioleta, confirmamos aún más la presencia estos núcleos debido a la gran luminiscencia emitida por los glicósidos, como pódemos observar en la Fig. 7. Para la muestra de yagé se alcanza a notar una pequeña variación de tonalidad de color al revelar la placa de cromatografia, lo cual nos indica la presencia de un compuesto que, si bien puede ser un glicosido antracénico, tambien existe la probabilidad de que se trate de otro compuesto con una solubilidad similar. Al pasarlo por la luz ultravioleta se nota la presencia de este compuesto, lo cual nos indica que se pudo haber generado un error  experimental debido a que en las pruebas con NaOH no se presentaron estos compuestos, ó existe algun componente en la composicion de el yage que presenta una solubilidad similar al de los glicósidos al ser revelados con KOH. Además, se pueden reportar falsos resultados positivos con la reacción de Borntrager-Kraus, ya que la oxidación mediante H2O2 puede generar compuestos de tipo quinonicos que pueden ser observables en las placas cromatográficas.

CONCLUSIONES ● Se evidencia una alta concentracion de glicósidos antracenicos en el sen ( Cassia angustifolia ), debido a la evidente percepcion de los resultados positivos mostrados en las diferentes pruebas de deteccion. ● Banisteriopsis caapi , evidencia la ausencia de glicósidos antracenicos debido a que no se observo una tonalidad rojiza en las pruebas realizadas, aunque se evidencia la presencia de algun compuesto en la cromatografia por capa delgada, por lo cual quedamos al pendiente de nuevos hallazgos complementarios en la literatura lo cual nos permita concluir si se llego a un error experimental. ● Si bien la reacción de Borntrager-Kraus promueve la deteccion de compuestos quinonicos, se pueden encontrar falsos resultados positivos ya que mediante la oxidación de compuestos, se pueden generar otros que, estructuralmente, se asemejen a uno de tipo quinonico. BIBLIOGRAFIA (1) Universidad Nacional de Colombia, Departamento de Farmacia, Guías de laboratorio practicas de farmacognosia y fitoquímica Pag. 28 - 30

(2) Antraceno. Hidrocarburos aromáticos. Disponible en http://agrega.juntadeandalucia.es/repositorio/24042011/9c/es-an_2011042413_9223157/OD E-2c200a86-c8da-3220-93b7-a001b76deef6/4_hidrocarburos_aromticos.html  Junio de 2015 (3) Martinez, A. Quinoncas y compuestos relacionados. Universidad de Antioquia. Medellin, Noviembre de 2012. Disponible en http://farmacia.udea.edu.co/~ff/quinonas.pdf   Junio de 2015 (4) Borntrager reaction. Pharmacognosy-practical training. Disponible en http://www.fpharm.uniba.sk/fileadmin/user_upload/english/Department_selection/Department_of_Pharm acognosy_and_Botany/Practice/Pharmacognosy_1/Practice_No_2.doc. Junio de 2015

(5) Senósidos. Glicosidos antracénicos. Disponible en http://www.ehu.eus/biomoleculas/hc/sugar33c3.htm  Junio de 2015 (6) Banisteriopsis Caapi. National Tropical Botanical Garden. Disponible en http://ntbg.org/plants/plant_details.php?plantid=1447 Junio de 2015 (7) Ruibarbo. Disponible en

http://www.labnaturfar.com/naturopatias_ruibarbo_100_10_3.html Junio de 2015