Practica 5 .1

CULTIVO DE LINFOCITOS SIEMBRA • RPMI 1640 + A/B + Suero fetal bovino al (5-10%)+ Fitohemaglutinina • 10-20 gotas de sangre heparinizada • Incubar durante 72 horas EXTRACCIÓN DE CROMOSOMAS • Sacar el cultivo y colocar Colcemid • Centrifugar y decantar el sobrenadante • Agregar Solución Hipotonoca de KCl al 0.075M • Colocar 1 cm de Fijador Carnoy y llevar a la nevera por 20 minutos • Centrifugar y colocar Carnoy - llevar a la nevera • Repetir los lavados por tres veces • Realizar los extendidos por goteo OBJETIVOS  Conocer las metodologías citogenéticas linfocitos para obtención de cromosomas.

relacionadas con las técnicas de cultivo de

 Identificar las diferentes técnicas bandeo cromosómico utilizadas en el laboratorio de

Citogenética. INFORME DE PRÁCTICA N° 5 •

Cuál es la función de las siguientes sustancias en el cultivo de linfocitos:

1. Suero fetalbovino El papel de suero, especialmente fetal bovino en el establecimiento y mantenimiento de líneas y cultivos celulares, es fundamental; cuando estos se han establecido en medios libres de suero, el crecimiento celular requiere, la suplementación con hormonas y otros factores de crecimiento que están involucradas en transporte de nutrientes, mantenimiento de balance de energía celular, control de síntesis de macromoléculas y factores que estimulan la formación del producto deseado. Muchos de los factores suplementados son purificados del mismo suero, lo cual hace que cultivos a gran escala con medio libre de suero no sean rentables. 2. Fitohemaglutinina Dadas las propiedades de aglutinar células sanguíneas, la PHA se utilizó inicialmente como medio para separarlas de la sangre total. Al demostrarse posteriormente el efecto mitogénico, el espectro de aplicaciones se incrementó y actualmente se usa como factor estimulante de la proliferación en cultivos de diferentes estirpes celulares, incluidos los linfocitos; en los que también actúa sobre los procesos bioquímicos relacionados con la respuesta inmune. Otras aplicaciones incluyen el estudio in vitro de los mecanismos bioquímicos de la apoptosis y de la proliferación celular en linfocitos. Todas estas aplicaciones se basan esencialmente en la propiedad de combinarse específicamente con determinados sacáridos. 3. Colquicina/colcemid

El colcemid es un análogo sintético de la colchicina, sumamente activo. Colcemid se añade tras el cultivo celular para la inhibición de mitosis y parada en metafase por degradación de los microtúbulos esenciales para el correcto proceso mitótico. Una vez que el cultivo ha alcanzado el crecimiento adecuado, se detiene el ciclo celular en metafase al impedir la formación del huso mitótico con la adición de colchicina. 4. Solución hipotonica KCl 0.075 M Esta solución hipotónica (concentración de Na menor que la intracelular) ocasiona un arrastre de agua a traves de la membrana celular hacia el citoplasma, entonces la célula se hincha y los cromosomas se dispersan. La precisión en la preparación y el tiempo de tratamiento hipotónico son fundamentales para la obtención de metafases óptimas para su estudio: abiertas, fáciles de contar y con bajo número de cromosomas sobrepuestos. Errores en estos pasos, ocasionan rupturas celulares si la concentración de sales es extremadamente baja o el tiempo de tratamiento prolongado; o metafases completamente cerradas, inadecuadas para el estudio, si la concentración de sales es cercana a la isotonia. 5. Carnoy Un fijador modifica una celula mediante la estabilización de las proteínas de modo que la hace resistente a los cambios posteriores. Carnoy es un fijador tipo coagulante que transforma las proteínas en estructuras insolubles mantienendo la morfología de las estructuras celulares a nivel de microscopía de luz. 6. Glutamina La glutamina (abreviada Gln o Q) es uno de los 20 aminoácidos más comunes empleados en la codificación del código genético; es una cadena lateral de una amida del ácido glutámico, formada mediante el reemplazo del hidroxilo del ácido glutámico con un grupo funcional amina. Su función es sintetizar proteínas, aumentar el nitrógeno de la sangre, aumentar el ATP (Adenosina Trifosfato) y mejora el sistema inmune. Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Asimismo se suplementa con otros aminoácidos, pues los requerimientos pueden variar de una célula a otra. Un suplemento común es el de glutamina, a 2 mM final, aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100x) que se mantiene congelado, no más de 1 semana antes de añadir el medio al cultivo (conservando a 4º C). •

Mencione 5 ejemplos de medios de cultivo celular y diga qué tipo de células se pueden cultivar para obtener cromosomas y diga cuál es su utilidad.

Medio de cultivo RPMI 1640 El medio Roswell Park Memorial Institute, comúnmente conocida como RPMI, es una forma de instrumento utilizado en el cultivo de células y cultivo de tejidos. Tradicionalmente se ha utilizado para el crecimiento de células humanas linfoide. Este medio contiene una gran cantidad de fosfato y está formulado para su uso en una atmósfera de dióxido de carbono 5%. Hay una variedad de medios similares en la serie de RPMI, como RPMI 1640. RPMI-1640 es un medio de cultivo que fue desarrollado por Moore et al. en el Roswell Park Memorial Institute, de ahí el acrónimo RPMI. La formulación se basa en el medio RPMI-1630 que

utiliza un sistema amortiguador de bicarbonato y variaciones en las cantidades de aminoácidos y vitaminas. Es un medio que ha sido usado para el cultivo de leucocitos humanos normales y neoplásicas, y ha demostrado una amplia aplicabilidad para apoyar el crecimiento de muchos tipos de células en cultivo, incluyendo frescos linfocitos humanos. • Que son los intercambios de cromatides hermanas y cuál es su importancia clínica • Que es la fragilidad cromosómica y cuál es la importancia clínica • Que es el X frágil Es el síndrome del X frágil, también conocido como síndrome de Martin-Bell. Síndrome genético causante de la deficiencia mental hereditaria más frecuente; pudiendo ser éste desde moderado a severo y que afecta principalmente a varones, quienes manifiestan un fenotipo característico. Su nombre se debe a la presencia de una "rotura" en el extremo distal del cromosoma X (Xq27.3) en el cariotipo de los individuos afectados. En 1991, se identificó el defecto molecular causante del síndrome, sustituyendo al estudio citogenético como método de confirmación diagnóstica. • Que son las bandas de alta resolución y como se obtienen

Este tipo de bandas se obtienen con técnicas de bandeo G o R en etapas más precoces de la mitosis( profase o prometafase), cuando los cromosomas todavía están en un estado relativamente descondensado. Las bandas de alta resolución son especialmente útiles cuando se sospecha que existe una pequeña anomalía estructural en un cromosoma. El bandeo típico suele oscilar entre 400 – 500 bases por cariotipo, mediante el uso de las técnicas anteriores. En ocasiones puede ser necesario llegar a obtener más bandas, una mayor resolución. Mediante las técnicas que se listarán ahora, se puede llegar a conseguir una resolución de 800 – 1000 bandas. Se puede hacer con Giensa, siempre y cuando los cromosomas estén menos condensados. Se suelen emplear cromosomas profásicos o en fases tempranas de la metafase. Se deberán sincronizar todas las divisiones, mediante un antagonista del ácido fólico que bloquee la división. Se provoca entonces la división, a la vez que se da un tratamiento corto con colcemil, que es un inhibidor de la división.Existe una terminología internacionalmente establecida para nombrar las bandas. Lanumeración va de proximal a distal, en cada brazo. Dentro de cada banda se pueden detectar en ocasiones otras bandas, de manera que una banda puede ser identificada como: 5p 12.10.Existen algunas anomalías que se pueden detectar mediante el bandeo, como puede ser el síndrome del X frágil, que es la causa principal del retraso mental en varones humanos. Para detectarlo se hace un cultivo en medio con timidina y la tinción con Giensa. En las bandas G se usan colorantes que se unen a regiones ricas en AT, que contengan entre un55 – 60%. Se usan colorantes como Giensa o Quinacrina. Las bandas R se detectan mediante colorantes que se unen a GC, en regiones que contengan entre 50 – 60%. Las diferencias en los porcentajes de bases no serán suficientes para explicar las diferencias. Existen autores que han propuesto un modelo que postula que las diferencias se deberán posiblemente a diferencias estructurales. Se cree que algunas proteínas podrían unirse a regiones específicas del DNA. • Defina euploidia y aneuploidía y dé 3 ejemplos. Euploidia: Significa que las células poseen juegos completos de cromosomas; lo normal en la especie humana es que haya 2 juegos completos (2 x 23 = 46), pero a veces hay 3 e incluso 4 juegos (triploidía, tetraploidía) incompatibles con la vida. Es el estado celular en el cual la célula tiene uno o más juegos completos de cromosomas (dotaciones monoploides (x)) de su especie; dependiendo de especies, se excluyen los cromosomas sexuales.

Ejemplos: 1. 28,XY, +5,+6,-21,-12,+18 2. 98,XXY,+5,+8+12-18+20 3. 79,+6+8+10-15 Aneuploidía: Hace referencia a cambios en el número de cromosomas, que pueden dar lugar a enfermedades genéticas. Un aneuploide es un individuo cuyo número de cromosomas difiere del tipo salvaje en parte de su dotación cromosómica, debido a un cromosoma extra o ausente, que siempre se asocia con una deficiencia en

el desarrollo físico, mental o ambos. Es lo opuesto: en el juego de cromosomas aparece uno o más cromosomas concretos como copias extra, o bien falta alguna copia. La trisomía significa que hay 3 copias de un cromosoma concreto en las células que, por lo que se refiere a los demás cromosomas, es diploide.

Ejemplos:

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1. 49,XY,+2,+3,+15,-16,+18,-19 2. 46,Y, +4,-11,+21 3. 48,XYY,+2-15 Explique tres mecanismos por los cuales se pueden producir trisomías y monosomías en un individuo. Realice una representación gráfica de las siguientes alteraciones estructurales Isocromosomas: Es un cromosoma anormal en el que se ha perdido un brazo y el otro se ha duplicado de manera especular, dando lugar a una monosomía parcial debido al brazo perdido, y a una trisomía parcial, debido al brazo duplicado.

Dicentricos:

Duplicaciones:

Inserciones:

Anillos

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