Practica #4

 

PRACTICA N° 4 COLORACIONES ESPECIALES INTRODUCCION: Las observaciones más detalladas de las estructuras de los microorganismos, tales como las Endosporas, capsulas, flagelos y corpúsculos meta cromáticos, requieren de métodos especiales en la utilización de tintes básicos. COLORACION DE ENDOSPORAS. - Las - Las endosporas se observan fácilmente al microscopio de luz, como cuerpos fuertemente retractiles y como son muy impermeables a los colorantes, requieren de un procedimiento especial. Los colorantes sencillos no penetran la pared de la espora y por ello la célula con su endospora contiene un cuerpo oval o esférico incoloro cuando se coloca brevemente con cristal violeta o azul de metileno. Las endosporas pueden ser teñidas por un procedimiento energético en el que se permite que los colorantes fuertes se pongan en contacto con las células durante cierto tiempo, o se facilita la coloración co loración por aplicación del color. COLORACION DE CAPSULAS. - Las capsulas son estructuras de ciertas especies bacterianas que se forman a partir de la pared celular. Dada su naturaleza química (de preferencia complejos carbohidratos extracelulares) ofrecen consistencia gelatinosa, por lo que tampoco son fáciles de teñir. COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS. -  -  Muchas bacterias acumulan en sus protoplasmas grandes reservas de fosfato inorgánico insoluble en agua en forma de gránulos de poli fosfatos. Con colorante de azul de toluidina u otros tintes azules, se tornan de color violáceo vio láceo o ligeramente rojo violáceo; de ahí el nombre de metacromasis (cambio de color) y los gránulos que se tiñen de esta manera, se denominan gránulos meta cromáticos. Este granulo de poli fosfato también se le denomina VOLUTINA. OBJETVOS:   OBJETVOS:

  Ensayo de las técnicas de coloración para endosporas, capsulas y corpúsculos meta

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cromáticos.

  Evidenciar las diferentes estructuras microbianas mediante coloraciones específicas.

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PROCEDIMIENTO: 1.-Coloracion 1.-Coloracio n en endosporas: Método de Wirtz- Conklin

  A partir de un cultivo de Bacillus, extender la muestra con el asa de siembra, sobre la

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lámina portaobjetos.

  Fijar la muestra el calor y cubrir con verde de malaquita. Esperar que caliente hasta la

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aparición de vapores por 5 minutos.

       

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Lavar con agua corriente

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Contrastar con safranina o con fucsina básica por 1 minuto.

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Lavar con agua corriente.

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Secar y observar con el lente de inmersión.

Resultados: Se deberá observar a las esporas de color verde y al resto del cuerpo bacteriano Resultados: Se de color rojo. Se determinará la posición de la espora dentro de la célula bacteriana, puede ser terminal, sub terminal o central, dependiendo de la especie.

 

 

Observación 1.- ¿A qué se debe la resistencia térmica de la endospora? La resistencia térmica de la endosporas se debe al bajo contenido en agua y la presencia de gran cantidad de una sustancia que se halla solo en las esporas, el dipicolinato cálcico. La resistencia a los agentes químicos y, en cierto grado, a la radiación es proporcionada por ciertas capas muy duras que rodean la espora. Estas incluyen la membrana de la espora equivalente a la antigua membrana celular, una gruesa corteza compuesta de un tipo de peptidoglucano especial, una cubierta formada de una proteína estructural insoluble, similar a la queratina y rica en cisteína, c isteína, y, finalmente, una capa externa de lipoproteína e hidratado de carbono denominado exosporio. 2.- ¿Qué importancia tienen las endosporas? Uno seria Por la termorresistencia que tienen las endósporas se se ha utilizado como modelo para muchos estudios. También la endospora es un modelo simplificado para la diferenciación celular, los detalles de la endóspora se han estudiado extensivamente, especialmente el bacilo subtilis. Estos estudios han contribuido al estudio de los genes, transcripción y unidades del factor sigma de la polimerasa del ARN. del ARN.   endosporas?   3.- ¿Explicar cómo pueden ser destruidas las endosporas?

 Aunque son resistentes al calor y a la radiación extremos, las endosporas endosporas pueden ser destruidas mediante estos tratamientos. Así, la exposición al calor extremo por periodos grandes de tiempo así como la exposición prolongada a la radiación, (radiografías o rayos gamma rayos  gamma por ejemplo), matarán a la mayoría de endosporas. 2. Coloración de capsulas: Método de Hiss

  La muestra de saliva o esputo de persona resfriada, proceder a extender igual que para

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la coloración de bacterias acido-resistentes, y fijar a la llama.

  Colorear con fucsina básica o con safranina, con suaves calentamientos hasta la salida

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de vapores blancos durante 1 minuto.

  Lavar con solución de sulfato de cobre al 20% a chorro continuo.   Secar y observar al microscopio.

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3. Coloración de capsulas: Método de la tinta china

  Sin fijar el frotis, se cubre con fucsina diluida durante dos minutos   Lavar con agua destilada y secar al aire.

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  Se colocan en un extremo del porta objeto dos gotas de nigrosina o de tinta china y se

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hace una extensión por el método de los dos portaobjetos. Se deja secar y se observa al microscopio con objetivo de inmersión. Resultados: En el primer caso se observaran diplococos con una capsula de color azul suave y las células acompañantes de color violeta o rosado (dependiendo del colorante utilizado). Y en la segunda técnica, el fondo aparecerá negro, las bacterias teñidas de rojo y la capsula como un halo blanco que las envuelve.

Observación 1.- ¿En qué consiste una tinción positiva?

2.- ¿En qué consiste una tinción negativa? Pone de manifiesto las cápsulas y no tiñe los microorganismos. Tiñe el fondo de color negruzco y permite ver los microorganismos sin colorear sobre dicho fondo. De este modo genera el contraste suficiente como para permitir su visualización al microscopio. 3.- ¿Todas las bacterias tienen la capacidad de formar capsulas? La pueden producir y formar formar tanto tanto bacterias gram positivas como gran negativas.La gran mayoria son polisacaridicas. c. coloración de corpúsculos meta cromáticos

  Extender la muestra de saliva con sarro dentario sobre la lámina portaobjetos y fijar la

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muestra al calor. Colorear con Azul de Metileno por 5 minutos. Lavar con agua corriente. Secar y observar.

Resultados: Se Resultados:  Se observaran a los bacilos largos y ligeramente gruesos de color azul claro.

 

 

Observación Indique la importancia de las inclusiones citoplasmáticas citoplasmáticas microbianas.

CUESTIONARIO: 1. Haga la estructura de una endospora

2. Indique los géneros bacterianos más importantes que producen endosporas. Las especies de Bacillus y las especies de Clostridium. 3. ¿Qué diferencia existe entre una endospora bacteriana y las esporas de otros organismos? Las Esporas de las BACTERIAS solo cumplen la l a función de defensa, es decir sobrevivir cuando el ambiente se torna desfavorable. En cambio, las Esporas de los HONGOS, HONGOS , cumplen funciones de Reproducción.

 

4.-indique las funciones de las capsulas c apsulas en la naturaleza. La capsula de las bacterias está formada por polímeros glúcidos sin una estructura definida.

  Es capaz de retener agua, actuando como fuente de reserva de agua para la propia

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célula. Además, actúa como medio de desplazamiento de las células que cuentan con esta estructura, ya que no disponen de flagelos.

  También funciona como matriz adherente entre bacterias, aunque no llega a formar

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colonias. Además de todo esto también la capsula de la bacteria actúa como medio de defensa impidiendo la acción fagocitico de otras células. Fija la bacteria patógena a su huésped. Protege a la bacteria de la desecación del medio. Regula los procesos de intercambio de agua y nutrientes, además de servir como almacén de nutrientes.

c oloración de esporas. 5.-Mencionar otros métodos de coloración

  La tinción de esporas de WIRTZ-CONKLIN

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características de los géneros Bacillus y clostridium 6.-Mencionar las principales características clostridium..   GENERO BACILLUS CARACTERISTICAS

  Bacilos gram positivos esporulados.   Familia Bacillaceae. 70 especies aerobios o anaerobios facultativos   Especies más importantes:

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B. anthracis: carbunco B. cereus: intoxicaciones alimentarias Dosis media letal con 2500 a 55000 esporas, no hay transmisión de persona a persona. Vía de inhalación es la más probable

GENERO CLOSTRIDIUM CARACTERISTICAS

  se han descrito más de 200 especies.   Los clostridios causan diversas e importantes enfermedades mediadas por toxina,

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incluidas tétanos (Clostridium tetani), botulismo (Clostridium botulinum), gangrena gaseosa (Clostridium perfringens) y diarrea vinculada con antibióticos y colitis seudomembranosa (Clostridium difficile).  difficile).  También se conocen otros clostridios en las infecciones anaerobias mixtas que afectan al ser humano.  humano.