Practica 4

Practica 4: Método directo de determinación de microorganismos aerobios mesófilos viables

INTEGRANTES

Burgos Tuñoque Stefany Diez Vazquez Sindy Farro Barbarán Rocio Gutierrez Armijos Leydi Lopez Ramirez Kelly

I.

Introducción

En diversos estudios microbiológicos (como análisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacéuticos o del medioambiente entre otros), se requiere conocer el número de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias El crecimiento de poblaciones microbianas  puede determinarse mediante métodos de medida de la masa total celular, que generalmente es directamente proporcional al número de células, (métodos de determinación del peso, de la actividad del cultivo o métodos turbidimétricos) o por la determinación del número de células.

Son cuatro los métodos básicos utilizados para investigar el número “total” de microorganismos: 1. Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables (entre las que se encuentran el método de la placa vertida, el de superficie y el de goteo). 2. Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables. 3. Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora. 4. Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para lasno viables. El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número decélulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en función de uno de los siguientes factores:  Método de muestreo utilizado  Distribución de los microorganismos en la muestra   Naturaleza de la micro flora del alimento   Naturaleza del alimento  Antecedentes del alimento  Adecuación nutricional del medio de cultivo  Temperatura y medio de incubación   pH, aw, potencial de óxido  –  reducción del medio  Tipo de diluyente utilizado   Número relativo de microorganismos en la muestra

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no  puedenconsiderarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación. El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de 34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos a) Los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura cuya temperatura: psicrótofos  b) Los que crecen entre 20  –   30º C, con una temperatura óptima de crecimiento está entre 30 –  40º C: mesófilos c) Los que crecen por encima de los 45º C: termófilos En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presenciade flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar:  Excesiva contaminación de la materia prima  Deficiente manipulación durante el proceso de ela boración  La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos  La inmediata alteración del producto El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

II.  

III.

Objetivos Conocer los métodos para determinar el número de microorganismos viables Realizar un recuento de bacterias mesófilas viables en los alimentos como unindicador microbiano de la calidad del alimento.

Materiales



Muestra biológica: Leche de soja



Medio de cultivo: Agar PlateCount: A. recuento en placa



Placas Petri



Diluyente: agua peptonada al 0.1%



Pipetas



Tubos de dilución

IV. Procedimiento a. Para la dilución (en agua peptonada al 0,1%) 



Se deben hacer 6 diluciones, pero para efectos de la práctica solo se realizaran 3 (10-1, 10-2 y 10-3) de las que se tomara 1ml para las placas de siembra en  profundidad, 0.1ml para siembra en superficie y 0.02ml para la siembra por goteo Para la dilución se emplean 10 o 100ml de muestra más 90 o 900ml de diluyente respectivamente; para efectos de la práctica las dilución se hicieron con 27ml de diluyente y 3ml de muestra

b. Método de siembra en profundidad 







 

Prepararla muestra de alimento, si este es líquido hay que homogenizar, si es sólido hay que licuar o triturar la muestra debe estar en un frasco estéril se realizan 3 diluciones (2 placas petri por dilución), en cada placa colocar 1ml de la dilución, luego agregar medio de cultivo (agar PlateCound de 10-15ml) Luego mezclamos, la mezcla se realiza haciendo rotar la placa (5 veces sentido horario, 5 veces de abajo arriba, 5 veces anti horario y 5 veces derecha e izquierda). Luego esperamos que solidifique el medio y luego incubamos a 30ºC por 24- 48 horas (dejamos una placa control). Realizamos las lecturas a las 24 y 48 h. Para el recuento de las colonias(a las 24 y 48 horas) se debe elegir placas que tengan de 30 a 300 colonias.

c. Método de superficie 





se utiliza una placa para cada dilución (son 3 diluciones), se controla en estufa antes de servir el medio Servir 0.1 ml de cada dilución en la superficie de la placa y luego se la expandir usando la espátula de Drigalsky. Incubar a 30 ºC x 24 y 48 horas. Conteo y aumentar una cifra

d. Método por goteo  

 



V.

Se utiliza una placa por dilución, delimitada en 2 partes. colocar gotas de la dilución correspondiente en cada lado de la placa (0.02 ml de gota). Resultados contar entre 30 –  300 colonias. Si una dilución 10-2 = 68 colonias los multiplicamos por 102 y por 50 y el resultado lo igualamos a UFC/ml Luego llevar a incubar

Fundamento teórico

Siembra Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:  Que se efectúen asépticamente  Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados  Que se realicen solo los manipuleos indispensables  Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

VI.

RESULTADOS

A. Recuento estándar en placa  Elegir las placas que tengan entre 30 y 300 colonias.  Contar utilizando un contador de colonias.  Contar las colonias de cada placa teniendo en cuenta la dilución. Si la 1° dilución tiene más de 300 colonias se desecha.  Tomar la media aritmética de las dos placas de cada dilución.  Si hay dos diluciones entre el rango Se cuenta por separado l as colonias.  Luego dividimos la dilución más alta entre las más baja.  Si el resultado es mayor que 2 se coge las UFC de la última dilución.  Si el resultado es menor que 2 se coge las UFC de la mayor dilución.

B. Recuento Estimado  Si todas las diluciones tienen más de 300 colonias se realiza un estimado

(una aproximación) dividiendo en cuadrantes la placa, escogiendo 2 o más de ellos, se saca el promedio, y finalmente se multiplica por el número total de cuadrantes divididos.  Finalmente para hallar el número de aerobios mesofilos viables, se aplica la fórmula:

Recuento = N° de Colonias / Dilución x inoculo

2

 Solo se informan las 2 primeras cifras Ej.: 1200 = 12 x 10 .  El resultado se expresa como

UFC/ml. o gr.

Recuento Método de Profundidad

-2

-1

1 LECTURA 24 HORAS 1010-1 10-

-3

10

10

926

685

464 204

10 2 LECTURA 48 HORAS 640

800

960 213

448

517

10-2 1010-

224

575

198

193

384

188

 Utilizamos el

352

320

Recuento estándar , por lo tanto escogemos las diluciones con

lectura de 24h por tener menos de 300 colonias.

1.10

10-2/10-3 = 213/193 =

22 x 10 3 ufc/

: 213 x 10 2 x 1 = * Por l o tanto 

1. Recuento Método de Superficie

10

10

1 LECTURA 24 HORAS

2 LECTURA 48 HORAS

300

896

180

384

64

264

10-1 10-2 10-3  Utilizando el

-3

10

-2

-1

Recuento estándar , escogemos las diluciones con lectura de 24h

 por tener menos de 300 colonias. 10-2/10-3 = 180/64 = o

2.81

3 : 64x 10  x 10 = Por lo tanto 

64 x 10 ufc/ mL

2. Recuento Método de Goteo

-2

10

-3

10

1 LECTURA 24 HORAS

2 LECTURA 48 HORAS

8

10

4

6

10-2 10-3  Utilizando un

Recuento estándar , escogemos las diluciones con lectura de menos de 300 colonias. Podemos utilizar cualquiera de las diluciones obtenidas.

10-2/10-3 = 8/2 =

2.00 2 x 10 ufc/ mL

: 4 x 103 x 50 = * Por l o tanto 

 Según

la

NORMA

202.0012003.determina

TÉCNICA

PERUANANTP

como límite máximo permisible para estos

productos el valor de 105 UFC/ml. De los valores obtenidos en los 3 métodos aplicados en la práctica, solo el método por goteo sobrepasa los valores permisibles, pero los otros 2 métodos utilizados se encuentran dentro de los valores permisibles, por lo tanto

se puede decir que la muestra tiene una regular

calidad

microbiológica. Para descartar se puede repetir la práctica, para una mayor seguridad. 

A lo anterior se debe agregar que los valores fueron calculados por aproximación ya que no se trabajó con más diluciones.  Al término de la práctica se ha podido determinar que el alimento empleado, en nuestro caso LECHE DE SOYA, es regular calidad debido al cierto crecimiento excesivo de colonias que presento en el método por goteo.

VII.

CONCLUSIONES  Se logró determinar el número de bacterias aerobias mesófilas viables a

través de los 3 métodos trabajados en práctica. Se pudo determinar el número de microorganismo presentes en la muestra de mayonesa casera

VIII. CUESTIONARIO 1. ¿Qué otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar análisis microbiológicos en alimentos? Además del Agua Peptona Tamponada (BPW), que es útil en diluir muestras de alimentos permitiendo mantener sus características sin alterar la muestra; es muy común el uso de diluyente Agua de Triptona (Trytone Water: TW) y la solución Ringer ¼, cuyas composiciones son las siguientes:

Agua Triptona

Solución Ringer ¼

Triptona

10 g

Cloruro sódico

2.250 g

Cloruro de sodio

5g

Cloruro cálcico

Agua destilada

1000 ml

Agua Peptona Tamponada 10 g

0.120 g

Peptona de carne Cloruro sódico

Bicarbonato sódico

0.050 g

Fosfato sódico

3.5 g

Cloruro potásico Agua destilada

0.105

Fosfato potásico Agua destilada

1.5 g

1000 ml

5g

1000 ml

Solución Ringer ¼: Es una solución electrolítica balanceada en la que parte del sodio de la solución salina isotónica es sustituida por calcio y potasio. Es un medio isotónico más equilibrado que la simple solución salina de cloruro sódico y su composición  permite su esterilización al autoclave sin que se formen precipitados. Se utiliza rutinariamente, en los estudios sobre bacterias, a una disolución ¼ para obtener suspensiones celulares o para hacer un banco de soluciones. Al proporcionar una  presión osmótica similar a la que tiene en su interior la célula bacteriana, permite mantener las bacterias durante un cierto tiempo sin que éstas se destruyan.

Agua Triptona: Su base nutritiva permite el desarrollo de diversas especies bacterianas. La triptona presenta alto contenido en triptófano, el cual es el sustrato utilizado por los microorganismos para la producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

Agua Peptonada Tamponada: Es un medio utilizado como diluyente y para el pre-enriquecimiento de microorganismos a partir de diferentes muestras. Es ampliamente utilizado en los protocolos de control higiénico de alimentos para la búsqueda de Salmonella spp. El Agua Peptonada Bufferada mantiene un pH alto durante el período de  pre-enriquecimiento y anula los efectos del daño celular que pueden ocurrir a pH ácido. Esto es particularmente importante en las muestras de vegetales que

tienen una baja capacidad reguladora. También puede ser utilizado para evaluar alimentos de aves de corral. En el medio de cultivo, la peptona es la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales. El cloruro de sodio mantiene el  balance osmótico y los fosfatos forman un sistema buffer que regulan el pH del medio. También se podría utilizar Solución Salina Fisiológica (SSF)  como diluyente, que como su nombre lo dice sirve para mantener viables las muestras de contenidos fisiológicos tales como secreciones. Además sirve para diluir muestras fisiológicas. Sólo contiene 0.9 g de Cloruro sódico y 1000 ml de Agua Destilada.

2. ¿En una preparación de dilución como se prepara 10 0? Una dilución 100 es muy utilizada para nombrar la primera dilución preparada a  partir de una muestra líquida de la cual se obtendrán diluciones decimales sucesivas, no se considera una dilución 10-1 debido a que en esta dilución busca diluir una muestra sólida para su homogenización.

3. Ventajas y desventajas de cada técnica de siembra. 

Recuento en Placa por M é todo de Siembr a en Pr ofun didad: 

Ventajas: -



Es el mejor método para el desarrollo de microaerófilos. Hay un mayor aprovechamiento de nutrientes. Mayor cantidad de la muestra. Menor error. Facilita el aislamiento de algunas especies características como Clostridium.

Desventajas: - La temperatura del agar puede afectar a algunos microorganismos sensibles al calor. - Hay dificultades al subcultivar colonias. - Si no se emplea el medio translucido la visualización de colonias se ve afectada.



Recuento en Pl aca por M é todo de Siembra en Superf icie: 

Ventajas: - Permite un fácil estudio de las diferentes colonias tanto en su morfología como en su recuento.

- Hay facilidad para realizar el subcultivo de colonias. -  No es necesario que el medio sea claro o traslucido.



Desventajas: - Debido al pequeño volumen de muestra utilizada el alimento suspendido puede interferir como nutriente o ejerciendo efecto inhibitorio sobre los microorganismos.



Recuento en Pl aca por M é todo de Siembra en Goteo: 

Ventajas: - Es fácil de realizar el estudio morfológico y la caracterización de los diversos tipos de colonias. - Se comprueba fácilmente con exactitud del sistema de

dilución.

- Los microorganismos son inactivos por el calor. -  No es necesario que el medio sea traslucido.



Desventajas: - Debido al pequeño volumen de muestra utilizada el alimento suspendido puede interferir como nutriente o ejerciendo efecto inhibitorio sobre los microorganismos. - Solo da buenos resultados en muestras demasiado contaminadas

IX.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

 Adams M. R. y M. O. Moss ;

1995; “Microbiología de los Alimentos”; Editorial

Acribia; Zaragoza; España; Pág. 388 –  391. 

Doyle B.; 1997; “Microbiología de los Alimentos”; Editorial Acribia; Zaragoza; España.



FRAZIER W.C, WESTHOFF D.C. “MICROBIOLOGÍA ALIMENTOS”. 4ta Edit. Acr ibia, S.A. Zaragoza, España.1993.

DE

LOS



Harrigan B. W.; 1995; “Métodos de Laboratorio en Microbiología de los Alimentos y Productos Lácteos”; 3 ra edición; Editorial Acribia; Zaragoza, España.